Summary
Virale vektorer tillate målrettet genmanipulering. Vi viser en fremgangsmåte for betinget genekspresjon eller ablasjon i mus ryggmargen ved hjelp stereotaksiske injeksjon av en viral vektor i dorsal horn, en fremtredende område av synaptiske kontakt mellom primære somatosensoriske afferenter og nevroner i sentralnervesystemet.
Abstract
Intraparenchymal injeksjon av en viral vektor gjør betinget genmanipulering i forskjellige populasjoner av nerveceller eller bestemte regioner i det sentrale nervesystemet. Vi viser en stereotaksiske injeksjonsteknikk som muliggjør en målrettet genuttrykk eller stanse i dorsalhornet av musen ryggmargen. Den kirurgiske prosedyren er kort. Det krever laminektomi av en enkelt vertebra, sørger for rask gjenoppretting av dyret og usvekket motilitet av ryggraden. Kontrollert injeksjon av en liten vektor suspensjon volum ved lav hastighet og bruk av en mikrosprøyte med fasettglass kanyle minimere vevet lesjonen. Den lokale immunrespons til vektoren avhenger av de iboende egenskapene til viruset benyttes, i vår erfaring, er det mindre og kortvarige når en rekombinant adeno-assosiert virus er brukt. Et rapportørgen som forbedret grønt fluorescerende protein forenkler overvåking romlige fordelingen av vektoren, og effekt og cellulære specificity av transfeksjon.
Introduction
Avansert teknologi for betinget genmanipulering i musen gjør mangefasetterte tilnærminger til utforskning av synaptiske trasé og funksjonelle forbindelser i det sentrale nervesystemet. Transgener, kan reguleres ved små-molekyl effektorer som doksycyklin virker på en tetracyklin-kontrollert transactivator, som kan være konstruert for å fungere som et repressor eller en aktivator av gentranskripsjon, eller tamoxifen gjenkjenne en mutert ligand-bindende domene av østrogen reseptor 1 . Irreversible transgenet modifikasjon er ofte oppnådd ved deoksyribonukleinsyre (DNA) recombinases. CRE (årsaker rekombinasjon) og Flp (flippase rekombinasjon enzym) katalysere excision, inversjon eller translokasjon av DNA-fragmenter som er flankert av loxP (locus of krysset x over, P1) eller Frt (flippase anerkjennelse target) områder, henholdsvis 1. Bruksområder omfatter genaktivering eller taushet induserbar ribonukleinsyre (RNA) interferens
4. Høy kapasitet (gutless) adenovirus, adeno-assosiert virus, herpes simplex virus og lentivirus blir ofte brukt neurotropisk vektorer. Velge riktig virus for en problemstilling er en viktig del av den eksperimentelle design. Størrelsen av transgenet, produksjonstid rute, spesifisitet av smitte til nevroner i motsetning til gliaceller, infeksjon effekt, inflammatoriske og giftig bivirkninger må vurderes 4.
Her beskriver vi stereotaksiske injeksjon av en viral vektor i dorsal horn av ryggmargen, en teknikk som vi bruker for betinget genregulering i vår forskning på nevrobiologi av smerte. Dorsalhornet mottar afferent input fra primære somatosensoriske nevroner inkludert nociceptive nerveceller. Lokale interneurons behandler informasjonen før projeksjon nevroner formidle det fradorsalhornet til hjernen 5. Vi viser smitte av dorsal horn nevroner på spinal segmentell nivå L4 med en neurotropisk rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGfp) under en konstitutivt aktiv cytomegalovirus promoter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den kirurgiske prosedyren beskrevet har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité (IACUC) ved Columbia University.
1. Forberedelse av utstyr og viruspartikkel Suspension
- Rengjøre og desinfisere utstyret, sterilisere kirurgiske instrumenter og V hakk spikes som skal brukes til å fikse vertebra L1.
- Trekk og bevel glass pipetter. Vi bruker pipetter som har en spiss diameter på 40 um og er skrå med en vinkel på 20 °. Sterilisere glass pipetter.
- Sett opp stereotaksiske ramme, monter mikrosprøyte injektoren på manipulator og koble injektoren til kontrolleren.
- Fest en av glass pipetter til mikrosprøyte bruker kompresjonskoblingen kit.
- Fjern stempelholderen fra mikrosprøyte og fylle sprøyten med mineralolje. Olje Red O (1 - (2,5-dimetyl-4-(2,5-dimethylphenylazo) fenylazo)-2-naftol), kan bli tilsatt til mineraloljen å øke dens visibility. Sett inn stempelet og skyv den til hele veien til spissen. Nøye unngå å skape en luftboble.
- Forbered viruspartikkel suspensjon i en biosikkerhet kabinett. Tine frosne viruset på is og, like før bruk, fortynne den med steril fosfat-bufret saltoppløsning til ønsket partikkelkonsentrasjonen.
- Sett mikrosprøyte inn i holderen på injektoren.
- Pipetter 5 ul av viruset suspensjon på en liten plastduk, f.eks Parafilm. Senk glass pipettespissen i slipp og dra i stempelet for å fylle mikrosprøyte. Lag en liten luftboble i pipettespissen for å hindre den fra tilstopping.
2. Laminektomi
- Forbered kirurgi området ved å tørke benk og oppvarming pad med desinfeksjonsmiddel.
- Anesthetize musen. Vi bruker innånding anestesi med isofluran (3% under induksjon, 2% -3% under vedlikehold).
- Plasser smøremiddel på hvert øye for å beskytte øynene fra tørking underdrift.
- Barbere pelsen fra korsryggen til halsen av musen og desinfisere huden med vekslende kluter av et topisk antiseptisk eksempel klorheksidin eller povidon-jod og 70% etanol. Isolere aseptisk klargjorte stedet med kirurgisk drapere og infiltrere snittet nettsted med bupivacaine (0,25%, utvannet 1:10 med fysiologisk saltvann).
- Incise huden ved Caudal enden av brystkassen langs midtlinjen (2-3 cm) og skill fascia dekker ryggraden.
- Fordi ryggmargen slutter å vokse tidligere under postnatal utvikling enn virvelsøylen, ligger spinal segment L4 under den første lumbale vertebra (L1). Vertebra L1 ligger Caudal til vertebra som holder den siste par ribben. Identifisere og avsløre vertebra L1 ved å fjerne de små spinal muskler og leddbånd er festet til sin framsiden.
- Løft og hold vertebra L1 med en Adson tang. Bruk en dedikert laminektomi tang for å fjerne dorsal portion av vertebra (ryggraden og lamina) og utsett ryggmargen. Unngå skader på ryggmargen.
- Overfør musen på varmeplaten i stereotaksiske rammen. Overvåke temperaturen musen under etterfølgende drift.
3. Injeksjon
- Fikse vertebra L1 med V hakk pigger. Toppene må stabilisere ryggraden, slik at vertebra ikke beveger seg under pusting.
- Bringe mikrosprøyte nærmere slik at pipettespissen er over laminektomi nettstedet. Senk stempelet til du ser viruset suspensjon spennende pipetten. Fjern dråpen med en steril bomull tips.
- Plasser pipettespissen på rostral-mest delen av den eksponerte ryggmargen. Senter pipetten over bakre median sulcus, deretter flytte spissen 500 mikrometer sideveis. Senk spissen til overflaten av ledningen og punktering dura mater, eller hvis du arbeider med en unbeveled glass pipette, bruk en skrå stål kanyle å punktere dura. Senk spissen av glass pipetter 300 mikrometer i ryggmargen.
- Injiser 1 ul virus suspensjon ved en hastighet på 200 nl / min.
- På slutten av injeksjonen, vent minst 2 min før sakte trekkes pipetten.
- Gjenta trinn 3,3 til 3,5 på den caudale-mest delen av den eksponerte ryggmargen å oppnå fullstendig fordeling av viral vektor i spinal segment L4. De to injeksjonssteder befinner rostral og kaudale av L4 segmentet å unngå vevsskade i målområdet.
4. Lukking av sår
- År vertebra L1 fra V hakk klemmer og fjerne musen fra stereotaksiske rammen.
- Suture konseptet med 5,0 vicryl. Den lukkede fascia gir dekning for laminektomi nettstedet.
- Lukk huden med nylon sting eller kirurgiske stifter.
5. Postoperativ Care
- Overfør musen til en frisk bur med myk, nonparticular sengetøy. Plasser den på tHan side for komfortabel puste. Overvåke dyret før det er helt våken, ambulant og begynner å drikke.
- Vi gir postkirurgisk analgesi for 72 timer med daglig subkutane injeksjoner av karprofen (5,0 mg / kg).
- Overvåke postsurgical utvinning av daglig inspeksjon for de første 3 dager, deretter annenhver dag eller 3 dager per uke før eksperimentet er fullført.
- Fjerne huden suturer eller stifter 7 til 10 dager etter operasjonen, når sårheling er fullført.
- Avlive dyret etter gjennomføring av forsøket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykkede transfeksjon gir robust genekspresjon i nevroner av den injiserte dorsalhornet (figur 1), skåner dorsalhornet kontralaterale side, ventral horn og dorsal root ganglia.
Figur 1. Transfeksjon av dorsal horn nerveceller. (A) Uttrykk for den fluorescerende reporter eGfp (grønn) i venstre dorsal horn av L4 ryggmargen, to uker etter stereotaksiske injeksjon av rAAV-eGfp (serotype AAV2 / 8, 10 9 genom kopier / pl). Nevronene ble immunostained for neuronal kjerner protein (Neun, rød). Pil hoder velg spredt transfekterte gliacellene i dorsal kolonnen. Skala bar, 150 mikrometer. (B) Omtrent 80% av nevroner i den mediale dorsal horn ble smittet. Skala bar, 20 mikrometer. Et monoklonalt antistoff mot Neun (EMD Millipore) ble brukt ved en fortynning på 1:2,000 for farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereotaksiske vektor injeksjon tillater målretting ryggmargssegmenter nevroner for applikasjoner som neuronal nettverk kartlegging basert på transsynaptic viruset sprer 6,7 eller optogenetic disseksjon 8, axon veiledning under regenerering fra skade 9,10 eller genterapi for forebygging eller behandling av nevrodegenerasjon 11, 12. Virale vektorer har vært brukt til genmanipulering i ryggmargen for å studere somatosensoriske, motor og autonome trasé 9,10,13-15. Musen er modellen organismen mest brukte i studier med stereotaksiske injeksjon av en viral vektor inn i hjernen eller ryggmargen, men teknikken har vært ansatt hos andre arter, inkludert ikke-menneskelige primater 16.
Stereotaksiske vektor injeksjon i mus ryggmargen er trygg, den kirurgiske prosedyren beskrevet her krever én laminektomi på injeksjonsstedet slik at dyret gjenvinner uten instability i sin ryggraden bevegelser. Injeksjon og treg fjerning av kanylen er komplett innen 10 min, varer hele prosedyren inkludert hud forberedelse og lukking av sår ca 40 min. Vi tilbyr postsurgical anestesi for 72 timer med karprofen, et ikke-steroid anti-inflammatorisk smertestillende legemiddel.
For å minimere vevskader benytter vi trakk glass kanyler med en spiss diameter på 40 mikrometer. En skarp skrå kanyle tips letter innsetting i ryggmargen, som rettferdiggjør investeringen i en mikropipette jeksel. Bruk av en jeksel tillater også å opprettholde et konsistent skråvinkelen i hvert eksperiment, redusere variasjon av injeksjon resultatene. Vi foretrekker automatisert kontroll av injeksjonen hastighet over manuell dispensasjon 17 for en jevn fordeling av viruspartikkel suspensjonen i dorsal horn og å redusere risikoen for en injeksjon feil. Like kritisk er en langsom utvinning av kanylen, som skal startes 2-5 min etter endt Injectipå å unngå å trekke viruset suspensjon tilbake opp og forårsaker en extraspinal utslipp.
Omfang og distribusjon av den intraspinal transfeksjon avhenge injisert partikkel dose og iboende egenskaper av viral vektor som serotype og infeksjon effekt. Den optimale partikkel fortynning må bestemmes empirisk for hvert virus og serotype og kan variere mellom ulike satser av det samme viruset. Effekt av både infeksjon og DNA transduksjon kan også variere avhengig av målrettet befolkningen i nevroner 18,19. AAV oppnår genoverføring i nevroner uten sykdomsfremkallende og minimale immun bivirkninger 20. I vår erfaring, er infeksjon av dorsal horn nevroner komplett innen 1-2 uker og stabile. Vi har observert mindre microglial svar på injeksjonsstedet, men disse løst innen en uke.
Vi anbefaler å sammenligne ulike serotyper av vektorer som uttrykker en reporter gen som eGfp til evaluate transfeksjon priser, bestemme tidsintervallene mellom injeksjon og stabil transfeksjon og etablere om infeksjonen er begrenset til nerveceller. Spesifisitet vil avhenge cellen tropisme av vektoren, den transfekterte gen og dets promoter. Etterforskerne studerer somatosensoriske trasé bør også undersøke dorsal root ganglion nevroner for en potensiell uttrykk for reporteren genet, noe som kan resultere fra infeksjon av disse nevronene i sine sentrale terminaler i dorsal horn eller forurensning av spinalvæske 19.
I USA er bruken av virale vektorer for genmanipulering regulert av NIH Retningslinjer for forskning som involverer rekombinant DNA molekyler ( http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html ). Disse retningslinjene stiller krav til etterforsker opplæring, personlig beskyttelse, viral vektor containment, decontamination, avhending av forurensede materialer som brukte sprøyter og kanyler, og dyr bolig etter injeksjonen. Etterforskerne skal arbeide med sitt lokale IACUC eller tilsvarende organ for institusjonelle tilsyn for å bestemme regler og forskrifter som gjelder for sin forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Bakhos A. Tannous, Ph.D., direktør for Vector Utvikling og Produksjon i Neuroscience Center of Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, for å gi oss med rAAV-eGfp vektor, og John Whang for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av stipend R01 NS050408 (til JS) fra National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
