Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

Zusammenfassung

Wiederholte retroorbitalen Injektionen kationische liposomes/siRNA/ITSN-1s Komplexe in Mäusen, alle 72 Stunden für 24 Tage, effizient die siRNA-Duplex zum Mauslunge Mikrovaskulatur Reduzierung ITSN-1s mRNA und Protein-Expression von 75%. Diese Technik ist in hohem Maße reproduzierbar in einem Tiermodell, hat keine Nebenwirkungen und Todesfälle verhindert.

Zusammenfassung

Frühere Studien zeigten, dass Knockdown von ITSN-1s (KD _ITSN), ein Protein, das in der Regulierung endozytischen Lunge vaskulären Permeabilität und Endothelzellen (ECs) Überleben, induzierte Apoptose, ein wesentliches Hindernis bei der Entwicklung eines Zellkultur-System mit längerer ITSN-1s beteiligt Hemmung ^1. Mit kationische Liposomen als Träger, erkundeten wir die Silencing ITSN-1s-Gen in der Maus Lunge durch systemische Verabreichung von siRNA Targeting ITSN-1-Gen (siRNA _ITSN). Kationische Liposomen bieten mehrere Vorteile für siRNA Lieferung: Safe mit wiederholter Gabe, nicht immunogen, ungiftig und einfach zu ² zu erzeugen. Liposomen Leistung und biologische Aktivität von ihrer Größe, Ladung, Lipid-Zusammensetzung, Stabilität, Dosis und Art der Verabreichung ³ Hier eine effiziente und spezifische KD _ITSN in Mauslungen wurde unter Verwendung eines Cholesterin-und Dimethyl Dioctadecyl ammoniumbromid Kombination ab. Intravenöse Verabreichungvon siRNA _ITSN / kationische Liposomen-Komplexe vorübergehend abgerissen ITSN-1s Protein und mRNA in Mauslungen am Tag 3, die nach weiteren 3 Tagen wiedergefunden. Unter Ausnutzung der kationische Liposomen als wiederholbare sichere Fluggesellschaft, erweitert die Studie für 24 Tage. So wurde retroorbitalen Behandlung mit frisch erzeugten Komplexe verabreicht jeden 3. Tag, induzieren anhaltende KD _ITSN während der Studie ^4. Maus-Gewebe an mehreren Zeitpunkten nach der siRNA _ITSN gesammelt wurden elektronenmikroskopische (EM)-Analysen unterzogen, um die Wirkung einer chronischen KD _ITSN auszuwerten, Lunge Endothel. Hochauflösende EM Bildgebung erlaubt es uns, die morphologischen Veränderungen durch KDITSN in der Lunge Gefäßsystem verursacht bewerten (dh Störung der endothelialen Barriere, verringerte Anzahl von Caveolae und Hochregulation alternative Transportwege), Eigenschaften nicht nachweisbar durch Lichtmikroskopie. Insgesamt diese Erkenntnisse etabliert eine wichtigewichtige Rolle von ITSN-1s in der ECs Funktion und Lunge Homöostase, während, die die Wirksamkeit von siRNA-Liposomen Lieferung in vivo.

Einleitung

Nackte siRNA kann nicht durch die Zellmembran, das negativ geladen ist, und es ist leicht durch Enzyme abgebaut in Blut, Gewebe und Zellen. Selbst mit kurzem strukturelle Veränderungen, um die Stabilität zu verbessern, ist siRNA Akkumulation am Zielort nach Verabreichung äußerst gering und erfordert eine effiziente intrazelluläre Fahrzeug ^5. Kationische Liposomen erwies sich als sicher Nukleinsäuren Träger mit dem Potenzial, große Stücke von DNA / RNA in Zellen übertragen durch Verkapselung und Schutz der Nukleinsäuren vor enzymatischem Abbau ^6. Auch kationische Liposomen spontan interagieren mit DNA / RNA, damit die Förderung Gentransfer in die....

Protokoll

1. Kationische Liposomen Vorbereitung

1. Autoklav eine saubere Rundkolben für lipososmes Zubereitung verwendet werden.
2. Bereiten Stammlösungen:
   1. - Man löst 200 mg Dimethyl-dioctadecyl Ammoniumbromid (DOAB) in 10 ml Chloroform mit einer kleinen Glasflasche.
   2. - Lösen Sie 200 mg Cholesterin in 10 ml Chloroform mit einer kleinen Glasflasche.
   3. - Vorbereitung und Autoklaven auf 5% Glucose in 100 ml RNA / DNA-ase kostenlos destilliertem Wasser zu sterilisieren.
3. Spülen Sie den Rundkolben mit Chloroform. In 5-10 ml in den Kolben, Wirbel, und lassen Sie es sich für ein paar Minuten. Halten Sie den Ko....

Ergebnisse

ITSN-1s Protein-und mRNA-Spiegel wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der siRNA _ITSN Lieferung durch Western-Blot-und konventionellen und quantitative PCR, wie in ⁴ überwacht. ITSN-1s Protein-und mRNA-Level in siRNA-behandelten Maus _ITSN Lungen waren etwa 75% niedriger unter Bezugnahme auf die Kontrollen während der kontinuierlichen Knockdown von ITSN-1s für 21 Tage. Ohne ITSN-1s, Dynamin-2 ist ein wichtiger Interaktionspartner von ITSN-1s und wichtiger Akteur in Ablösung von Caveola.......

Diskussion

Basierend auf früheren Studien von anderen ⁹ und uns ^{1, 18} haben wir diese Methode für die langfristige knock down von ITSN-1s in vivo durch wiederholte intravenöse Verabreichung (alle 72 h für 24 aufeinanderfolgende Tage) spezifischer siRNA / Liposom-Komplexen veröffentlicht. Dieser experimentelle Ansatz ist effizient, sicher und immer wieder verwendet werden und es kann leicht erweitert werden, um die Beteiligung eines Gens jedes Protein von Interesse in der Lunge und pulmonaler Endothel.......

Materialien

Comments

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dimethyldioctadecyl-Ammoniumbromid (DOAB)	Sigma-Aldrich	D2779
LiposoFast-Stabilisator (Mini-Extruder)	Avestin Inc.	LF-STB
Polycarbonat-Membran, 19 mm Durchmesser, 50 nm Poren	Avestin Inc.	LFM-50
Cholesterin	Sigma-Aldrich	C-8667
Chloroform	Mallinckrodt Chemicals	4432-04
Hank's ausgewogene Salze	Sigma-Aldrich	H1387
Rundkolben	Fisher Scientific	FHB-275-030X
Maus siRNAITSN - on target	Dharmacon/ ThermoScientific	J-046912-11
Schlauchpumpe	Ismatec	REGLO-CDF digital mit RHOO Pumpenkopf
Beatmungsgerät	Hugo Sachs Electronik	NA
Barbital	Sigma-Aldrich	B-0500
Uranylacetat	EM Sciences	22400
Epon812	EM Sciences	Hersteller abgekündigt
Propylenoxid	EM Sciences	20400
Einbettungsformen	EM Sciences	69923-05
Gerbsäure	EM Sciences	21710
8 nm Gold-Albumin-Tracer		Im Labor hergestellt wie in16<
Ausgestattet mit 2 Avestin 1 ml gasdichte Spritzen (Kat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modifizierte siRNA, in vivo<
D-79232 März, Deutschland
Ersetzt durch Embed812, Kat. # 14120

Vom td colspan="4">td colspan="4">Teil von IDEX corp.