通过阳离子脂质体重复递送特异性siRNA实现小鼠肺组织中Intersectin-1s的长期沉默。利用电子显微镜评估基因敲低效果 关键词：Intersectin-1s，siRNA，阳离子脂质体，肺组织，基因沉默，电子显微镜，基因敲低

摘要

在小鼠中每72小时重复进行眶后静脉注射阳离子脂质体/siRNA/ITSN-1s复合物，持续24天，可高效将siRNA双链递送至小鼠肺微血管系统，使ITSN-1s的mRNA和蛋白表达水平降低75%。该技术在动物模型中具有高度可重复性，无不良反应，且不会导致动物死亡。

摘要

先前的研究表明，ITSN-1s 的敲低（KD）_ITSN），一种参与调控肺血管通透性和内皮细胞（ECs）存活的内吞蛋白，其长期抑制会诱导细胞凋亡，这是建立长期抑制ITSN-1s的细胞培养系统的主要障碍¹使用阳离子脂质体作为载体，我们通过系统性给予靶向ITSN-1基因的siRNA（siRNA），探索了在小鼠肺组织中沉默ITSN-1s基因的效果。_ITSN阳离子脂质体在siRNA递送方面具有多种优势：重复给药安全性高、无免疫原性、无毒性且易于生产²脂质体的性能和生物活性取决于其粒径、电荷、脂质组成、稳定性、剂量以及给药途径³此处，高效且特异的KD_ITSN 通过胆固醇与二甲基二辛十八烷基溴化铵组合，已在小鼠肺组织中实现siRNA的静脉递送。_ITSN/阳离子脂质体复合物在第3天短暂敲低了小鼠肺组织中的ITSN-1s蛋白和mRNA水平，随后3天内恢复。利用阳离子脂质体作为可重复使用的安全载体，研究延长至24天。因此，每隔3天通过眶后途径给予新制备的复合物，实现持续性基因敲低_ITSN 在整个研究过程中⁴. 在siRNA处理后多个时间点采集的小鼠组织_ITSN 进行透射电子显微镜（EM）分析，以评估长期生酮饮食（KD）的影响_ITSN，在肺血管内皮中。高分辨率电镜成像使我们能够评估KDITSN在肺血管床中引起的形态学改变（即 内皮屏障破坏、小窝数量减少以及替代性转运途径的上调），这些特征无法通过光学显微镜检测到。总体而言，这些发现确立了ITSN-1s在内皮细胞功能及肺组织稳态中的重要作用，同时展示了siRNA-脂质体递送系统的有效性 体内.

引言

裸露的siRNA因带负电荷而无法穿透细胞膜，且易被血液、组织和细胞中的酶降解。即使近年来通过结构修饰提高了其稳定性，给药后siRNA在靶部位的蓄积量仍然极低，因此需要高效的细胞内递送载体。⁵阳离子脂质体作为一种安全的核酸载体，能够通过包封核酸并保护其免受酶降解，将大片段的DNA/RNA导入细胞⁶此外，阳离子脂质体可自发与DNA/RNA相互作用，从而促进基因向细胞的转移²近年来，脂质体已被用于递送疫苗和小分子药物⁷脂质体递送表达 microRNA-7 的质粒克服肺癌细胞对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的耐药性⁸在靶向血管内皮时，静脉给药至关重要，因为复合物难以穿越内皮屏障并渗出至间质。⁹与其他器官相比，肺微血管内皮细胞（ECs）对阳离子脂质体及DNA/RNA复合物的摄取能力最强，且能高效内化这些物质，其次为淋巴结和派尔集合淋巴结。⁹在啮齿类动物模型中，通过眶后静脉或尾静脉注射递送siRNA已被证明是安全的，即使在50 mg/kg等高浓度下亦无明显毒性。¹⁰在已发表的文献中，阳离子脂质体的组成各不相同，取决于脂质的配方及其等摩尔比例。^{11, 12}使用阳离子脂质体进行基因递送具有广泛的应用前景 体内，无论是靶向下调/过表达蛋白质，还是递送疫苗或抗肿瘤治疗^13-15需要牢记的是，DNA/RNA与细胞膜相....

方案

1. 阳离子脂质体的制备

1. 将一个洁净的圆底烧瓶进行高压灭菌，用于脂质体的制备。
2. 配制储备液：
   1. - 使用小玻璃瓶将 200 mg 的二甲基二十八烷基溴化铵（DOAB）溶解于 10 ml 氯仿中。
   2. - 使用小玻璃瓶将 200 mg 胆固醇溶解于 10 ml 氯仿中。
   3. - 在 100 ml 无 RNA/DNA 酶的蒸馏水中配制 5% 葡萄糖溶液，并进行高压灭菌以达到无菌状态。
3. 用氯仿冲洗圆底烧瓶。向烧瓶中加入 5–10 ml 氯仿，轻轻旋转混匀，静置数分钟。操作过程中始终用铝箔覆盖烧瓶。随后将氯仿倒出。
4. 脂质体的制备：
   1. - 向圆底烧瓶中加入 315 μl DOAB 储备液。
   2. - 向烧瓶中加入 200 μl 胆固醇储备液。
   3. - 向烧瓶中加入 9.5 ml 氯仿，通过轻轻旋转混匀。
5. 将旋转蒸发仪设定为 37 °C，转速为每分钟 100 转（rpm）或更高（100–120 rpm）。旋转蒸发仪应连接至带有正确安装吸管的水泵真空控制系统。
6. 将氩气钢瓶与旋转蒸发仪连接。
7. 将烧瓶安装到旋转蒸发仪上，并在将其浸入水浴前调整至最佳设置。通过逆时针旋转完全打开第一个....

结果

在siRNA处理后的多个时间点监测了 ITSN-1s 蛋白和 mRNA 水平_ITSN 通过Western印迹、常规PCR和定量PCR进行检测，方法如前所述⁴siRNA 中 ITSN-1s 蛋白和 mRNA 水平_ITSN-与对照组相比，在持续敲低ITSN-1s 21天后，处理组小鼠肺组织中的相关指标降低了约75%。在缺失ITSN-1s的情况下，dynamin-2（ITSN-1s的主要相互作用蛋白，且为小窝从质膜上脱离所必需的关键因子）无法被有效募集至内吞位点，从而导致小窝从质膜脱离以及游离囊泡载体形成的过程受到破坏^{1, 17}因此，膜裂变无效及游离囊泡载体形成受损导致内吞作用缺陷和跨内皮转运障碍，内皮间屏障破坏以及肺水肿。图1）。此外，ITSN-1s的下调会激活替代性转运途径，以补偿内吞作用的缺陷。我们观察到膜性环状结构（图2A 和 2a1），多形性小管（图2B），以及扩大的内体与典型的胞膜凹陷小窝融合（.......

讨论

基于先前他人发表的研究⁹ 我们^{1, 18} 我们开发了这种用于长期敲低ITSN-1s的方法 体内 通过每隔72小时连续24天重复静脉注射特异性siRNA/脂质体复合物实现。该实验方法高效、安全，可重复使用，并可轻松扩展用于研究编码任何目标蛋白的基因在肺内皮及肺部稳态中的作用。在我们设定的重复给予siRNA/脂质体的实验条件下，小鼠表现正常，无毒性或免疫反应迹象。全身性给予siRNA_ITSN/liposome 复合物是癌症及其他代谢性疾病最具临床相关性的给药途径。静脉注射的 siRNA/liposome 复合物首先到达肺部毛细血管床，这可能解释了其高效的基因沉默效果_ITSN 在肺中。

该研究的一个局限性是阳离子脂质体随时间推移发生的持续聚集²。为克服这一问题，siRNA/脂质体复合物在制备后立即（2小时内）给予，并在使用前始终置于冰上保存。传统阳离子脂质体（如本研究中所使用的）被认为会被网状内皮系统清除。通过脂质体聚乙二醇化（pegylation）可降低吞噬.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲基二十八烷基溴化铵 (DOAB)	Sigma-Aldrich	D2779
脂质体挤出仪稳定器（小型挤出装置）	Avestin Inc.	LF-STB
聚碳酸酯膜，直径 19 mm，孔径 50 nm	Avestin Inc.	LFM-50
胆固醇	Sigma-Aldrich	C-8667
氯仿	Mallinckrodt Chemicals	4432-04
汉克平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	H1387
圆底烧瓶	Fisher Scientific	FHB-275-030X
小鼠 siRNAITSN - on target	Dharmacon/ThermoScientific	J-046912-11
蠕动泵	Ismatec	REGLO-CDF 数字型，配备 RHOO 泵头
呼吸机	Hugo Sachs Electronik	NA
巴比妥酸	Sigma-Aldrich	B-0500
醋酸铀酰	EM Sciences	22400
Epon812	EM Sciences	制造商已停产
环氧丙烷	EM Sciences	20400
包埋模具	EM Sciences	69923-05
单宁酸	EM Sciences	21710
8 nm 金-白蛋白示踪剂		实验室自制，方法见文献16
备注
配备两个 Avestin 1 ml 气密性注射器（货号：LF-1）
Pyrex，100 ml
修饰型 siRNA，体内
IDEX 公司旗下产品
德国马尔奇，D-79232
已替换为 Embed812，货号：14120