Method Article

השתקה ארוכת טווח של Intersectin-1S בעכבר על ידי משלוח ריאות חוזר ונשנה של siRNA ספציפי באמצעות ליפוזומים קטיוני. הערכה של השפעות מציאה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

DOI:

10.3791/50316

⸱

June 21st, 2013

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זריקות רטרו מסלולית חוזרות ונשנות של מתחמי קטיוני liposomes/siRNA/ITSN-1s בעכברים, בכל 72 שעות למשך 24 ימים, ביעילות לספק דופלקס siRNA לmicrovasculature ריאות עכבר הפחתת mRNA ITSN-1S וביטוי חלבון על ידי 75%. טכניקה זו היא שחזור מאוד במודל של בעלי חיים, אין לו תופעות לוואי ונמנע הרוגים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים קודמים הראו כי מציאה של ITSN-1S (KD ITSN), חלבון endocytic המעורב בויסות חדירות כלי דם וריאות תאי האנדותל (ECS) הישרדות, מוות של תאי אפופטוטיים מושרה, מכשול עיקרי בפיתוח מערכת תרבית תאים עם ITSN-1S ממושך עיכוב 1. באמצעות ליפוזומים קטיוני כנשאים, בחן את ההשתקה של גן ITSN-1S בעכבר ריאות על ידי ממשל מערכתי של siRNA גן מיקוד ITSN-1 (ITSN siRNA). ליפוזומים קטיוני מציעים מספר יתרונות למסירת siRNA: בטוח במינון חוזר ונשנה, nonimmunogenic, רעילים, וקלים לייצור 2. ביצועים ליפוזומים ופעילות ביולוגית שלהם תלויות בגודל, תשלום, שומנים הרכב, יציבות, מינון ודרך מתן 3 הנה, יעיל והספציפי בITSN KD ריאות עכבר הושג באמצעות שילוב רומיד אמוניום dioctadecyl כולסטרול ודימתיל. משלוח תוך ורידישל ITSN siRNA / מתחמי liposome קטיוני דפקו transiently למטה חלבון ITSN-1S וmRNA בעכבר ריאות ביום 3, שהתאושש לאחר 3 ימים נוספים. מנצלים את יפוזומים קטיוני כמוביל בטוח הדיר, המחקר הוארך למשך 24 ימים. לפיכך, טיפול רטרו מסלולית עם מתחמים טריים שנוצרו היה מנוהל בכל יום 3, גרימת ITSN KD המתמשך לאורך כל תקופת המחקר 4. רקמות עכבר שנאספו במספר הנקודות ITSN לאחר זמן siRNA היו נתונים למיקרוסקופים אלקטרונים (EM) ניתוחים כדי להעריך את ההשפעות של KD ITSN הכרוני, בהאנדותל ריאות. רזולוציה גבוהה EM הדמיה אפשרה לנו להעריך את השינויים מורפולוגיים שנגרמו על ידי KDITSN במיטת כלי דם הריאה (כלומר שיבוש של מכשול אנדותל, מספר caveolae וupregulation של מסלולי תחבורה חלופיים ירד), מאפיינים שאינם לזיהוי על ידי מיקרוסקופ אור. בסך הכל ממצאים אלו הוקמו imporהתפקיד של TANT ITSN-1S בתפקוד ECs והומאוסטזיס ריאות, ואילו הממחיש את היעילות של ליפוזומים משלוח siRNA בin vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

siRNA בלתי מזוינת לא יכול לחדור את קרום התא, שטעון שלילי, וזה בקלות מושפל על ידי אנזימים בדם, רקמות ותאים. אפילו עם לאחרונה שינויים מבניים לשיפור יציבות, הצטברות siRNA באתר היעד לאחר מתן היא נמוכה ביותר ודורשת רכב תאי יעיל 5. ליפוזומים קטיוני התפתחו כנשאים חומצות גרעין בטוחים עם הפוטנציאל להעברת חלקים גדולים של ה-DNA / RNA לתאים על ידי encapsulating והגנה על חומצות גרעין משפלה האנזימטית 6. כמו כן, ליפוזומים קטיוני אינטראקציה באופן ספונטני עם DNA / RNA, ובכך לקדם העברת גנים לתאים 2. לאחרונה יפוזומים יושמו כדי לספק חיסונים ותרופות מולקולריים נמוכה במשקל 7. משלוח liposomal של microRNA-7-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה ליפוזומים cationic

  1. חיטוי בקבוק מסביב לתחתית נקי כדי לשמש להכנת lipososmes.
  2. הכן פתרונות מניות:
    1. - ממיסים 200 מ"ג של אמוניום ברומיד dioctadecyl דימתיל (DOAB) בכלורופורם 10 מ"ל באמצעות בקבוק זכוכית קטן.
    2. - ממיסים 200 מ"ג של כולסטרול בכלורופורם 10 מ"ל באמצעות בקבוק זכוכית קטן.
    3. - היכונו ו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רמות חלבון וה-mRNA ITSN-1s היו במעקב במספר נקודות זמן לאחר לידת ITSN siRNA ידי כתם המערבי וPCR הקונבנציונלי וכמותית בכ4. רמות חלבון וה-mRNA ITSN-1S בעכבר ריאות שטופלו ITSN siRNA היו כ -75% נמוכים יותר על ידי התייחסות לבקרות במהלך מתמדת של מציאה ITSN-1S במשך 21 ימים. ללא ITSN-1S, dynamin-2, שותף אינטראקציה עיקרי של שחקן ITSN-1S והחיוני בניתוק של caveolae מקרום הפלזמה אינו יעיל גויס לאתר endocytic ובכך, ניתוק caveolae מקרום הפלזמה והיווצרות לפוחי החו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתבסס על מחקרים קודמים שפורסמו על ידי אחרים ו9 1, 18 שפתחנו מתודולוגיה זו לטווח ארוך להפיל של ITSN-1S in vivo על ידי עירוי לוריד חזר (בכל שעה 72, במשך 24 ימים רצופים) של siRNA הספציפי / מתחמי liposome. גישה ניסויית זה היא יעילה, בטוח לשימוש ושוב ושוב וניתן להרחיב אותו בקלות כדי לחקור את מעורבותו של גן מקודד חלבון כלשהו של עניין בהאנדותל ריאות והומאוסטזיס ריאתי. תחת התנאים הניסיוניים שהוקמו על ידינו לsiRNA חזר / משלוח ליפוזומים, עכברים נראים נורמלי ללא סימני רע.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקי R01HL089462 לSP.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
דימתיל דיוקטדציל אמוניום ברומיד (DOAB)סיגמא-אולדריץ'D2779
מייצב ליפוזו-מהיר (מיני מכבש)Avestin Inc.LF-STB
, קוטר 19 מ"מ, נקבוביות 50 ננומטרAvestin Inc.LFM-50
כולסטרולסיגמא-אולדריץ'C-8667
כלורופורםמלינקרודט כימיקלים4432-04
המלחים המאוזנים של האנקסיגמא-אולדריץ'H1387
בקבוק תחתון עגולפישר סיינטיפיקFHB-275-030X
עכבר siRNAITSN - על המטרה דהרמקון/ ThermoScientificJ-046912-11
משאבה פריסטלטיתIsmatecREGLO-CDF דיגיטלית עם ראש
מאווררהוגו סאקס אלקטרוניקNA
ברביטלסיגמא-אולדריץ'B-0500
אורניל אצטטEM Sciences22400
Epon812EM Sciencesהופסק על ידי היצרן
תחמוצת פרופילןEM Sciences20400
תבניות הטמעהSciences69923-05
חומצה טאניתEM Sciences21710
8 ננומטר זהב-אלבומין עוקבמוכן במעבדה כ-in16
Comments
מצויד ב-2 Avestin 1 מ"ל מזרקים אטומים לגז (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
siRNA שונה, in vivo<
D-79232 מרץ, גרמניה
הוחלף ב-Embed812, cat. # 14120
קרום פוליקרבונט משאבת RHOO EM td colspan="4">חלק מ-IDEX corp.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
  2. Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral ge....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intersectin 1s KnockdownCationic LiposomessiRNA DeliveryElectron MicroscopyLung EndotheliumRetroorbital InjectionWestern Blot AnalysisQ RT PCRLiposome PreparationEndothelial Barrier

Related Articles