Summary
Denne fremgangsmåde giver telencephalic neuroner ved at gå gennem checkpoints, der ligner dem observeret under den menneskelige udvikling. Cellerne får lov til spontant differentierer, udsættes for faktorer, der skubber dem mod det neurale afstamning, isoleres, og udplades på dækglas for at muliggøre terminal differentiering og modning.
Abstract
Her har en trinvis procedure for effektiv frembringelse telencephalic glutamaterge neuroner fra humane pluripotente stamceller (PSC) blevet beskrevet. Differentieringsprocessen initieres ved at bryde de humane PSC'er i klumper, som runde op til dannelse af aggregater, når cellerne er placeret i en suspensionskultur. Aggregaterne dyrkes derefter i hESC medium fra dag 1-4 for at tillade spontan differentiering. I denne periode har cellerne kapacitet til at blive en af de tre kimlag. Fra dag 5-8, cellerne anbringes i et neuralt induktionsmedium at skubbe dem ind i neurale afstamning. Omkring dag 8 cellerne lov til at fæstne på 6-brøndsplader og differentiere i hvilket tidsrum neuroepitelceller form. Disse neuroepitelceller kan isoleres på dag 17. Cellerne kan derefter holdes som neurosfærer, indtil de er klar til at blive udpladet på dækglas. Ved hjælp af et basisk medium uden caudalizing faktorer, neuroepitelceller er specified i telencephalic forstadier, som derefter kan yderligere differentieret i dorsale telencephalic progenitorer og glutamaterge neuroner effektivt. Samlet set vores system giver et værktøj til at generere menneskelige glutamaterge neuroner for forskere at studere udviklingen af disse neuroner og de sygdomme, der påvirker dem.
Introduction
Humane pluripotente stamceller (PSC), herunder både humane embryonale stamceller (hESCs) og induceret pluripotente stamceller (iPSCs), har kapacitet til at generere alle celletyper i kroppen, herunder neuroner 1-3. Instrueret differentiering af forskellige neuronale undertyper fra humane PSC har nøglen for anvendelse af disse celler i regenerativ medicin. Den generation af funktionelle neuronale undertyper under udvikling er en kompleks proces, der involverer induktion af neurale afstamning, specifikationen af regionale progenitorer langs Rostro-caudale akse, og differentieringen af post-mitotiske neuron typer fra de regionale progenitorer 4,5. Begyndende i 2001, har flere systemer blevet oprettet for at generere neurale afstamning fra hESCs, som har ydet en platform for den efterfølgende generation af neuronale undertyper 6,7. Baseret på udviklingsmæssige principper, flere neuron typer såsom spinal motor neuroner 8-12, midthjernen DOPaminerge neuroner 13-15, og neurale nethinde celler 16,17 er effektivt angivet fra humane PSC. Dette blev gjort ved at anvende kritiske morfogener, som er vigtige for specifikationen af disse neuron typer under in vivo udvikling. Andre protokoller er også blevet udviklet til at fremme differentiering af hESCs til neuroner under anvendelse af enten yderligere faktorer 18-20, såsom små molekyler eller ved co-dyrkning med andre celletyper til at fremme differentiering 21.
Den menneskelige neocortex er højt udviklet og indeholder mange celletyper, herunder glutamaterge neuroner, som spiller en vigtig rolle i læring, hukommelse og kognitiv funktion 22,23. Det første trin i frembringelse glutamaterge neuroner i kultur er at specificere telencephalic progenitorceller. Yoshiki Sasai gruppe først rapporteret den styrede differentiering af telencephalic precursorer fra mus ESC (mESCs) under anvendelse af et serumfrit suspension kultur i nærvær af DKK1 (som inhiberer Wnt signalering) samt LeftyA (som inhiberer nodal signalering) 24. Efterfølgende har flere grupper, herunder vores rapporterede også specifikationen af telencephalic precursorer fra humane PSC'er i serumfrit medium 25-27. Frembringelsen af telencephalic precursorer fra humane PSC kræver ikke anvendelse af exogene morfogener og effektiviteten i at generere disse prækursorer er meget højere end den fra mESCs 26,27. Her har en kemisk defineret system for neural induktion der var veletableret af Zhang gruppe 7 blevet beskrevet. Uden tilsætning af exogene caudalizing faktorer, effektivt denne protokol genererer telencephalic precursorer fra humane PSC 27. Disse progenitorer kan derefter opdeles i dorsale eller ventrale progenitorer ved at regulere signalering af Wnt og sonic pindsvin (SHH). Den dorsale progenitorer kan yderligere differentiere sig til glutamaterge neuroner efficiently 27. Desuden denne protokol fungerer godt til dannelse af glutamaterge neuroner fra human iPSCs 28, som muliggør dannelsen af patientspecifikke neuroner, som kan anvendes til at undersøge virkningsmekanismen samt potentielle terapier for en lang række sygdomme . Desuden vores system giver også en platform til at undersøge mulighederne for udvikling og specifikation af diverse neuronale typer i telencephalon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dannelse af humane pluripotente stamcelle Aggregates (D1-D4)
- Humane pluripotente stamceller dyrkes på muse embryonale fibroblast (MEF) foderautomater i nærvær af hESC medium suppleret med basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, 4 ng / ml). Efter 5-7 dage i kultur, når kolonierne er store, men stadig er udifferentierede de er klar til det næste trin.
- Enzymopløsningen bør først fremstilles. I et 50 ml rør, opløse dispase (eller collagenase) i en 1 mg / ml koncentration i DMEM/F12-medium. Eftersom disse opløsninger blandes bedst, når opvarmet ved at placere røret indeholdt mediet, og enzymet i et 37 ° C vandbad i 10-15 min og derefter steriliseres under anvendelse af en Steriflip filter.
- Suges væk mediet fra cellerne, skyl dem med DMEM/F12, og opsug denne ud så godt. Tilsættes 1 ml dispase til hver brønd og anbringes i inkubatoren i 3-5 min for hESCs (op til 10 min for iPSCs). Kig på cellerne under mikroskop, og nårkanterne krøller lidt op / ser lidt mørkere, cellerne er klar til det næste trin. Det er bedst at kontrollere cellerne efter 3 min, og læg dem tilbage i, hvis det er nødvendigt. Når der anvendes denne protokol for første gang, er det bedst at begynde med kun én plade af celler på et tidspunkt, da det er vigtigt at fjerne cellerne fra dispase så hurtigt som muligt.
- Aspirer fra dispase fra cellerne. Forsigtigt (cellerne er meget sårbare i denne fase, og vil komme ud af pladen relativt let) tilsættes 1,5 ml DMEM/F12-medium til hver brønd for at skylle dispase. Aspirer fra DMEM/F12, og der tilsættes 1,5 ml hESC medium til hver brønd.
- At tage af og bryde op i cellerne, skal du placere spidsen af en 10 ml glas pipette mod nederste højre hjørne af en brønd (røre celler) og flytte pipetten op og ned (lodret) - den opadgående stoke bør være i tæt nærhed til proceduren nedadgående slag. Når den anden side af brønden er nået, gentages i det vandrette direktion.
- Når alle celler er i suspension, placere dem i 15 ml rør og centrifugeres dem ved 200 x g i 2 min. Der bør være en pellet af celler i bunden af røret. Aspirer fra mediet fra oven pelleten.
- Størrelsen af cellen dyrkningskolbe, som bør anvendes til at holde aggregater i afhænger af den oprindelige mængde af celler. For 6 brønde (1 plade) af hESCs, behandlet én ikke-vævskultur T75-kolbe med 50 ml hESC medium bør anvendes. Overføre cellerne fra trin 1,6 til kolben og inkuber ved 37 ° C.
- For at slippe af cellerester, bør cellen medium og kolben erstattes omtrent 12 timer senere. For at gøre dette, skal du placere alle de mellemliggende / celler i en 50 ml tube, spinde cellerne ned (200 xg i 2 minutter), og der opsuges fra det gamle medium. Dernæst tilsættes 50 ml frisk hESC medium til cellerne, og anbringes i en ny T75 kolbe. Cellerne kan derefter tilføres dagligt at følge samme procedure (indtil dag 5).
- Overfør celler / medium til et 50 ml rør og centrifugeres cellerne i 2 minutter ved 200 x g. Next, aspireres supernatanten, og overføre cellerne til en ny (ikke-vævet behandlet kultur) T75-kolbe med 50 ml neural induktion medium (NIM).
- Når cellerne er i NIM, bør halvdelen af mediet erstattes hver anden dag. Aggregaterne bør være stor nok til, hvor de vil synke til bunden af et 50 ml konisk rør af sig selv efter nogle få minutter (ingen centrifugering nødvendig). Efter 2-3 dage i NIM (D7-D8 total), bør cellerne være klar til pladen. Laminin eller føtalt bovint serum (FBS) kan anvendes til at hjælpe cellerne vedhæfte til pladerne.
- Antallet af vævskultur behandlede plader med 6 brønde, som er nødvendige, afhænger af densiteten af de celler, som hvert aggregat skal kunne vokse på pladen i flere dage uden at røre nogen af de andre. I gennemsnit cellerne fra enT75-kolbe vil give omkring 04-06 Juni brøndsplader værd af celler.
- Hvis der anvendes laminin, fortynde den i NIM til 10-20 ug / ml til belægning af 6-brønds plade (~ 0,5 ml / brønd). Efter coating for 2-3 hr, plade celleaggregater over på plader med 6 brønde (~ 20-30 aggregater per brønd). Efter aggregaterne har bundet, tilsættes 1,5 ml NIM.
- Hvis der anvendes FBS, fremstille en blanding af 90% NIM og 10% FBS (1,5 ml / brønd). Tilsættes 1,5 ml medium med cellerne til hver brønd, forsigtigt ryste pladen frem og tilbage til at sprede sig aggregaterne, og tillader cellerne at fastgøre O / N i en inkubator. Vær sikker på at ændre mediet (2 ml / brønd NIM) den følgende morgen for at fjerne FBS.
- Efter en dag eller to for at være belagte, vil hvert aggregat spredt ud for at danne et monolag. Inden for et par dage, vil centrene af de fleste af disse celler morfologisk ligne søjleceller (aflang). I denne periode ændre NIM hver anden dag. Nogle PSC linjer (especially IPSC), kan danne søjleceller mindre effektivt. Hvis dette sker, kan tilsætning af BMP-og TGF-inhibitorer (Dorsomorphin 29, SB431542 19 til 2 uM) i trin 2 være nyttig.
- Omkring dag 14-17, vil de søjleformede celler synes mere kompakt. Sommetider disse celler danner højderygge eller ringe med synlige lumen inde. Udover den søjleformede morfologi, ekspres-celler på dette stadium neuroepitelceller markører, såsom Pax6 og SOX1 12,26.
- Før isolering kan begynde, skal man først undersøge cellerne for at bestemme, om der er ikke-neuroepitelceller til stede. En objektiv markør kan anvendes til at angive de ikke-neuroepitelceller kolonier. Disse kan derefter fjernes ved at skrabe dem af med en pipettespids.
3. Generering af Telencephalic progenitorer (D17-D24)
- Centrene i kolonierne indeholder neuroepitelceller og skal isoleres fra resten af kolonien. Dette kan gøres ved hjælpen mikropipette og en steril 1 ml filtreredes pipettespids. Når en lille mængde tryk påføres den centrale del af kolonien, det generelt elevatorer ud ganske let. Være forsigtig med ikke lade den ydre del af kolonien løsnes også. Hvis centrene er stædig og vil ikke komme ud på egen hånd, kan de fjernes ved udskæring dem ved hjælp af en nål under et mikroskop i en steril hætte. Overføre de midterste dele af kolonierne til et 15 ml rør og spinde ved 200 x g i 2 min.
- Mediet skal bortsuges af cellerne. To plader værd af celler kan derefter overføres til en ikke-vævskultur behandlede T25 kolbe, der indeholdt 10 ml NIM med tilsætning af B27 (uden vitamin A, 1:50). Anvende fra 5 til 10 ml medium pr én plade af celler.
- Når cellerne på den følgende dag, bør de have en kugle udseende. Det er nødvendigt at overføre disse celler til en ny kolbe (under tilstedeværelse af NIM og B27, 1:50) som det ofte er de perifere cellersom snige sig ind og lægger på bunden af kolben.
- Neurosfærerne bør derefter dyrkes i suspension i en uge ved hjælp NIM suppleret med B27 (1:50). For at fremme celle-udholdenhed og proliferation, cyklisk AMP (cAMP, 1 uM) samt insulin-vækstfaktor (IGF1, 10 ng / ml) kan tilsættes til mediet under suspensionskultur. På dette tidspunkt indeholder neurosfærer telencephalic progenitorer (FOXG1 +) og er klar til at blive udpladet på dækglas til terminal differentiering.
4. Yderligere differentiering til den Telencephalic neuroner (D25 +)
- Forberede de poly-ornithine/laminin overtrukne dækglas (i 24-brønds plader) for udpladning af cellerne. Dækglas først renset, og coates derefter med trick-ornithin (ved 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, og opbevaret i en fryser).
Poly-ornithin belægning:- Steriliser dækglassene: Placer dækglassene i enbægerglas indeholdende salpetersyre og ryst i stinkskabet i en time. Hæld salpetersyre, skylles flere gange med deioniseret vand, og lad dækglassene under rindende DI vand i mindst 15 min. Anbring dækglassene i 95% ethanol og enten omrystes i 30 minutter (hvis der anvendes det samme) eller opbevares i ethanol ved stuetemperatur.
- I en steril hætte, hælde indholdet ud i 50 ml rør indeholdende steriliserede dækglas i låget af en 6-brønds plade. Ved hjælp af steriliserede pincetter, tage et dækglas på et tidspunkt og i opslået tilstand i en enkelt brønd i en plade med 24 brønde. Gentag således at hver brønd har et dækglas.
- Efter at de tørre helt, skal du trykke pladerne indtil dækglas er faldet fladt i hver brønd. Næste tilsættes 100 ul poly-ornithin (0,1 mg / ml i sterilt dH2O) til hvert dækglas og inkuber pladerne O / N ved 37 ° C.
- Den næste dag fjernes pladerne fra inkubatoren og lad dem afkøle til stuetemperatur. Aspireres polyornithin ud af hver dækglas (fra kanten af than dækglas) og sørg for ikke at røre eller ridse dækglassene i processen. Tillad dækglassene tørre i cirka 30 min før vask.
- Tilsæt 1 ml sterilt dH2O til hver brønd, lad det sidde i 10 minutter, og der opsuges fra vandet fra hver brønd. Gentag dette vasketrin to gange mere. Efter at pladerne tørre helt, (orlov dækker slukket i hætten) placere låg på, tildækkes med aluminiumsfolie, og opbevares ved -20 ° C.
- At overtrække dækglassene med laminin, 50 gl af en blanding af neural differentiering medium og laminin (slutkoncentration på 20 ug / ml) tilsættes til hver polyornithin behandlet dækglas være omhyggelig med at kun væsken rører dækglasset selv (og ikke spildes off). Inkubere dem ved 37 ° C i 1-2 timer før forberedelse af cellerne til binding.
- Forberede de poly-ornithine/laminin overtrukne dækglas (i 24-brønds plader) for udpladning af cellerne. Dækglas først renset, og coates derefter med trick-ornithin (ved 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, og opbevaret i en fryser).
- Saml og centrifuger neurosfærerne ved 200 x g i 2 min i et 15 ml rør. Aspirer supernatanten. <li>
- Skyl cellerne med DMEM-F12 og centrifuger cellerne igen. Hvis neurosfærer er for store til at vedhæfte ordentligt, kan de adskilles med Accutase på dette trin.
- Hvis der anvendes Accutase: Efter vask af cellerne med DMEM-F12, er neurosfærer dissocieres til små klynger ved tilsætning af Accutase (~ 2 ml) og inkubering af cellerne ved 37 ° C i 3 minutter. Dernæst tilsættes den samme mængde trypsininhibitor (~ 2 ml) og centrifuger cellerne ved 200 x g i 3 minutter. Cellerne bør derefter resuspenderes i NDM og brydes ved anvendelse af en P200 pipette. De små klynger kan derefter udplades på præ-overtrukne dækglas.
- Suges væk størstedelen af mediet og placere cellerne på en 6 cm petriskål i et par dråber af mediet så at markere dem bliver lettere. Tilføj omkring 4-5 neurosfærer til hver præcoatet dækglas. Der er ikke behov for at aspirere fra laminin først.
- Lad neurosfærer vedhæfte i mindst 2-4 timer. Når de har enttached godt, bør mere medium (0,5 ml / dækglas) tilsættes. Det bør bestå af neural differentiering medium suppleret med B27 (1:50), cAMP (1 uM), og neurotrofiske faktorer (BDNF, GDNF, og IGF, alle på 10 ng / ml). På dette tidspunkt halvdelen af mediet kan ændres hver anden dag, og disse celler kan opretholdes i flere måneder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her, til en protokol differentiere humane PSC'er i telencephalic glutamaterge neuroner gennem flere kritiske trin: dannelse af PSC aggregater, induktionen af neuroepitelceller, frembringelsen af telencephalic progenitorer, og den terminale differentiering af disse progenitorer i telencephalic neuroner (fig. 1) har blevet beskrevet. Dette system er robust og effektiv i den generation af telencephalic progenitorer og glutamaterge neuroner. Som et eksempel (fig. 2), uden tilsætning af caudalizing faktorer blev hESCs differentieret i det neurale linie 27. Ved 24 dage efter differentiering var hovedparten af neurale precursorer positive for FOXG1 (en transkriptionsfaktor udtrykkes af telencephalon), men negative for HOXB4 (en markør for baghjerne og rygmarv celler) foreslå telencephalic progenitorer blev med held frembragt (fig. 2D). Disse telencephalic progenitorer p ossess en dorsal fænotype, som indikeret ved ekspression af Pax6 (en markør udtrykt af dorsale progenitorer) (figur 2E), men ikke NKX2.1 (en markør for ventrale progenitorer) (figur 2F). Efter yderligere differentiering, differentieret disse telencephalic dorsale progenitorer til glutamaterge neuroner, som var positive for glutamat markør TBR1 (ca. 80%) 27. Neuroner, der blev farvet positive for TBR1 var også positive for neuronale markører βIII-tubulin (figur 2G) eller mikrotubulus-associeret protein 2 (MAP2, figur 2H). Disse celler udtrykte også vesikulær glutamat transporter 1 (vGLUT1), en markør for modne glutamaterge neuroner, hvilket antyder en effektiv generering af telencephalic glutamaterge neuroner i kultur (fig. 2i).
highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50321/50321fig1.jpg "/>
Figur 1. En skematisk tidslinje for neuronal differentiering proces.
Figur 2. Billeder fremhæver celler i adskillige kritiske trin i neuronal differentiering. (A) Humane sektorråd blev dyrket i 4 dage. Fase billeder, der viser dannelsen af ESC aggregater (B) og neuroepitelceller (C). Ved 24 dage efter differentiering fra hESCs, størstedelen af NE celler var FOXG1 + men HOXB4 - (D). De telencephalic progenitorer (FOXG1 +) var Pax6 + (E), men NKX2.1 - (F) efter 1 måneds differentiering. Efter to yderligereuger (6 uger i alt) for at differentiere cellerne på dækglassene, de fleste af dem farvedes positive for glutamat markør TBR1 (G, H), samt de neuronale markører βIII-tubulin (G) og MAP2 (H). Efter otte ugers differentiering blev cellerne positive for det modne glutamaterg markør, vGLUT1 (I). Scale bars: 100 um (A), 50 uM (BI). (DI er blevet tilpasset fra vores tidligere publikation 27 med tilladelse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kritiske trin i den neurale differentieringsprocessen. Det er vigtigt at sikre, at de humane PSC er pluripotente for ellers cellerne allerede kan være forspændt mod at blive en ikke-neuronal afstamning. Dette kan bekræftes ved farvning af humane PSC'er med antistoffer mod pluripotency markører, såsom Oct4, Sox2, Nanog, og Tra-1-60 1-3. Hvis de humane PSC'er ikke lægger meget godt efter passage dem, kan ROCK inhibitor (Y27632) tilsættes for at hjælpe. For dem har problemer med at holde deres celler pluripotente, er nogle potentielle problemer kvalitet / tæthed af MEF celler, samt masser af KOSR bliver brugt som der kan være variation fra parti til parti. Selv MEF feederceller er blevet anvendt til at opretholde PSC i den ovennævnte protokol, denne fremgangsmåde fungerer også for PSC, der dyrkes ved hjælp feeder-frie systemer.
Når cellerne brydes op til dannelse af PSC-aggregater, er det vigtigt at limdet deres dispase eksponering for kun et par minutter (kanterne vil runde op). Den tid, det tager, før kanterne af iPSCs (op til 10 min) er sædvanligvis længere end de sektorråd (3-5 min). Det er optimalt at tilføje dispase til kun en plade af humane PSC ad gangen for at sikre, at cellerne ikke er i enzymet for længe, da dette kan skade eller endog dræbe celler. Efter cellerne er i PSC samlede fase, er det vigtigt at holde cellerne ved lav densitet. Densiteten er også meget vigtigt, når PSC aggregater er belagt. Disse celler vil ekspandere på pladen i løbet af de næste par dage og der skal tages forholdsregler for at sikre, at de ikke vil røre, efter at de vokse sig større. Under fastgørelsen trin (2,2), er det absolut nødvendigt at sikre, at cellerne ikke har en langvarig udsættelse for FBS, da dette kan påvirke genekspression. Før isolering af neuroepitelceller er det også vigtigt at skrabe på ikke-neuronale klynger med henblik på opnåelse af en mere rencellepopulation. Hvis man ønskede at karakterisere, hvorvidt deres celler går ind i neuronal afstamning, kan forskellige faktorer blive set på som Pax6 eller Sox1. Pax6 tændes omkring dag 10 i løbet af neural differentiering, og Sox1 tændes ved 2 uger efter differentiering 12,26,30.
Denne protokol er på forkant med neural differentiering, da det gengiver mange trin, der finder sted under udviklingen af det menneskelige nervesystem. Uden brug af caudalizing faktorer (retinsyre, basisk FGF), effektivt neuroepitelceller differentiere til telencephalic stamceller, som falder sammen med neuroectoderm celler først erhverve en rostral fænotype under in vivo udvikling 31.. Disse telencephalic progenitorer har en dorsal fænotype skyldes endogen Wnt signalering, der dorsalizes cellerne 27. Dette system genererer dorsale progenitorer, som derefter kan yderligere differentieret i glutamaterge celles. Mens denne celletype er meget vigtig, er det på ingen måde den eneste celletype, at dette system er i stand til at danne. For eksempel har tilsætningen af SHH vist sig at ventralize cellerne, så de kan differentiere til GABAerge celler 27,32. Det blev også vist, at disse hESC afledt GABAerge neuroner kan være transplanteret ind i mus, og at de er i stand til at korrigere lokomotoriske defekter forårsaget af hjernelæsioner 32. Fordi den protokol, som er påvist i denne artikel går gennem trinvise checkpoints, det giver et værktøj til at producere en bred vifte af celler i det menneskelige nervesystem der blot begrænset af vores forståelse af udvikling og vores fantasi.
Evnen til at danne humane neuroner fra PSC åbner et stort antal døre fra både et grundforskning og klinisk perspektiv. Postmortem vævskilder er begrænset, og kvaliteten kan variere, hvorimod human PSC differentiering giver forskerne at give enubegrænset og ensartet forsyning af celler at arbejde med. Med fremkomsten af induceret pluripotente stamcelle (IPSC) teknologi 1,3,33,34 er det nu muligt at få hESC-lignende celler fra patientens fibroblaster herunder med forskellige sygdomme 35-38. Som det fremgår af vores gruppe 28 samt mange andre, har den vellykkede generation af neuroner fra IPSC været og vil fortsat være et unikt og nyttigt værktøj for dem, der længe har efterspurgt menneskelige modeller for sygdom og udvikling. Desuden har adskillige grupper vist, at PSC-afledte neuroner kan modellere visse aspekter af sygdomsprocessen 36,37,39-42 og således kan anvendes til screening af terapeutiske forbindelser 43. Dette er især opmuntrende, da uden et godt modelsystem for at teste lægemiddelkandidater for centralnervesystemet med kun omkring 8% af dem har vist sig at være klinisk effektiv 44. Imidlertid kunne denne metode og andre kan lide det hjælpe til dramatisk at forbedre ther nummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Y. Sasai for gavmildt at give den FOXG1 antistof. Dette arbejde blev støttet af Connecticut Stamcelleforskning Tilskud (08-SCB-UCHC- 022 og 11-SCB24) og Spastisk Paraplegi Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Gibco | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | 10828-028 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 1140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol (14.3 M) | Sigma | M-7522 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) | Sigma | 116K5103 | |
| Laminin (human) | Sigma | L-6274 | |
| Laminin (mouse) | Invitrogen | 23017-015 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Collagenase | Invitrogen | 17104-019 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| ROCK Inhibitor | Stemgent | 04-0012 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Invitrogen | 13256-029 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075 | |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| Foxg1 antibody | Dr. Y. Sasai | ||
| Hoxb4 antibody (1:50) | Developmental Studies Hybridoma Bank | I12 | |
| Pax6 antibody (1:5000) | Developmental Studies Hybridoma Bank | PAX6 | |
| Nkx2.1 antibody (1:200) | Chemicon | MAB5460 | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| vGLUT1 antibody (1:100) | Synaptic Systems | 135302 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | PrepoTech Inc. | 450-02 | |
| Glial derived neurotrophic factor (GDNF) | PrepoTech Inc. | 450-10 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | PrepoTech Inc. | 100-11 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | D-0260 | |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D | 1845-SH | |
| 50 ml tubes | Becton Dickinson (BD) | 352098 | |
| 15 ml tubes | BD | 352097 | |
| 6 well plates | BD | 353046 | |
| 24 well plates | BD | 353047 | |
| T25 flasks (untreated) | BD | 353009 | |
| T75 flasks (untreated) | BD | 353133 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| 6 cm Petri dishes | BD | 353004 | |
| 9'' glass pipetes | Fisher | 13-678-20D | |
| Steriflip filters (0.22 μM) | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) | Millipore | SCGPU10RE | |
| Phase contrast microscope (Observer A1) | Zeiss | R2625 | |
| Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) | Thermo Electron Corporation | ||
| Biosafety hood (Sterilgard III Advance) | The Baker Company | ||
| Centrifuge (5702 R) | Eppendorf |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
- Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
- Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
- Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
- Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
- Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
- Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
- Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
- Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
- Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
- Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
- Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
- Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
- Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
- Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
- Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
- Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
- Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
- Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
- Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
- Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
- Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
- Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
- Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
- Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
- Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
- Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).
