Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Resumo

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Resumo

Interacção de plaquetas e leucócitos activados (sobretudo neutrófilos) no endotélio activado trombose e medeia a inflamação vascular. ^1,2 Durante a formação do trombo no sítio da lesão arteriolar, plaquetas aderentes ao endotélio activado e proteínas da matriz subendotelial suporte de rolamento dos neutrófilos e adesão ^3. Por outro lado, sob condições inflamatórias venulares, os neutrófilos aderentes ao endotélio activado pode suportar a adesão e acumulação de plaquetas circulantes. Agregação de plaquetas de neutrófilos heterotípica requer processos sequenciais pelas interacções específicas do receptor de contra-receptor entre as células. ⁴ Sabe-se que células endoteliais activadas libertar as moléculas de adesão, tais como o factor de von Willebrand, iniciando assim a adesão de plaquetas e acumulação sob condições de alto cisalhamento. ⁵ Além disso, células endoteliais ativadas apoiar rolamento e adesão de neutrófilos por selectinas expressando umad molécula-1 de adesão intercelular (ICAM-1), respectivamente, sob condições de baixo cisalhamento. Platelet ⁴ P-selectina interage com os neutrófilos a P-selectina glicoproteína ligando-1 (PSGL-1), induzindo deste modo a activação de neutrófilos β2 integrinas e firmes a adesão entre dois tipos de células. Apesar dos avanços nas experiências in vitro em que heterotípicas plaquetas de neutrófilos interacções são determinados em sangue completo ou células isoladas, ^6,7 desses estudos não é possível manipular as condições de stress oxidante durante a doença vascular. Neste relatório, utilizando fluorescentemente marcados, os anticorpos específicos contra um rato de plaquetas e neutrófilos marcador, nós descrevemos um protocolo detalhado microscópica intravital para monitorar interacções heterotípicas de plaquetas e neutrófilos no endotélio activado durante TNF-α induzida por inflamação ou seguindo induzida por laser lesão no músculo cremaster microvasos de camundongos vivos.

Protocolo

1. Preparação de microscópio intravital (Figura 1A)

1. Preparar tampão de superfusão (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM _CaCl2, 1 mM _de MgCl2, e 17 mM _de NaHCO3, pH 7,4).
2. Transformar-se num banho de água para manter a temperatura circulatório de tampão e um cobertor de termo-regulado a 37 ° C. Arejar tampão com gás de azoto (5% de CO ₂ equilibrada com azoto).
3. Ligue o sistema de microscópio (Sutter Lambda DG-4 de alta velocidade de onda changer, trabalho com computador, microscópio Olympus BX61W, MPC-200 de multi-manipulador, o ROE-200 controlador de fase, câmera de alta velocidade, e intensificador)....

Resultados

Usando a análise de microscopia intravital detalhada, heterotípicas plaquetas de neutrófilos interações no endotélio activado foram visualizadas por infusão de anticorpos marcados com fluorescência contra uma plaqueta (CD42c) ou marcador de neutrófilos (Gr-1) em murganhos vivos.

Em um modelo de TNF-α induzida por inflamação venular, neutrófilos rolantes foram estavelmente mais aderido ao endotélio, presumivelmente através da interacção de β2 integrinas activadas com ICAM-1 durante o período .......

Discussão

Aqui nós descrevemos um protocolo detalhado em tempo real a microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e trombose. Anteriormente, semelhantes de fluorescência abordagens microscópicas foram relatados para estudar o mecanismo molecular da formação de trombos e de inflamação vascular. ^8,12 Uma vez que a interacção célula-célula heterotípica pode ser importante para a vaso-oclusão no local da lesão.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5
KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7
CaCl2 2H2O	Sigma-Aldrich	10035-04-8
MgCl2 6H2O	Fisher Scientific	7791-18-6
NaHCO3	Fisher Scientific	144-55-8
0,9% NaCl solução salina	Hospira	0409-4888-10
Cetamina	Hospira	0409-2051-05
Xilazina	Lloyd
Intramedic Tubing (PE 90)	BD Diagnostics	427421
Intramedic Tubing (PE 10)	BD Diagnostics	427401
Murine TNF-α	R& D Systems	410-MT
Dylight 488 anticorpo anti-camundongo CD42b marcado com rato	Emfret Analytics	X488
Alexa Fluor 647 anti-camundongo conjugado Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) Anticorpo	BioLegend	108418
NESLAB EX banho-maria/circulador	Microscópio Thermo-Scientific
Olympus BX61W	Olympus
TH4-100 Controlador de	Olympus
Lambda DG-4	Sutter
MPC-200 multi-manipulador	Sutter
R–-200	Câmera
C9300	Hamamatsu
	Scope International
Ablation Laser	Instrumentos Fotônicos, Inc.
SlideBook 5.0	Inovações

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