שיטת תפוקה גבוהה למדידה של קצב סינון הגלומרולרי בעכברים בהכרה

Summary

מדידה של קצב סינון גלומרולרי (GFR) היא תקן הזהב להערכת תפקוד כליות. כאן אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה המאפשרת קביעת GFR בעכברים מודעים באמצעות זריקה אחת בולוס, קביעת isothiocyanate ההעמסה (FITC)-אינולין בפלזמה וחישוב GFR ידי מודל דעיכה מעריכית שני שלבים.

Abstract

המדידה של קצב סינון גלומרולרי (GFR) היא תקן הזהב להערכת תפקוד כליות. נכון לעכשיו, חוקרים לקבוע GFR על ידי מדידת רמת קריאטינין הסמן הביולוגי אנדוגני או יישומי רדיואקטיבי אינולין שכותרת exogenously ⁽³ H או ¹⁴ ג). יש קריאטינין חסרון המשמעותי שהחשבונות טובולרית הפרוקסימלי ל~ 50% מהפרשת קריאטינין כליה מוחלטת ולכן קריאטינין לא GFR סמן אמין. בהתאם לניסוי שבוצע, ניתן לקבוע אישור אינולין ידי הזרקה תוך ורידית או בולוס יחידה עירוי מתמשך (minipump תוך ורידית או האוסמוטי). שתי הגישות דורשות אוסף של פלזמה או פלזמה ושתן, בהתאמה. חסרונות אחרים של אינולין שכותרתו רדיואקטיבית כוללים שימוש באיזוטופים, זמן רב הכנה כירורגית של בעלי החיים, ואת הדרישה של ניסוי מסוף. כאן אנו מתארים שיטה שבה משתמשת בזריקת בולוס בודדת שלisothiocyanate-(FITC) אינולין שכותרת והמדידה של הקרינה שלה ב1-2 μl של פלזמה דילול והעמסת. על ידי יישום מודל דו תא, עם 8 אוספי דם לכל עכבר, ניתן למדוד GFR בעד 24 עכברים ליום באמצעות פרוטוקול זרימת עבודה מיוחד. שיטה זו דורשת הרדמה isoflurane קצרה עם כל דגימות הדם שנאספו בעכבר הלא מרוסן וער בלבד. יתרון נוסף הוא שאפשר לעקוב אחרי עכברים על פני תקופה של מספר חודשים וטיפולים (כלומר עושה ניסויים לזווג עם שינויים תזונתיים או יישומי סמים). אנו מקווים כי טכניקה זו של המדידה GFR היא שימושית לחוקרים אחרים הלומדים בתפקוד כליות עכבר ותחליף שיטות פחות מדויקות של הערכת תפקוד כליות, כמו פלזמה וחנקן האוריאה קריאטינין בדם.

Introduction

קצב היווצרות של הפלזמה ultrafiltrate בglomerulus הפך בסיס להערכת תפקוד כליה (קצב סינון גלומרולרי, GFR). הסמן האידיאלי כדי לקבוע GFR צריך להיות מסונן באופן חופשי, לא מופרש או נספג מחדש ולא עובר מטבוליזם. כגון התנהגות נמצאה להיות אמיתי לאינולין, ואישור אינולין הפך סטנדרט זהב לקביעת GFR ^3. ואילו אישור של קריאטינין נעשה שימוש נרחב כאמצעי של GFR בבני אדם ובעלי חיים, קריאטינין לא למלא את הדרישות של סמן GFR אידיאלי. בסביבות 10 - 40% מפינוי קריאטינין בבני האדם הוא התוצאה של הפרשה טובולרית פעילה ^{1, 11,} ואת הפרשת כליות של קריאטינין היא גם בולטת בעכברים וחולדות ^{4, 7, 9, 22.} פגיעת כלייתית ידועה להגדיל את הפרשת צינורי של קריאטינין אשר מגבילה את הערך שלו כסמן של ^{1 GFR, 2.} אנחנו הראינו כי איזופורם טרנספורטר אניון האורגני בעבר3 (OAT3) תורם להפרשת קריאטינין כליות עכברית ^22. עם זאת, בדרך כלל דורש אישור אינולין השימוש באינולין שכותרתו רדיואקטיבית ⁽³ H או ¹⁴ ג). נחישות רדיואקטיבית של אינולין יכולה לשמש גם בעכברים מורדמים ומודעים, אבל מטפחת את החסרונות של תקנות בטיחות רבות וסוגיות טיפול מחמירות הגלומות בשימוש באיזוטופים רדיואקטיביים. לאורך שורות אלה, הכנות לפינוי כירורגיות קביעת GFR הן זמן רב, כמו גם מסוף בטבע. בשנת 1999 לורנץ ואח'. הציג ¹² FITC-אינולין כסמן של אחת נפרון GFR בעכברים מורדמים. חמש שנים לאחר מכן צ'י et al. נקבע ¹⁵ כל הכליה GFR בעכברים מודעים באמצעות FITC-אינולין. פרוטוקולים אלטרנטיביים כיום באמצעות FITC-אינולין כסמן אקסוגני למדוד GFR בעכברים מודעים ומורדמים. פרוטוקולים אלה לשמר את הרגישות של אינולין רדיואקטיבי באמצעות הקרינה detectiובעקיפה על החסרונות של עבודה עם סמן מסומן רדיואקטיבית. Assay FITC-אינולין שונה על ידי אחרים ^{7, 8} ו ^{22, 23} לנצל את היכולת של microvolume 3300 fluorospectrometer NanoDrop. זה מאפשר להקטין את נפח הדגימה הכולל דרוש ל< דם μl 100 לGFR מדידה.

עם השיטה ופרוטוקול העברת נתונים גבוה סיפק בפרסום זה, אנחנו מדגימים את היתכנות המדידה GFR בעד 24 עכברים מודעים ליום. טכניקה זו יכולה להיות שימושית לחוקרים אחרים הלומדים GFR העכברי ואנו מקווים שהוא יחליף את שיטות פחות מדויקות ככל מדדים לתפקוד כליות, כגון קריאטינין וחנקן אוריאה בדם.

Protocol

1. פתרונות

1. 0.85% NaCl: 8.5 גרם NaCl / 1 ליטר DDH ₂ O (8.5 גר '/ ל').
2. 0.5 HEPES mol / L-pH 7.4 (לפזר 59.6 גרם של HEPES ב0.5 ליטר של DDH ₂ 0 ולהתאים את pH 7.4 באמצעות 10 N NaOH).

2. הכנה של פתרון הזרקת FITC-אינולין

1. שוקל FITC-אינולין להכין 5% פתרון ולהתמוסס ב0.85% NaCl (בדרך כלל 100 מ"ג / 2 מ"ל 0.85% NaCl) על ידי חימום עד 90 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה לחלוטין.
2. שוקל פתרון FITC-אינולין מומס ומשקל פתק.
3. חותכי חתיכה 20 ס"מ של קרום דיאליזה (משקל מולקולרי חתך: 1,000) ולשים בDDH ₂ O למשך 30 דקות כדי להסיר NaN שיורי ₃ מהקרום ולשטוף כמה פעמים לאחר מכן.
4. מלא מומס FITC-אינולין לתוך קרום דיאליזה וחותם כראוי עם סגרים.
5. שוקל קרום דיאליזה כולו.
6. שים את קרום הדיאליזה ב0.85% פתרון 1 L NaCl ומערבבים לאט אור מוגן למשך 24 שעות בroטמפרטורת אום.
7. שוקל קרום דיאליזה כולו שוב ולחשב את הריכוז החדש (מים אוסמוטי יעברו לתוך הקרום וFITC מאוגד, או מחויבים FITC-אינולין <1,000 משקל מולקולרי יהיה לעזוב את הקרום, ולכן הריכוז של FITC-אינולין יקטן באופן משמעותי) .
8. ריכוז FITC-אינולין החדש (ג) מחושב באמצעות נוסחה הבאה: C = n / V, כאשר n = סכום FITC-אינולין ראשוני, V = נפח חדש (הבדל במשקלים של צינורות דיאליזה לפני ואחרי הדיאליזה בתוספת נפח ראשוני פתרון FITC-אינולין).
9. לפני השימוש לעקר פתרון FITC-אינולין dialyzed על ידי סינון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר מזרק.
10. ממשיך FITC-אינולין מוגן מפני אור (רדיד אלומיניום) ב 4 ° C. Dialyzed ומעוקר FITC-אינולין יכול לשמש לתקופה של עד 2 שבועות. השתתף יכול להיות מומס FITC-אינולין מחדש על ידי חימום על 90 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות.

הערה: אם באמצעותFITC-sinistrin ^16-18, אשר אינה דורש דיאליזה, ניתן לדלג את כל הצעדים הנדרשים לדיאליזה.

3. הזרקה ודם אוסף

1. קח את משקל גוף (BW) של העכברים לפני הניסוי.
2. הרדימי עכברים עם isoflurane בקצרה.
3. לתפוקה גבוהה של 6 עכברים בצעו פרוטוקול בלבד באיור 3.
4. הזרק 2 BW μl / גרם של dialyzed FITC-אינולין למקלעת retroorbital ²⁴ באמצעות ½ G30 במחט (להסיר בועות אוויר ממזרק המילטון 100 μl באמצעות ראשון ½ G26 במחט ולאחר מכן לעבור ל½ ה-G30 במחט ל הזרקה).
5. לחתוך 1 מ"מ של זנב עכבר עם מספריים אחת ולאסוף דם בבית 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 ו -75 דקות לאחר ההזרקה בNa-הפרין minicapillaries. חותם minicapillaries לאחר איסוף דם עם צ'ה חותם.
6. שמור דגימות מוגנות מפני אור.
7. שים האטום minicapillaries בתוך המטומכה קריטית נימים וצנטריפוגות במשך 5 דקות.
8. לשבור minicapillaries באמצעות חותך יהלומים וכל פלזמה העברה על ידי pipetting לתוך צינור 0.2 מ"ל.
9. הפוך דילול 1:10 באמצעות 2 μl של פלזמה ו18 0.5 HEPES mol / L μl (pH 7.4) בצינור מ"ל 0.2 החדש (דוגמאות יכולה להיות מאוחסנות הלילה ב 4 מעלות צלזיוס במשך מדידות הקרינה).
10. למדוד 2 μl של דגימה מדוללת עם NanoDrop 3300 בכפילויות. התיאור והשימוש של המכשיר מתואר כאן ^5.

4. הכנת התקנים

1. לאסוף דם מעכברים מאותו הזן ברקע הפרין מצופה המטוקריט נימים, ספין למטה ולדלל 1:10 עם 0.5 HEPES mol / L (pH 7.4), בדרך כלל 80 פלזמה μl + 720 HEPES μl.
2. לדלל פתרון הזרקת FITC-אינולין עם פלזמה עכבר מדוללת כדי לקבל את דילולים הסטנדרטיים הבאים:
   01:10: 10 פתרון FITC-אינולין חי μl + 90 פלזמה עכבר מדוללת μl
   1:100: 10 ומו; פתרון L (1:10) + 90 פלזמה עכבר מדוללת μl
   1:1,000: 90 פלזמה עכבר מדוללת μl פתרון μl 10 (1:100) +
   1:2,000: 30 μl (1:1) פתרון + 30 פלזמה עכבר מדוללת μl
   1:10,000: 40 פלזמה עכבר מדוללת μl פתרון μl 10 (1:5) +
   1:20,000: 20 μl (1:1) פתרון + 20 פלזמה עכבר מדוללת μl
   1:100,000: 40 פלזמה עכבר מדוללת μl פתרון μl 10 (1:5) +
   הריכוז של הסטנדרטים יהיה תלוי בדיאליזה ותמיד יהיה שונה עבור כל הכנת FITC-אינולין. זה הכרחי כדי להיכנס לריכוז לעקומה החדשה הסטנדרטית בכל פעם.
3. לנתח נתונים כדי לחשב GFR עם תוכנה מתאימה (פריזמה GraphPad למשל) באמצעות פונקצית דעיכה מעריכית שני שלבים כפי שתואר כאן ^{ב15, 20} ומוצג בסעיף נציג תוצאות.

Representative Results

GFR יחושב באמצעות נוסחה הבאה:

GFR = n / (A/K1 + B/K2), שבו

n = כמות מוזרקת (n = C C = ריכוז FITC-אינולין, V = נפח מוזרק • V, שם)
= Span1, חיתוך-y של אלימינציה
K1 = ריקבון מתמיד לחיסול
B = Span2, Y-ליירט הפצה
ריקבון = K2 מתמיד להפצה

הערה:, K1, B ו-K2 הם קיצורים שניתנו על ידי פריזמה GraphPad, כל תוכנה מסוגלת לנתח דעיכה מעריכית שני שלבים יכול להיות בשימוש, לעומת זאת, תוכנות מדעיות אחרות עלולות להשתמש בקיצורים שונים.

על ידי שימוש בהתאמת שני שלבי מעריכי ריקבון עקום, שמבוססת על ריכוזי FITC-אינולין פלזמה, יש לקבל את עקומה דומה לזה שמוצג באיור 1. חישוב GFR על ידי נוסחה שהוצגה לעיל (וכפי שמתואר בכאן <sup> 20) מאפשר לזהות ירידת ערך של תפקוד כליות ¹⁵ או hyperfiltration גלומרולרי ^{8, 23} כפי שנמצא בעכברים עם סוכרת מסוג 1 סוכרת (איור 2).

איור 1. כדי למדוד GFR בעכברים מודעים, קינטיקה הפלזמה של FITC-אינולין לאחר הזרקה תוך ורידית אחת במינון משמשת. לחישוב GFR, מודל דו תא הוא מועסק. במודל דו התא, שלב הדעיכה המהיר הראשוני מייצג חלוקה מחדש של FITC-אינולין מתא intravascular לנוזל חוץ התאי. השלב מאוחר יותר, עם דעיכה איטית בריכוז FITC-אינולין, בעיקר משקף אישור מערכתי מהפלזמה.

איור 2. Detection של hyperfiltration סוכרת בעכברים מסוג פראי. סוג אני סוכרת הייתה מושרה על ידי יישום intraperitoneal של streptozotocin (STZ, 50 מ"ג / ק"ג במשך 5 ימים רצופים). GFR נקבע לפני (בסיס) ו 5 שבועות לאחר הגיוס של סוכרת. בשל משוב tubuloglomerular, גידול עיקרי בספיגה חוזרת הפרוקסימלי גורם hyperfiltration הסוכרתי המוקדם ²¹ ממצא שניתן לשחזור בwild-type עכברים (n = 10, p <0.01 בהשוואה לאותו בסיס עכבר).

איור 3. תרשים זרימה למדידת GFR בסט של 6 עכברים. כדי למדוד כל הכליה GFR בשיטת הזרקת בולוס הבית, 8 דגימות דם חייב להיות שנאספו בבית 3, 5, 7, 10 דקות, 15, 35, 56 ו -75 לאחר הזרקת FITC-אינולין. מספרים מצביעים על נקודות זמן. מספרים בסוגריים מציינים את מספר מדגם. נקודות זמן שנותרו מהקו האדום האנכי מעידות הזרקהנקודות זמן (ב 0, 11, 22, 33, 44 ו -55 דקות). כל עכבר מסומן בצבע שונה. כדי לקבל אוספי דם רציפים בצע את החצים. גריי תיבות לציין מתי חייב להיות מוכן העכבר הבא להרדמת isoflurane לפני הזריקה. באמצעות פרוטוקול זה הזמן המינימאלי בין 2 אוספי דם מעכברים שונים הוא 1 דקות.

Discussion

המחקר הנוכחי מתאר טכניקה לקביעת GFR בעכברים בהכרה בזריקה חד בולוס וניתוח של הקרינה ב8 דגימות דם על ידי דעיכה מעריכית שני שלבים. מדידת GFR בעכבר 1 לוקחת 75 דקות. באמצעות תרשים זרימה מיוחד, ניתן למדוד את GFR של 6 עכברים ב -130 דקות. זה ריאלי לחזור על פרוטוקול זרימת תרשים זה עד 4 פעמים ביום ולמדוד GFR ב24 עכברים. אנחנו שונה בשיטה זו, כך שניתן לאסוף את הדם מחיתוך זנב קטן ולא לנקב וריד זנב, שהוא מהיר וקל יותר לחוקרים לבצע השוואה לנקב וריד זנב. באמצעות 10 μl המטוקריט נימים ודילול 1:10, ניתן להפחית את הסכום הכולל של דם לצורך <100 μl. לבסוף, הקרינה נמדדת באמצעות 3300 fluorospectrometer NanoDrop, המאפשר קביעת הקרינה ב1-2 μl של מדגם בדילול מלא. שיטה זו תיתן לי investigato מעונייןערך GFR האמיתי RA. בניגוד לכך, יש לי מדידות קריאטינין בעכברים כמה חולשות, כולל "מגוון עיוור קריאטינין" וקשיים הקשורים לקביעה ספציפית ורגישה. "מגוון העיוור קריאטינין" מגביל את תפקודו כסמן לGFR משום הסרום קראטינין נשאר בטווח הנורמלי עד 50% מתפקוד כלייתי הוא איבד ^19. מאז כמה חוקרים להשתמש בעכברים מהונדסים גנטי במחקר שלהם ללימוד פיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה כליות, זה נושא את הבעיה הבאה: בהנחת שעכבר בנוקאאוט של X גנים תצטרך GFR נמוך באופן משמעותי (ב -40%) בהשוואה לעכבר פראי סוג, הקרנה על ידי השוואה פשוטה הפלזמה קריאטינין לא לזהות את ההבדל הזה. הצורך בשיטה מדויקת טובה של נחישות GFR הופך להיות קריטי יותר קטן יותר את ההבדלים בGFR להיות.

יש עכברי ריכוזים גבוהים של chromagens הלא קריאטינין בפלזמה ובשתן שלהם שמפריעים מסחרימבחני קריאטינין זמינים. כתוצאה מכך, מבחני המבוססים על ריכוז אלקליין picrate יפה תגובת אומדן היתר קריאטינין בפלזמה בהשוואה לביצועים גבוהה כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) ^{6 נחישות, 13.} מגבלה נוספת היא שקריאטינין הוא מתחת מגבלות זיהוי של כמה מבחני זמינים מסחרי בהשוואה לנחישות HPLC. עם זאת, על ידי שימוש בחוקרי תגובות אנזימטיות הצליחו לקבוע הפלזמה קריאטינין ^{ב10 עכברים, 22.}

GFR בטווח דומה נמצאו בעכברים בהכרה בשיטה דומה חד בולוס הזרקה, כמו גם אישור FITC-אינולין ¹⁴ שתן. בניגוד לפרוטוקול שלהם, הפרוטוקול שלנו באמצעות חיתוך זנב אינו דורש אמצעי זהירות מיוחד כדי לשמור על שלמות הכלי בהשוואה לוריד זנב או לנקב וריד saphenous. לאישור שתן / פלזמה מבוססת FITC-אינולין יש צורך להשתיל שני ק"מ האוסמוטי בניתוחnipumps. שתי משאבות הן הכרחיים כדי להשיג ריכוזים גבוהים מספיק מצב יציב פלזמה FITC-אינולין שהם בבירור להבחין מהרקע. הדבר מחייב גם את השימוש בכלובים מטבוליים לאיסוף שתן מלא ומתוזמן. הכלובים צריכים להיות שטף לחשבון להפסד של 25-37% מFITC-אינולין, אשר אחרת מתרחש ללא שטיפה.

את החסרונות של שימוש בשיטת FITC-אינולין זה מוגבלים. חוקרים צריכים להיות מודעים את הדברים הבאים: (i) להבטיח כי אין בועות אוויר במזרק המשמש להזרקה של FITC הפתרון, חייבת להיות מושגת (ii) הזרקת retrobulbar מלאה משום שהכמות המוזרקת קובעת GFR מחושב, ו( iii) עכברים להשתין הסביר ביותר במהלך ניסוי 75 דקות GFR, כך למנוע זיהום דגימות דם עם שתן, שיש לי ריכוז FITC-אינולין גבוה מאוד כתוצאה של יכולת ריכוז הכליות.

o יתרונות כללייםF-שיטת FITC אינולין זה כוללת את הפעולות הבאות: (א) היא טכניקה לא רדיואקטיבי, (ii) ניתן לחזור על מדידות מספר פעמים באותו העכבר, (iii) assay יכול להתבצע בעכברים בהכרה, ( ד) אין צורך באיסוף שתן, ו( V) יכולה להיות מנוצל אפשרות תפוקה גבוהה. חסרונות להזרקת בולוס אחת כוללים את הצורך בדיאליזה של FITC-אינולין, שניתן להתגבר על ידי שימוש בFITC-סמן טוב יותר, FITC-sinistrin, שזמין כעת וניתן למדוד transcutaneously באמצעות מכשיר מיוחד ¹⁸ מיניאטורי. למרות GFR נמדד, לא ניתן למדוד את ההפרשות חלקיות של נוזל או יונים בשיטה זו.

יחדיו, בשיטה זו מספקת את הכדאיות של שיטת תפוקה גבוהה למדידת GFR בעכברים בהכרה. לכן, טכניקה זו עשויה להיות עניין לחוקרים אחרים המתעניייינים בקביעת תפקוד כליה בעכברים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
FITC-inulin	Sigma-Aldrich	F3272
HEPES	Sigma-Aldrich	H7706
Isoflurane	Webster Veterinary	78366551
Dialysis membrane (MWCO 1000)	Spectrum Laboratories	132636
Membrane closure	Spectrum Laboratories	132736
80 μl Hematocrit capillaries	Drummond Scientific	22362566
Hematocrit centrifuge	IEC	Micro-MB
10 μl Na+-Heparin minicaps	Hirschmann	9000210
Syringe (100 μl)	Hamilton	80601
Fluorospectrometer	Thermo-Fisher Scientific	NanoDrop 3300
Filter (0.22 μm)	Spectrum Laboratories	880-26464-UE
Sealant	Châ-seal	510
Needles (G26 ½ and G30 ½)	Becton Dickinson	305111 & 305106