Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

Resumen

Con su pequeño cuerpo transparente y bien documentado neuroanatomía y una serie de técnicas genéticas susceptibles y reactivos, C. elegans Hace que un organismo modelo ideal para In vivo Imagen neuronal utilizando relativamente simples y de bajo costo técnicas. Aquí se describe imagen única neurona dentro de animales adultos intactos utilizando genéticamente codificados indicadores de calcio fluorescente.

Resumen

El gusano nematodo C. elegans es un organismo modelo ideal para relativamente simple, formación de imágenes de bajo coste neuronal in vivo. Su pequeño cuerpo transparente y simple, bien caracterizado sistema nervioso permite la identificación y obtención de imágenes de fluorescencia de cualquier neurona en el animal intacto. Técnicas sencillas de inmovilización con un impacto mínimo sobre la fisiología del animal permitir extendido time-lapse de imágenes. El desarrollo de los fluoróforos de calcio genéticamente codificados sensibles como cameleon ¹ y ² GCaMP permitir la formación de imágenes in vivo de calcio neuronal relacionada tanto fisiología celular y la actividad neuronal. Numerosas cepas transgénicas que expresan estos fluoróforos en neuronas específicas están fácilmente disponibles o se pueden construir utilizando técnicas bien establecidas. A continuación, se describen los procedimientos detallados para medir la dinámica del calcio dentro de una sola neurona in vivo utilizando tanto GCaMP y cameleon. Se discuten las ventajas y disadvantedades de ambos, así como varios métodos de preparación de la muestra (inmovilización animal) y análisis de imagen. Finalmente, se presentan los resultados de dos experimentos: 1) Usando GCaMP para medir la respuesta sensorial de una neurona específica a un campo eléctrico externo y 2) Utilizando cameleon para medir la respuesta de calcio fisiológico de una neurona a daño traumático láser. Técnicas de formación de imágenes de calcio tales como éstos se utilizan ampliamente en C. elegans y se han extendido a las mediciones en los animales que se desplazan libremente, neuronas de forma simultánea y la comparación entre fondos genéticos. C. elegans presenta un sistema robusto y flexible para imágenes in vivo neuronal con ventajas sobre otros sistemas modelo de sencillez técnica y coste.

Introducción

Aquí presentamos métodos prácticos para la formación de imágenes in vivo del calcio en C. Elegans neuronas. El desarrollo de las codificadas genéticamente sensibles calcio-fluoróforos con alta relación de señal a ruido hace C. elegans un sistema efectivo comparativamente sencillo y rentable para la medición de la neurofisiología y la actividad. Nuestra formación de imágenes se realiza con un microscopio compuesto estándar utilizando amplio campo de imágenes de fluorescencia de los fluoróforos disponibles comúnmente. Se presentan varias técnicas que emplean diferentes fluoróforos y preparaciones diferentes de la muestra, discutir la....

Protocolo

1. Configuración óptica

1. El uso de un microscopio compuesto estándar con capacidades de imagen de epifluorescencia. Utilizamos una Nikon Eclipse Ti-U microscopio invertido con un iluminador Intensilight HG.
2. Para una mejor imagen y calidad de la señal utiliza un gran aumento, objetivo gran apertura numérica. Nos suelen utilizar una Nikon X60 1,4 NA objetivo de inmersión en aceite. En algunos casos es posible usar menor aumento (X40, X20) dependiendo del nivel de expresión del fluoróforo y fuerza de la señal.
3. Utilice una alta sensibilidad enfriado cámara CCD, tal como una cámara de Andor Clara para maximizar la sensibilidad de la imagen y ....

Resultados

Aquí se presentan los resultados de dos experimentos separados. El primero emplea GCaMP para medir la respuesta de una neurona sensorial específico a un estímulo externo definido, dando un buen ejemplo de cómo los reporteros fluorescentes de calcio se puede utilizar para controlar ópticamente la actividad neuronal en intacto C. elegans. El segundo emplea cameleon para medir el calcio intracelular transitoria activa dentro de una neurona en respuesta al daño del láser específico, lo que ilustra cómo la fisiologí.......

Discusión

Genéticamente codificados indicadores de calcio se han utilizado ampliamente en C. elegans neurobiología. Numerosos grupos han empleado estas técnicas para estudiar la respuesta de las neuronas sensoriales primarias a estímulos externos como se demuestra aquí con la respuesta ASJ a un campo eléctrico. Ejemplos destacados incluyen sensación del tacto mecánico, productos químicos específicos, la temperatura y un campo eléctrico ^{12, 16-19.} Actividad de interneuronas y células musculares también han sido.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio Eclipse Ti-U invertido	Nikon
Intensilight HG Iluminador	Nikon	C-HGFI	Fuente de luz fluorescente
CFI Plan Apo VC 60X Óleo	Nikon
Mesa óptica o placa de pruebas de grado óptico 3'X3	Thor Labs		Si no se utiliza una mesa óptica placa de pruebas de grado óptico en una mesa < laboratorio sólida > debería ser suficiente.
Cámara interlínea Clara	Tecnología Andor		Cámara CCD de alta sensibilidad
wtGFP Longpass Emission	Chroma Technology Corp.	41015	Juego de filtros GFP para la adquisición de imágenes GCaMP
Filter 440 +/- 10 nm	Chroma	D440/20x EX	para cameleón
Espejo dicroico > 455 nm paso largo	Chroma	455DCLP BS	Microscopio dicroico para imágenes de cameleon
Espejo dicroico > 515 nm paso largo	Chroma	515DCLP BS	para cameleon Filtro de imagen
535 +/- 15 nm	Chroma	D535/30m Filtro	de emisión EM YFP
Filtro 480 +/- 20 nm	Chroma	D485/40m Filtro	CFP
Lente, 200 mm, Acromático	Thor Labs	AC508-200-A1	Lente de relé para óptica FRET (3)
Espejo de banda ancha plateado	Thor Labs	ME2S-P01	Óptica FRET (2)
Tampón
Levamisole	Sigma
Polybead Microesferas	Polysciences, Inc.	08691-10, 2,5% por volumen, 50 nm de diámetro	nanopartículas de poliestireno para C. elegans inmovilización
Cepa transgénica, Cepa gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg)	Sternberg Lab	Strain PS6388
Cepa transgénica, mec- 4::YC3.60	Gabel Lab	Strain CG1B

' Filtro de excitación Espejo dicroico de emisión EM NGM