我们在此介绍一种准确、可重复且便捷的生化方法，用于糖原的滴定 体外该技术采用Abcam糖原检测试剂盒，基于将糖原逐步水解为葡萄糖，并通过荧光法测定葡萄糖含量。
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本文内容
摘要
摘要
糖原是脊椎动物体内葡萄糖的主要储能聚合物，在整体机体代谢和细胞代谢中均发挥关键作用。目前已存在多种检测糖原的方法，但仅有少数具备定量能力。本文介绍一种采用Abcam糖原检测试剂盒的方法，该方法基于糖苷淀粉酶特异性将糖原降解为葡萄糖。随后，葡萄糖被特异性氧化为一种产物，该产物与OxiRed探针反应生成荧光信号。该滴定法准确、灵敏，可用于细胞提取物或组织切片。然而，与其他技术相比，该方法无法提供糖原在细胞内分布的信息。作为该技术的应用示例，本文描述了在常氧（21% O2）与低氧（1% O2）条件下培养的两种细胞系——中国仓鼠肺成纤维细胞CCL39和人结肠癌细胞LS174中糖原含量的测定。我们假设低氧是一种信号，可促使细胞合成并储存糖原以维持生存1。
引言
糖原是由葡萄糖残基组成的多分支聚合物，存在于多种细胞类型的细胞质中。它是细胞内主要的能量储存形式之一，在葡萄糖代谢中发挥重要作用。大多数哺乳动物细胞均能合成并储存糖原，可在代谢应激期间迅速降解为葡萄糖，以促进糖酵解和ATP的生成。肝细胞可大量合成糖原，通过调节血糖水平，为机体持续提供葡萄糖。相比之下，其他细胞（如肌肉细胞、红细胞）中的糖原浓度较低， 等等。相对较低。然而，在局部范围内，这些数量足以提供能量 短期暴露于营养缺乏环境时，细胞会受到突然影响。
糖原合成与糖原分解在所有组织中遵循相同的步骤图1首先，葡萄糖通过葡萄糖转运蛋白（GLUTs）进入细胞，并由磷酸葡萄糖变位酶迅速将葡萄糖-6-磷酸（G6P）转化为葡萄糖-1-磷酸（G1P）。随后，G1P被修饰为UDP-葡萄糖，UDP-葡萄糖的C1碳原子连接到糖原蛋白（glycogenin）——糖原的锚定蛋白——的酪氨酸残基上。这一分子被视为糖原引物，通过将UDP-葡萄糖连接到引物末端葡萄糖的α(1→4) 键合 通过 糖原合成酶。最后，当形成一条含有超过11个葡萄糖残基的线性链时，分支酶会将至少由6个葡萄糖残基组成的末端寡糖链通过α(1→6)糖苷键转移至邻近链上的另一个葡萄糖残基上。这一过程的重复进行形成具有大量分支的分形结构，其....
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方案
糖原的生化滴定
1. 细胞裂解
- 以每100 mm直径培养皿0.5–2 × 106的浓度接种细胞。
- 处理：将细胞在低氧浓度（缺氧）条件下于厌氧工作站（Bug-Box anaerobic work station，Ruskinn Technology Biotrace International Plc，Bridgend，UK）中培养24、48或72小时，气体环境设置为1%或0.1% O2、94%或94.9% N2以及5% CO2。同时，将对照组细胞置于常氧条件（21% O2，5% CO2）下培养。每24小时更换一次培养基（含25 mM葡萄糖的培养基），以尽量减少实验期间葡萄糖浓度的变化。
- 处理结束后，用PBS洗涤细胞2次，以去除培养基中残留的葡萄糖。用预冷的PBS刮取细胞。
- 将细胞悬液在1,000 rpm下离心5分钟，弃去上清液，并用PBS洗涤沉淀一次。沉淀物可在继续实验前于-20 °C冷冻保存。
- 将沉淀重悬于100 μl蒸馏水中。加入Glycogen Assay Kit（Abcam）提供的100 μl糖原水解缓冲液。将裂解液在95 °C下煮沸5分钟，以灭活酶活性。
- 涡旋振荡后，在13,000 rpm下离心10分钟，去除不溶性物质....
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结果
肿瘤中的低氧水平（缺氧）会向肿瘤细胞发出信号，提示其需要储存能量以应对后续的营养耗竭，从而维持生存。由于糖原是哺乳动物细胞中葡萄糖主要的能量储存多聚体，我们研究了缺氧条件下糖原储存的调控机制。细胞裂解液中糖原浓度的计算与标准化必须基于荧光原始数据进行，如表1、表2和表3所示。生化糖原检测证实，在CCL39细胞的电子显微照片中观察到的电子致密聚集体（图2A）即为糖原颗粒（图2B）。缺氧条件下糖原的积累依赖于缺氧诱导因子-1（HIF-1）这一转录因子，HIF-1是细胞适应缺氧过程中的主要转录调控因子（图3）。最后，我们在多种癌细胞和非癌细胞系中证明，储存的糖原可在6小时内被细胞迅速代谢（图4A），并且在葡萄糖饥饿条件下，糖原的利用可保护细胞免于死亡（图4B）1。
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讨论
糖原的生化滴定 体外 可实现对细胞糖原含量的精确定量。相较于其他一些技术（PAS染色、使用糖原抗体的免疫荧光染色）， 等等然而，该滴定法具有高度特异性、灵敏性和可重复性。此外，该方法操作便捷，无需使用放射性物质，仅需荧光分光光度计即可完成。但该技术仅为定量分析，无法提供细胞内糖原分布的信息。
本文所述技术适用于细胞提取物，但通过适当的组织糖原提取方法，也可应用于组织切片。该检测用于 体外 应用，且由于糖原的测定是间接的（水解为葡萄糖后测定），因此无法用于动态监测糖原储存情况 体内.
PAS染色已广泛用于诊断多种糖原累积病（von Gierke病、Cori病、McArdle病）， 等等。也可用于检测真菌感染或区分不同类型的肿瘤亚型。理论上，过碘酸-雪夫染色（PAS染色）可与图像分析仪联用以测定糖原浓度。然而在实际操作中，该技术难以实施，且相较于本文所述方法存在以下不足：首先，PAS阳性染色（紫红色）与阴性染色（苏木精-蓝色）存在颜色重叠，技.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢 Thierry Pourcher 博士允许我们使用荧光分光光度计并提供帮助。本实验室获得以下机构资助：法国抗癌联盟（认证研究团队）、抗癌研究协会、法国国家癌症研究所（INCa）、法国国家科研署、METOXIA（欧盟第七框架计划）、A. Lacassagne 中心、法国国家科学研究中心、法国国家健康与医学研究院以及尼斯大学（http://www.unice.fr/isdbc/）。我们感谢 M. Christiane Brahimi-Horn 博士对本文的审阅和编辑校正。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| 糖原检测试剂盒 | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| 仪器 | |||
| 荧光分光光度计 | PerkinElmer | LS 50B |
参考文献
- Pelletier, J., et al. Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival. Front Oncol. 2, (2012).
- Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. A new look at the biogenesis of glycogen. FASEB J<....
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