Summary
Nous avons cherché à déterminer les concentrations tolérables de trois acides gras (acides oléique, linoléique et linolénique) et la toxine du choléra qui n'a pas incidence défavorable importante sur la survie des cellules de solubiliser les acides gras et les toxines et leur utilisation dans des essais de survie cellulaire.
Abstract
Le rôle positif des acides gras dans la prévention et la lutte contre les maladies non humains et humains ont été et continuent d'être largement documentés. Ces rôles incluent influences sur les maladies infectieuses et non infectieuses, y compris la prévention de l'inflammation, ainsi que l'immunité des muqueuses aux maladies infectieuses. Le choléra est une maladie intestinale aiguë causée par la bactérie Vibrio cholerae. Il se produit dans les pays en développement et si elle n'est pas traitée, peut entraîner la mort. Bien qu'il existe des vaccins contre le choléra, ils ne sont pas toujours efficaces et d'autres méthodes de prévention sont nécessaires. Nous avons cherché à déterminer les concentrations tolérables de trois acides gras (acides oléique, linoléique et linolénique) et la toxine du choléra en utilisant respectivement souris BALB / C macrophages et les cellules épithéliales intestinales humaines. Nous SOLUBILISE les acides gras ci-dessus et des essais de prolifération des cellules utilisées pour déterminer les gammes de concentration et les concentrations spécifiques des acides gras qui ne sontt préjudiciables à la viabilité des cellules épithéliales intestinales humaines. Nous SOLUBILISE toxine cholérique et utilisé dans un essai pour déterminer les gammes de concentration et les concentrations spécifiques de la toxine cholérique qui ne sont pas statistiquement diminue la viabilité des cellules dans des souris BALB / C macrophages.
Nous avons trouvé les concentrations d'acides gras optimale à entre 1-5 ng / ul, et que pour la toxine cholérique être <30 ng par traitement. Ces données peuvent aider les futures études visant à trouver un rôle muqueuse protectrice pour les acides gras dans la prévention ou l'atténuation des infections de choléra.
Introduction
Les avantages pour la santé des acides gras comme l'acide oléique, linoléique et linolénique ont été et continuent d'être documentés. Par exemple, l'acide oléique permet de faciliter la pénétration des médicaments lipophiles dans l'1,2 corporel, réduit de maladie coronarienne de 24% lorsqu'ils sont substitués pour les acides gras saturés 3, et est utilisé pour traiter les maladies métaboliques telles que l'adrénoleucodystrophie 4 qui est un lié à l'X trouble génétique du métabolisme des acides gras. . Même si un précurseur nécessaire pour l'acide arachidonique chez les mammifères, l'acide linoléique (contrairement à l'acide oléique) n'est pas synthétisée par l'organisme et doit être obtenue par des sources extérieures telles que la consommation de graines de lin 5 études montrent plusieurs effets bénéfiques sur la santé de l'acide linoléique telles que: propriétés anti-âge pour la peau; 6 propriétés anti-inflammatoires; 7 prolifération réduite des cellules carcinome colorectal et de la prostate; 8 et la capacité de lutter contre l'obésité et la promotion o9 acide linolénique f de la santé cardiovasculaire. joue un rôle dans la réduction de l'inflammation du parodonte, thromboxane 10 et la modulation et la biosynthèse de la prostacycline. 11
Arpita 12 a étudié l'influence des acides gras biliaires et du cholestérol sur V. expression des facteurs de virulence et la motilité de l 'cholerae. Yamasaki 13 a indiqué que l'extrait de méthanol à partir de piments rouges et d'autres composés naturellement extraites, peut potentiellement diminuer la production de la toxine du choléra. Il est concevable d'envisager l'utilisation de produits alimentaires qui sont riches en acides gras ci-dessus (comme les graines de lin) dans la prévention et la lutte contre des maladies infectieuses telles que le choléra en offrant une immunité mucosale. Nous avons mené des enquêtes pour solubiliser les acides gras et de déterminer, en utilisant des tests de prolifération cellulaire, la concentration maximale d'acides gras que les cellules épithéliales intestinales humaines peuvent tolérer sans effets néfastes sur la CEll viabilité. Nous avons supposé que les acides oléique, linoléique et linolénique ont un effet bénéfique sur la viabilité cellulaire à des concentrations plus faibles, mais que des concentrations plus élevées ils vont être toxiques pour les cellules. Nous avons également SOLUBILISE la toxine cholérique et déterminé la concentration maximale de la toxine cholérique qui BALB / C macrophages de souris peuvent tolérer sans une diminution significative de la viabilité cellulaire. Nous émettons l'hypothèse d'un effet toxique de la toxine cholérique sur la viabilité des cellules, même à très faible niveau. La méthode de solubiliser une toxine cholérique et l'utiliser pour déterminer le montant maximum de la toxine que les cellules peuvent tolérer sans une diminution significative de la survie constitue un avantage pour les études futures. Par exemple, une combinaison des méthodes ci-dessus peut être utilisé pour déterminer si les acides gras fournissent des cellules de l'immunité des muqueuses contre les infections de choléra. Au meilleur de notre connaissance, cette méthodologie rationnelle et n'a pas été explorée.
Nous discuss comment nos données préliminaires peuvent être utilisés dans de futures investigations afin de déterminer si les acides oléique, linoléique et linolénique fournir des cellules de l'immunité muqueuse contre l'infection par le choléra.
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Protocol
1. Tissue Culture
- Utilisez Mus musculus macrophages (BALB / c) pour les déterminations de la toxine du choléra. Initialement culture tout de M. cellules musculus en suivant les instructions du fournisseur.
- Propager BALB / c cellules de souris dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco avec L-glutamine complété avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% 1640 de base antibiotique / antifongique ou RPMI complété avec 10% de sérum de veau foetal, 5% de L-glutamine et 1 % réactif antibiotique / antifongique.
- Cultiver les cellules dans 75 cm 2 Corning flacons avec des bouchons ventilés à 37 ° C, 95% d'air et 5% de CO 2.
- Amener les cellules épithéliales intestinales humaines dans les 24 heures de la livraison que les instructions du fabricant pour la détermination des déterminations d'acides gras.
- Propager les cellules épithéliales intestinales humaines en 75 cm 2 Corning flacons avec des bouchons ventilés dans les médias HybriCare complété avec 10% de FBS et 30 ng / ml d'EGF humain à 37 ° C. Ne pas utiliser des antibiotiquesRéactifs / antimycosiques selon les instructions du fabricant.
- Fractionner les cellules (1:3) à la confluence d'environ 70%.
- Congeler et mettre en place toutes les cellules tout au long de l'étude en utilisant des protocoles de congélation standard.
- Note: Pour la détermination de la concentration plus grande échelle des acides gras, utilisez la croissance plus rapide, plus facile à entretenir, les macrophages de souris initialement. Pour la détermination de la concentration d'acides gras à fine échelle, utiliser des cellules épithéliales humaines. Utilisez des macrophages de souris pour tous les traitements de la toxine cholérique (voir discussion).
2. Acides gras et des traitements de la toxine cholérique
- Transfert acides oléique, linoléique et linolénique de la compagnie fournis par des ampoules de verre dans des flacons en verre stérilisés.
- Transférer chaque acide gras dans un tube Eppendorf stérile séparée et dissoudre d'abord dans l'éthanol à 100% à une dilution de 1:6, puis en milieu RPMI 1640 incomplètes pour une concentration finale de 10 pg / pl.
- Vortex chaque solution et transfer à des flacons en verre pour le stockage dans le congélateur (-20 ° C).
- Cellules de la plaque au niveau des cellules 2500 / puits dans 96 des plaques de culture de tissus ainsi.
- Ajouter le média complètes appropriées pour porter le volume total du puits de 200 pi pour le traitement des cellules avec des acides gras dans la préparation pour les tests MTT.
- Après une période de prolifération 24 heures, retirez le support et remplacez-le par du milieu frais.
- Ajouter les concentrations appropriées de chaque acide gras à tester dans les puits (voir les résultats). Ajouter des milieux complets pour amener les volumes nombre total de puits de 200 pi.
- Incuber les plaques traitées pendant 24 heures avant de commencer le test MTT.
- Dissoudre la toxine du choléra dans du PBS à une concentration de 1 mg / ml et aliquote de la solution dans cryovials et stocker les flacons cryogéniques à 2-8 ° C.
- Pour les traitements de cellules, diluer la toxine 1:100 dans du PBS stérile (pH 7,4) ou incomplet du DMEM pour une concentration de travail finale de 1 ng / ul.
- Pour traiter les cellules avec la toxine du choléra danspréparation pour les tests MTT, les cellules de la plaque comme décrit ci-dessus.
- Après une période de prolifération 24 h, ajouter les concentrations appropriées de la toxine cholérique (pour nos concentrations, voir les résultats) à tester dans les puits en suivant les procédures utilisés dans les applications d'acides gras (ci-dessus).
- Incuber les plaques traitées pendant 24 heures avant de commencer le test MTT.
- En (c positif tout le papier) positive et négative de contrôle (négatif c), à la fois d'acides gras et les traitements de la toxine du choléra, les cellules incuber avec du milieu complet et l'éthanol à 70%, respectivement.
- Pour tous les échantillons et les traitements utilisent un minimum de trois répétitions (n = 3), avec plus de répétitions pour les contrôles positifs (n = 6 dans cette étude).
3. MTT
- Faire une solution de MTT à une concentration de 2,5 mg / ml.
- Retirez la solution dans chaque puits de la plaque de 96 puits à tester et remplacez-le par 200 pi de solution média complète fraîche.
- Annonced 10 pl de la solution MTT à chaque puits.
- Incuber la plaque à 37 ° C pendant 3-4 heures.
- Jeter la solution des médias et ajouter 100 ul de 0,04 M HCl dans l'isopropanol à chaque puits.
- Incuber la plaque à la température ambiante pendant cinq minutes.
- Transvaser la solution à partir de chaque puits pour un nouveau tube de centrifugation.
- Centrifuger à 20000 x g, à température ambiante, pendant 1 min, ou jusqu'à ce qu'un culot a été formé.
- Transfert entre 20-40 pi de chaque échantillon à un lecteur de microplaques.
- Lire l'absorbance à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.
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Representative Results
Détermination de la concentration optimale en acides gras
La concentration optimale d'acides gras est définie comme étant la concentration maximale à laquelle la croissance des cellules est comparable ou supérieure à celle des cellules de contrôle, avec relativement faible variabilité des résultats. Pour déterminer la concentration optimale d'acide oléique, les cellules des acides linoléique et linolénique ont d'abord été traités avec des concentrations variables de chaque acide gras en grandes tranches et plus tard avec petits incréments. Figure 1 montre la survie des cellules dépeint comme une fonction du contrôle positif pour les traitements à l'aide des concentrations croissantes d'acides gras. Il est évident que les cellules ne tolérer des concentrations supérieures à 100 ng / pl pour l'un des acides gras. A une analyse de la variance a montré que pour chacun des traitements, un ou plusieurs des moyens sont différents des autres (p <0,001). Un test post-hoc (Tukey) a montré que l'acide oléique pour tous les traitements saufle 1 ng / ul étaient différents de contrôle positif. Fait intéressant, en raison de la forte variabilité, ce traitement était légèrement pas significativement différente de contrôle négatif non plus. Pour les acides linoléique et linolénique fois, une analyse de la variance a montré qu'au moins une moyenne est différente de celle des autres (p <0,001). Post-hoc Un test de Tukey a révélé que la moyenne du traitement de 10 ng / ul pour chaque acide gras n'est pas significativement différent du témoin positif, mais sont issus du contrôle négatif (p <0,05).
Cette expérience a été répétée à des concentrations qui étaient inférieurs à 100 ng / ul, par incréments de 10 ng / pl (jusqu'à 70 ng / ul, en utilisant des cellules épithéliales humaines). La survie des cellules est prévu pour chaque concentration dans la figure 2. Pour l'acide oléique (Figure 2a), une analyse de la variance a montré que l'un ou plusieurs des moyens étaient différents (p <0,001). Cependant, il n'y a que les traitements à des concentrations plus élevées (40 et 50ng / ul) qui rendait dire statistiquement différente de celle du témoin positif. Fait intéressant, les différences observées sont dues à une augmentation de la viabilité cellulaire (avec une plus grande variabilité, figure 2a). Une analyse de la variance a donné des résultats similaires pour les acides linoléique et linolénique. En particulier, aucun des moyens de traitement étaient différents de la moyenne du contrôle positif. Une fois de plus, la variabilité semble augmenter pour certains des concentrations plus élevées (figures 2B et 2C).
Détermination de la concentration optimale de la toxine cholérique
La concentration optimale pour la toxine cholérique est définie comme la concentration à laquelle la viabilité cellulaire n'est pas affectée ou commence juste à décroître par rapport aux cellules non traitées. Pour évaluer la concentration minimale de toxine cholérique qui diminue au minimum la viabilité des cellules, les cellules ont d'abord été traités avec des concentrations variables de la toxine du choléra dans les grandes incrémentalests et plus tard avec des incréments plus petits Figure 3a montre une tendance à la diminution de la viabilité de la survie des cellules à la suite de traitements de la toxine cholérique pour les niveaux de toxines à des niveaux relativement grands incréments (entre 100-1000 ng, R 2; = 0,5436).. Comme prévu, la viabilité des cellules varie considérablement pour chaque traitement (Figure 3a). La grande variabilité observée dans viabilité n'a pas entraîné de différence significative entre la moyenne de notre contrôle positif à l'un des traitements (ALLER ANOVA). Sur la base de ces résultats, nous avons déterminé que les niveaux de toxine <100 ng doit être testé plus loin. Figure 3b montre la viabilité des cellules pour les traitements de niveau de toxines plus petits. La viabilité cellulaire est très variable pour presque toutes les concentrations de toxines, mais de légères hausses ont été observées dans la viabilité à la suite des traitements. Ces hausses (Figure 3b) ne sont pas statistiquement significatives pour aucune des traitements par rapport à la moyenne du contrôle positif (une analyse de la variance, Tukey).
Figure 1. La détermination des concentrations d'acides gras utilisables:. Effet de différentes concentrations d'acides gras en assez grandes tranches (100-1000 ng / ul) pour l'acide oléique, l'acide linoléique et linolénique Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Échelle fine de détermination de la concentration d'acides gras:. Cellules épithéliales intestinales Effets de différentes concentrations d'acides gras dans les petits incréments (10 ng / ul) sur la survie des cellules épithéliales intestinales humaines ont été traitées avec varyiLes concentrations ng d'acide oléique (a), de l'acide linoléique (b) et l'acide linolénique (C). Le contrôle positif est les cellules traitées avec des milieux complets seulement, et le contrôle négatif avec 70% d'éthanol. Pour chaque essai, n = 3 pour tous les traitements sauf contrôle positif (n = 6). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Détermination de la concentration de la toxine cholérique utilisables fondées sur l'évaluation de l'application de diverses concentrations de toxine cholérique sur macrophages de souris survie:. Macrophages de souris ont été traitées avec différentes concentrations de toxine cholérique par paliers plus importants (a) puis les petits (b) Le contrôle positif est cellules traités avec des milieux complets seulement, et le négatif control avec 70% d'éthanol. Pour chaque essai, n = 3 pour tous les traitements sauf contrôle positif (n = 6). Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. Experimental design détermination de l'acide gras approprié et les concentrations de toxines pour une utilisation dans de futures études: lysats cellulaires peut être utilisé pour traiter les macrophages et les dynamiques de cytokines peuvent être qualitativement et quantitativement analysés par immuno et ELISA utilisant des anticorps contre des cytokines spécifiques comme marqueurs de l'infection.
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Discussion
Suggestion de concentration des acides gras et la toxine du choléra
Bien que le mécanisme exact de la façon dont les acides gras améliorent l'immunité muqueuse est inconnue, plusieurs études ont tenté d'étudier leurs effets bénéfiques. Notre étude vise à fournir une méthodologie pour déterminer la concentration maximale d'acides gras que les cellules peuvent tolérer ainsi que la concentration maximale de la toxine cholérique que les cellules peuvent tolérer sans une influence significative sur la survie cellulaire.
Pour déterminer la concentration des trois acides gras (acide oléique, linoléique et linolénique), ainsi que celle de la toxine du choléra pour le traitement des cellules sans effet néfaste très significatif sur la viabilité des cellules on solubilise les acides gras et de la toxine du choléra et des cellules en culture de tissus traités pour différentes concentrations suivies par un test MTT pour évaluer la viabilité. Sur la base de notre méthodologie et les résultats que nous offrons varie d'acides gras et la toxine du choléra utilefutures enquêtes qui visent à utiliser ces acides gras ou la toxine du choléra (voir ci-dessous). Nous recommandons des concentrations de 1, 5-10 et 5-10 (ng / ul) pour l'acide oléique, l'acide linoléique et linolénique, respectivement, l'utilisation des cellules épithéliales intestinales humaines. Nous recommandons également l'utilisation de <30 ng (par 200 pi, voir méthodes) de la toxine cholérique utilisant BALB / C macrophages de souris. Nous reconnaissons que, au moins pour la toxine cholérique, aucune différence significative n'a été observée entre la viabilité cellulaire pour le contrôle positif par rapport aux traitements. Cependant, notre recommandation est basée sur la variabilité relativement élevée de la viabilité cellulaire qui a été observé à la suite d'expositions au niveau de toxines plus élevé.
Future Studies
Les données présentées dans cette étude pour les acides gras et les niveaux de toxine du choléra peuvent être utilisés dans de futures études. Nous fournissons un exemple d'une telle enquête ici.
Choléra est une maladie associée à devles pays qui n'ont pas les eaux usées appropriée et les usines de traitement de l'eau et de l'eau potable s'enfuyant. En 2009, un nombre de morts de plus de 3000 a été signalé pour une période de cinq mois en raison de symptômes liés au choléra au Zimbabwe seul. 14 En 2011, le choléra reste une épidémie dans les différentes régions du monde, notamment une épidémie en Haïti (CDC, 2010) . Une étude génétique moléculaire en 2010 a montré la preuve que la bactérie dans cette épidémie est d'origine népalaise. 15 La maladie est causée par l'ingestion d'aliments ou d'eau potable contaminée par les selles et la colonisation de l'intestin par V. cholerae, suivie par la libération d'une entérotoxine. Alors que la vaccination de choléra existent, ils ne sont pas toujours efficaces pour prévenir l'infection pendant les flambées. Des interventions efficaces et peu coûteux sont nécessaires pour les populations où les épidémies de choléra se produisent. Une approche consiste à étudier si les sources alimentaires qui sont riches en produits dérivés tels que les acides oléique, linoléique et linoléniqueassurer ou renforcer l'immunité muqueuse contre l'infection du choléra. Fonctions de l'immunité mucosale par l'utilisation de récepteurs de protéines présentes à la surface des cellules, tels que les récepteurs Toll-like (TLR 16) et des domaines de fixation des nucléotides (NLR). Grâce à des changements dans la composition de la membrane et la libération des ligands qui interagissent avec les récepteurs TLR et NLR, l'ajout d'acides gras à l'épithélium intestinal peut améliorer la fonction du récepteur dans la reconnaissance des microbes dangereux et recruter les réponses immunitaires appropriées. Pour déterminer les effets gras d'acides sur l'infection par le choléra, la dynamique de cytokines, telles que la libération de la cellule de TNF-α, IL-6, IL-10 et IL-12, doivent être étudiées davantage dans les cellules épithéliales intestinales humaines que dans les macrophages de souris (figure 4). Une telle connaissance de futures études nous aideront à mieux comprendre le mécanisme par lequel les acides gras pourraient travailler à prévenir l'infection, afin de fournir en fin de compte des interventions efficaces pour inhiber la colèreun des foyers. Il est possible que le traitement des cellules avec des acides gras avant l'infection de la toxine du choléra va aider à induire et / ou augmentent la réponse immunitaire de la muqueuse de l'épithélium intestinal, augmentant finalement la viabilité des cellules au cours de l'infection microbienne choléra.
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Disclosures
Les auteurs de cette étude n'ont aucun intérêt financier à partir des résultats de cette étude. Le financement de cette étude a été fourni à FT par l'Université de Kean, mais FT est actuellement employé à Kingsborough Community College.
Acknowledgments
Nous remercions Paula Cobos et le Dr Evros Vassiliou à l'aide de laboratoire et de fournir les macrophages de souris, respectivement. Nous remercions également notre laboratoire directeur Richard Criasia de conseils et d'aide avec les matériaux. Enfin, les auteurs remercient Ramanpreet Kaur de l'aide à la production vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagent | |||
| Mus musculus macrophages | ATCC | ATCC RAW 264.7 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | ATCC | 30-2002 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2115 | |
| Fetal bovine serum | Bio-west | S0250 | |
| Antibiotic/antimycotic | Hyclone | SV3007901 | |
| Human intestinal epithelial cells | ATCC | ATTC CCL-241 | |
| HybriCare media | ATCC | 46-X | |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L-1376 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L-2376 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Equipment | |||
| BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates | BD Biosciences | 351172 | |
| Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software | Dynex | 91000101 | |
References
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