Summary
我々は大幅な悪影響脂肪酸と毒素を可溶化し、細胞生存率アッセイでそれらを使用することによって、細胞の生存に影響を及ぼさなかった3脂肪酸（オレインリノール酸およびリノレン酸）とコレラ毒素の許容濃度を決定するために設定してください。
Abstract
非ヒトとヒトの疾患の予防や緩和に脂肪酸の積極的な役割があっと広範囲に文書化され続けてきた。これらの役割は、炎症の予防だけでなく、感染症に対する粘膜免疫を含む感染と非感染性疾患への影響が含まれています。コレラは細菌コレラ菌によって引き起こされる急性の腸の病気です。それは発展途上国で発生し、放置すれば、死に至ることができます。コレラのためのワクチンは存在するが、それらは必ずしも有効と他の予防方法が必要とされているではありません。我々はそれぞれ、マウスBALB / Cマクロファージおよびヒト腸上皮細胞を使用して、3つの脂肪酸（オレインリノール酸およびリノレン酸）とコレラ毒素の許容濃度を決定するために設定してください。我々は、濃度範囲であると無脂肪酸の特定の濃度を決定するために、上記の脂肪酸および使用される細胞増殖アッセイを可溶化ヒト腸管上皮細胞の生存率に有害トン。我々は、コレラ毒素を可溶化し、統計的にBALB / Cマクロファージにおける細胞生存率を低下させない濃度範囲およびコレラ毒素の特定の濃度を決定するためのアッセイでそれを使用した。
我々は1-5 ngの/μlの間になるように最適な脂肪酸濃度を発見し、そして、それは、コレラ毒素の治療あたり<30 ngのように。このデータは、予防またはコレラ感染の緩和中の脂肪酸の保護粘膜の役割を見つけることを目指して今後の研究を支援することがあります。
Introduction
オレイン酸、リノール酸やリノレン酸などの脂肪酸の健康上の利点は、き、文書化され続けてきた。例えば、オレイン酸は、ボディ1,2における親油性薬物の浸透を促進するのに役立ち飽和脂肪酸3に代入するとき24％冠状動脈性心臓病を低減し、X-連結されるよう副腎4などの代謝性疾患を治療するために使用される脂肪酸代謝の遺伝性疾患。 。哺乳類におけるアラキドン酸、リノール酸（オレイン酸とは異なります）のために必要な前駆体は、体内で合成されず、そのような亜麻の種子の消費などによって外部ソースを介して取得する必要がありますが5つの研究は、次のようなリノール酸のいくつかの有益な健康への影響を示しています。肌のためのアンチエイジングの特性、6抗炎症作用、大腸と前立腺癌細胞の増殖が減少7、8、肥満と戦うための能力と昇進Ofの心臓血管の健康。9 リノレン酸が歯周炎症、10および変調トロンボキサンとプロスタサイクリン合成を減少させる役割を果たしています11
Arpita 12 V.に胆汁脂肪酸とコレステロールの影響を検討病原因子と運動性のコレラ菌の表現。山崎13は、赤唐辛子、およびその他の天然抽出物、メタノール抽出物から、潜在的にコレラ毒素産生を減少させることができることが示された。これは、粘膜免疫を提供する介して、例えばコレラなどの感染症の予防及び緩和上記脂肪酸（例えば、亜麻種子など）に富んだ食品の使用を検討することも考えられる。我々は、細胞増殖アッセイ、ヒト腸管上皮細胞は、セリウムに有害な影響を与えることなく許容できる脂肪酸の最大濃度を用いて、脂肪酸を可溶化し、決定するために検討を重ねLL生存能力。我々は、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸は、低濃度で細胞生存度に有益な効果を提供すると仮定したが、より高い濃度では、それらは細胞に対して毒性であること。我々はまた、コレラ毒素を可溶化し、BALB / Cマウスのマクロファージ細胞生存率の有意な減少なしに耐えることができるコレラ毒素の最大濃度を決定した。私たちも、非常に低レベルでの細胞生存率にコレラ毒素の毒性効果を仮定する。コレラ毒素を可溶化し、細胞の生存性を大幅に低下させることなく耐えることができる毒素の最大量を決定するためにそれを使用する方法は、将来の研究のための利点を提供する。例えば、上記の方法の組み合わせが脂肪酸がコレラ感染に対する粘膜免疫細胞を提供するかどうかを決定するために使用することができる。我々の知る限り、これは合理的手法が検討されていない。
私たちは、ジ我々の予備的データはオレインかどうかを判断するために後で調査で使用することができますscuss方法、リノール酸とリノレン酸がコレラ感染に対する粘膜免疫で細胞を提供する。
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Protocol
1。組織培養
- コレラ毒素の測定にハツカネズミマクロファージ （BALB / cマウス）を使用します。当初は文化M.のすべてベンダーの指示に従って筋細胞 。
- 10％ウシ胎児血清で完了L-グルタミンを有するダルベッコ変法イーグル培地中でBALB / cマウス細胞を伝播して、1％の抗生物質/抗真菌剤またはRPMI 1640ベース媒体は、10％ウシ胎児血清、5％L-グルタミン、および1で完了し％抗生物質/抗真菌剤試薬。
- 37℃でベントキャップ付き75cm 2のコーニングフラスコ中の細胞を増殖°C、95％空気および5％CO 2。
- 脂肪酸の決定の決定のため、メーカーの指示に従って配信の24時間以内にヒト腸上皮細胞を持ち出す。
- 37℃、10％FBSおよび30 ngの/ mlのヒトEGFで完了HybriCareメディアベントキャップ付75cm 2のコーニングフラスコ、℃で人間の腸管上皮細胞を伝播抗生物質を使用しないでくださいメーカーの指示に従って、/抗真菌薬。
- 密集度約70％で、すべてのセル（1:3）を分割します。
- フリーズと標準凍結プロトコルを使用して研究を通して、すべてのセルを持ち出す。
- 注：脂肪酸のより大規模な濃度決定のために、最初は速く成長し、保守が容易にマウスマクロファージを使用しています。細かいスケール脂肪酸濃度の決定のために、ヒト上皮細胞を使用しています。すべてのコレラ毒素治療（説明を参照してください）、マウスマクロファージを使用してください。
2。脂肪酸とコレラ毒素トリートメント
- オレイン酸は、同社が提供するガラスアンプルから滅菌ガラスバイアルにリノール酸とリノレン酸を転送します。
- 個別滅菌エッペンドルフチューブに各脂肪酸を転送し、1:6希釈で100％エタノールで最初にそれを溶解した後、10μgの/μlの最終濃度のためにRPMI 1640不完全なメディアである。
- ボルテックス各ソリューションとTRANSFえーそれは冷凍庫内のストレージ用ガラスバイアル（-20°C）へ。
- 96ウェル組織培養プレートでよく2,500細胞/皿で細胞。
- MTTアッセイの準備のために脂肪酸と細胞の治療のために200μlに合計うまくボリュームを持って適切な完全なメディアを追加します。
- 24時間増殖期間の後、メディアを取り出し、新鮮な培地と交換してください。
- （結果を参照）ウェルにテストする各脂肪酸の適切な濃度を追加します。 200μlに合計うまくボリュームを持って完全なメディアを追加します。
- MTTアッセイを開始する前に24時間処理プレートをインキュベートする。
- クライオバイアルに1 mg / mlのアリコートと溶液の濃度でPBSでコレラ毒素を溶解し、2-8でクライオバイアルを保管℃に
- 細胞治療のため、1 ngの/μLの最終作業濃度のどちら滅菌PBS（pH7.4）に、または不完全なDMEM中で毒素1:100に希釈する。
- におけるコレラ毒素を持つ細胞を治療する上述したようにMTTアッセイプレート電池用製剤。
- 24時間増殖期間の後、脂肪酸アプリケーション（上）で使用される手順に従って、ウェルにテストする（我々の濃度について、結果を参照）コレラ毒素の適切な濃度を追加します。
- MTTアッセイを開始する前に24時間処理プレートをインキュベートする。
- それぞれの脂肪酸及びコレラ毒素治療の両方のための正（紙全体に正c）および陰性対照（負c）は、完全培地および70％エタノールでインキュベートした細胞、など。
- すべてのサンプルとトリートメントにはポジティブコントロールのためのより多くの複製（本研究ではn = 6）で、3反復（n = 3）での最小値を使用しています。
3。 MTTアッセイ
- 2.5 mg / mlの濃度にMTT原液を作る。
- テストする、96ウェルプレートの各ウェル中の溶液を取り除き、新鮮な完全なメディア溶液200μlと交換してください。
- 広告各ウェルにMTT溶液を10μlのD。
- 37℃で3-4時間、プレートをインキュベートする。
- メディアソリューションを捨て、各ウェルにイソプロパノールで0.04 M HClを100μlのを追加します。
- 5分間室温でプレートをインキュベートする。
- 各ウェルから新しい遠心管にソリューションを移す。
- 1分間、またはペレットが形成されるまで、室温で、20,000×gで遠心分離します。
- 各サンプルの20〜40μlの間にマイクロプレートリーダーへの転送。
- 分光光度計を用いて570nmで吸光度を読み取る。
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Representative Results
脂肪酸の最適濃度の決定
脂肪酸の最適な濃度は、細胞増殖に匹敵するか、または結果のばらつきが比較的低いと、コントロール細胞とを超えた最大濃度として定義される。オレイン酸の最適濃度を決定するために、リノール酸およびリノレン酸の細胞は、最初は少しずつで大きな増分以降では、各脂肪酸の濃度を変化させることで処理した。 図1は、使用する処置のための陽性対照の関数として示されている細胞の生存を示してい脂肪酸の濃度を増加させる。それは、細胞が脂肪酸のいずれかの上記100ngの/μlの濃度を許容しないことが明らかである。一つの方法は、ANOVAは、治療の各々について、手段の一つ又はそれ以上が他た（p <0.001）とは異なることを示した。事後検定（Tukeyのは）を示したことを除いて、オレイン酸のすべての治療をするため1 ngの/μL、ポジティブコントロールとは異なっていた。興味深いことに、高い変動に起因し、この治療法のいずれかわずかにネガティブコントロールと有意差はなかった。リノール酸およびリノレン酸の両方について、一方向ANOVAは、少なくとも1つの平均が他た（p <0.001）とは異なることを示した。 Tukeyの事後テストはどちら脂肪酸は10 ng /μLの治療の平均が陽性対照と有意に異なるではありませんが、陰性コントロール（P <0.05）からのものであることを明らかにした。
この実験は、10 ng /μLの刻み（最大70 ngの/μlに、ヒト上皮細胞を用いた）で100 ng /μLの、よりも低かった濃度で繰り返した。細胞の生存は、 図2の各濃度について設けられている。オレイン酸（図2a）、ANOVA手段のいずれかまたは複数た（p <0.001）が異なることを示した一つの方法である。しかし、それはより高い濃度でのみトリートメント（40および50であるレンダリングされたもの）ng /μLのは、陽性対照とは統計学的に異なることを意味します。興味深いことに、観察された違いは、細胞生存率の増加（もっとばらつき、 図2aに）によるものであった。一方向ANOVAは、リノール酸やリノレン酸も同様の結果が得られた。具体的には、治療手段のいずれも陽性対照の平均値とは異なっていたなかった。もう一度、ばらつきが高濃度（ 図2bおよび2c）のいくつかのために増加すると思われる。
コレラ毒素の最適濃度の決定
コレラ毒素のための最適濃度は、細胞生存率に影響を与えないされる濃度として定義されるか、または単に未処理の細胞と比較して減少し始める。最小限の細胞の生存率を低下させるコレラ毒素の最小濃度を評価するために、細胞を最初に大incremenのコレラ毒素の濃度を変えて処理したTSと後で小さく刻みで図3aは、比較的大きな単位（NG、R 2 100〜1,000の間で; = 0.5436）で毒素レベルのコレラ毒素治療の結果として細胞の生存のために減少生存能力の傾向を示しています。予想されるように、細胞生存率は、各処理（ 図3a）に対して大きく変化した。生存率の大きな変動が観測された治療法のいずれか（一方向ANOVA）との陽性対照の平均値間には有意差が生じた。これらの結果に基づき、我々は毒素レベルが<100 ngのをさらにテストする必要があると判断した。 図3bは、より小さい毒素レベルの治療のための細胞の生存率を示している。細胞生存率は僅かな増加が治療の結果として、生存率が認められたものの、ほぼ全ての毒素濃度のために非常に多様である。これらの増加は、（図3b）陽性対照の平均値と比較して、治療法のいずれにも統計的に有意ではありません（一方向ANOVA、Tukeyの）。
図1。脂肪酸の使用可能な濃度の測定：オレイン酸、リノール酸とリノレン酸のために比較的大きな単位（μL/ 100〜1,000 ngの）中の脂肪酸の濃度を変えることの効果は 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。細かいスケール脂肪酸濃度判定：ヒトの腸上皮に小さい単位で脂肪酸の濃度を変化させる効果（液/ 10 ngの）細胞生存。腸管上皮細胞は、オレイン酸の種々の濃度（）、リノール酸（b）およびリノレン酸（C）で処理した。ポジティブコントロールは、完全培地、70％エタノールで陰性対照で処理した細胞である。各試験のために、n = 3の陽性対照（N = 6）を除くすべての治療のため。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。マウスのマクロファージの生存にコレラ毒素の濃度を変化させるアプリケーションの評価に基づいて、使用可能なコレラ毒素濃度の測定：マウスマクロファージが大きい増分でコレラ毒素の濃度を変えて処理した（）次いで、小さな（b）の陽性対照は、完全培地、70％エタノールで陰性対照で処理した細胞である。各試験のために、n = 3の陽性対照（N = 6）を除くすべての治療のため。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。適切な脂肪酸及び今後の研究に使用するための毒素濃度の実験デザイン判定：細胞溶解物を定性的かつ定量的免疫ブロッティングおよびELISAは、感染のマーカーとしての特異的サイトカインに対する抗体を用いて測定することができるマクロファージおよびサイトカインの動態を治療するために使用することができる。
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Discussion
脂肪酸とコレラ毒素の濃度の提案
脂肪酸は粘膜免疫を高める方法の正確なメカニズムは不明であるが、いくつかの研究は、それらの有益な効果を調べることを試みた。我々の研究は、細胞が細胞は細胞の生存に重要な影響を及ぼすことなく耐えることができるだけでなく、コレラ毒素の最大濃度に耐えることができる脂肪酸の最大濃度を決定する方法を提供することを目的とする。
だけでなく、我々は異なるに脂肪酸とコレラ毒素と処理組織培養細胞を可溶化し、細胞の生存率に非常に重大な悪影響を及ぼすことなく、細胞の治療のためのコレラ毒素のものと3脂肪酸（オレインリノール酸およびリノレン酸）の濃度を決定するために、濃度は、生存率を評価するMTTアッセイを行った。我々の手法とその結果に基づいて、我々は脂肪酸およびコレラ毒素有用な範囲を提供する（下記参照）は、これらの脂肪酸またはコレラ毒素を使用することを目指して将来の調査のために。我々は、ヒトの腸上皮細胞を使用するため、それぞれ、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸に対して1 384-768、および384-768（ng /μLの）の濃度を推薦する。私たちは、BALB / Cマウスのマクロファージを用いたコレラ毒素の<30 ngの（200μL当たり、メソッドを参照）を使用することもお勧めします。我々は、コレラ毒素のために、少なくとも有意差は処理に比べポジティブコントロールの細胞生存率との間に観察されなかったことを認識する。しかし、我々の勧告は高い毒素レベルの暴露の結果として観察された細胞の生存率が比較的高い変動性に基づいています。
今後の研究
脂肪酸およびコレラ毒素のレベルで、この研究で提供されたデータは、将来の研究に用いることができる。我々はここに、そのような調査の例を提供します。
コレラはdevのに関連付けられている疾患である適切な下水や水処理プラントや安全な飲料水を持っていない国を道行き。 2009年には、3,000人以上の死者がジンバブエだけでコレラ関連の症状による5月の期間に報告された14の 2011年、コレラはハイチで発生（CDC、2010）をはじめ、世界のさまざまな地域で流行のまま。 2010年には分子遺伝学の研究は、この流行に細菌はネパールの起源であったことを証拠を示した。15病気はV.によって糞便に汚染された食品や飲料水の摂取と腸の植民地化によって引き起こされるエンテロトキシンのリリースに続いてコレラ 、。コレラの予防接種が存在しないが、彼らはいつも流行時に感染症の予防に効果的ではない。効果的かつ安価な介入はコレラの流行が発生した集団のために必要とされる。一つのアプローチは、勉強するかどうかなどのオレイン酸、リノール酸やリノレン酸などのデリバティブが豊富で食料源コレラ感染に対する粘膜免疫を提供するか、向上させる。このようなToll様受容体16体（TLR）およびヌクレオチド結合ドメイン（NLRs）などの細胞の表面に見られるタンパク質受容体の使用により、粘膜免疫機能する。膜組成とのTLRとNLRsと対話するリガンドのリリースでの変更を通じ、腸上皮への脂肪酸のほか、危険な微生物を認識し、適切な免疫応答を募集における受容体の機能を高めることができる。コレラ感染に対する脂肪酸の効果を判断するには、このようなTNF-αの細胞のリリース、IL-6、IL-10およびIL-12などのサイトカインダイナミクスは、ヒト腸上皮細胞になおさら勉強しなければなりませんマウスのマクロファージに比べ（ 図4）。今後の研究から、このような知識は、最終的に胆汁を阻害するために効果的な介入を提供するために、私たちはより良い脂肪酸が感染を防ぐために働くかもしれないメカニズムを理解するのに役立ちます流行。これは、前のコレラ毒素感染脂肪酸による細胞の処理は、最終的にコレラ菌感染の間に細胞生存率を増加させる、誘導および/または腸管上皮の粘膜免疫応答を強化する可能性がある。
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Disclosures
この研究の著者らは、この研究の結果からの経済的利害関係を持っていません。この研究のための資金はキーン大学がFTに提供されたが、FTは、現在Kingsboroughコミュニティカレッジの従業員です。
Acknowledgments
我々はそれぞれ、実験支援のためにポーラコボス博士エヴロスバシリウに感謝し、マウスのマクロファージを提供。また、材料と指導と助けを私たちの研究室マネージャーリチャードCriasiaに感謝します。最後に、著者は、ビデオ制作のヘルプはRamanpreet Kaurさんに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagent | |||
| Mus musculus macrophages | ATCC | ATCC RAW 264.7 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | ATCC | 30-2002 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2115 | |
| Fetal bovine serum | Bio-west | S0250 | |
| Antibiotic/antimycotic | Hyclone | SV3007901 | |
| Human intestinal epithelial cells | ATCC | ATTC CCL-241 | |
| HybriCare media | ATCC | 46-X | |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L-1376 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L-2376 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Equipment | |||
| BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates | BD Biosciences | 351172 | |
| Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software | Dynex | 91000101 | |
References
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