Summary
Мы решили определить допустимые концентрации трех жирных кислот (олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты) и холерного токсина, который не значительно и отрицательно повлиять на выживаемость клеток путем растворения жирных кислот и токсинов и их использование в анализе выживаемости клеток.
Abstract
Положительная роль жирных кислот в профилактике и борьбе не-человека и болезни человека были и продолжают быть документированы. Эти роли включают в себя воздействие на инфекционные и неинфекционные заболевания, включая профилактику воспаления, а также слизистой оболочки иммунитет к инфекционным заболеваниям. Холера является острой кишечной болезни, вызванной бактерией холерный вибрион. Это происходит в развивающихся странах, и если его не лечить, может привести к смерти. В то время как вакцины холеры существуют, они не всегда эффективны и другие профилактические методы необходимы. Мы решили определить допустимые концентрации трех жирных кислот (олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты) и холерного токсина с помощью мыши BALB / C макрофагов и человеческих эпителиальных клетках кишечника, соответственно. Мы солюбилизированного выше жирных кислот и использовали анализ пролиферации клеток для определения концентрации интервалов и конкретных значений концентрации жирных кислот, которые неT вредны для человеческого кишечного эпителия жизнеспособности клеток. Мы солюбилизированного холерного токсина и использовали его в анализе для определения концентрации интервалов и конкретных значений концентрации холерного токсина, которые не статистически снижение жизнеспособности клеток в линии BALB / C макрофагов.
Мы нашли оптимальную концентрацию жирных кислот составляет от 1-5 нг / мкл, и холерного энтеротоксина быть <30 нг на лечение. Эти данные могут помочь дальнейших исследований, направленных найти защитную слизистую роль жирных кислот в предотвращени или облегчени инфекции холеры.
Introduction
Польза для здоровья жирных кислот, таких как олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты были и продолжают быть документированы. Так, например, олеиновая кислота помогает облегчить проникновение липофильных лекарственных средств в организме 1,2, уменьшает ишемической болезни сердца на 24% при замене насыщенных жирных кислот 3, и используется для лечения метаболических заболеваний, таких как Адренолейкодистрофия 4, который Х-хромосомой генетических нарушений метаболизма жирных кислот. . Хотя необходимо предшественником арахидоновой кислоты у млекопитающих, линолевая кислота (в отличие от олеиновая кислота) не синтезируется организмом и должны быть получены с помощью внешних источников, например, потребление семян льна 5 Исследования показывают несколько полезных последствий для здоровья линолевой кислоты, такие как: омолаживающие свойства для кожи, 6 противовоспалительными свойствами; 7 сократил распространение толстой кишки и предстательной железы клетки карциномы; 8 и способность бороться с ожирением и продвижение Oе сердечно-сосудистых заболеваний. 9 линоленовая кислота играет важную роль в снижении воспаления пародонта, 10 и модуляции тромбоксана и простациклина биосинтез 11.
Arpita 12 изучено влияние желчных жирных кислот и холестерина на V. вибрион Выражение лица факторов вирулентности и подвижность. Ямасаки 13 указано, что метанол выписку из красного перца чили, и другие естественно извлекаются соединения, потенциально может уменьшить холерного токсина производства. Вполне возможно, рассмотреть вопрос об использовании пищевых продуктов, которые богаты жирными кислотами выше (например, семена льна) в профилактике и борьбе с инфекционными заболеваниями, как холера путем предоставления иммунитета слизистых оболочек. Мы провели исследования для солюбилизации жирных кислот и определить, используя пролиферации клеток анализы, максимальная концентрация жирных кислот, что человеческие эпителиальные клетки кишечника может допустить без вредного воздействия на сеLL жизнеспособность. Мы предположили, что олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты обеспечивают благоприятное воздействие на жизнеспособность клеток при более низких концентрациях, но при более высоких концентрациях они будут токсичны для клеток. Мы также солюбилизированного холерного токсина и определяли максимальную концентрацию холерного токсина, что линии BALB / C макрофагов мыши могут переносить без существенного снижения жизнеспособности клеток. Мы предполагаем, токсическое действие холерного токсина на жизнеспособность клеток даже при очень низком уровне. Метод солюбилизации холерного токсина и его использование для определения максимального количества токсина, что клетки могут переносить без существенного снижения жизнеспособности обеспечивает преимущество для дальнейших исследований. Например, сочетание указанных выше методик можно использовать для определения того, жирные кислоты обеспечивают клетки слизистой иммунитет против инфекции холеры. Насколько нам известно, это рациональное и методология не была исследована.
Мы диscuss как наши предварительные данные могут быть использованы в более поздних исследованиях, чтобы определить, олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты обеспечивают клетки слизистой иммунитет против инфекции холеры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура ткани
- Используйте Mus мышцы макрофагов (BALB / с мышами) для определения холерного токсина. Изначально все культуры М. мышцы клетки в соответствии с инструкциями производителя.
- Размножение BALB / с мышей клетками в среду Игла, модифицированную по Дульбекко с L-глутамином, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотик / противогрибковым или RPMI 1640, основание, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 5% L-глутамина и 1 % антибиотик / противогрибковым реагентом.
- Рост клеток в 75 см 2 колбы Corning с вентилируемыми колпачками при 37 ° C, 95% воздуха и 5% CO 2.
- Вызовите человека эпителиальные клетки кишечника в течение 24 часов поставки в соответствии с инструкциями изготовителя для определения жирных кислот определений.
- Распространить кишечника человека клетки эпителия в 75 см 2 колбы Corning с вентилируемыми колпачками HybriCare в средствах массовой информации, дополненной 10% FBS и 30 нг / мл человеческого EGF при 37 ° С. Не используйте антибиотикам/ Противогрибковым реагентов в соответствии с инструкциями производителя.
- Разделение всех клеток (1:3) при примерно 70% слияния.
- Заморозить и воспитывать всех клетках на протяжении всего исследования с использованием стандартных протоколов замораживания.
- Примечание: для больших масштабах определение концентрации жирных кислот, используют более быстрый рост, легче поддерживать, макрофагах мыши на начальном этапе. Для мелкого масштаба определения концентрации жирных кислот, используйте эпителиальные клетки человека. Использовать мышь, макрофаги для всех холерного токсина лечения (см. обсуждение).
2. Жирная кислота и холеры Лечение токсинного
- Передача олеиновой, линолевой и линоленовой кислот из предоставленных компанией стеклянных ампул в стерилизованные стеклянные флаконы.
- Передача каждого жирных кислот в отдельную пробирку Эппендорфа стерилизованы и растворить ее первого в 100% этаноле в разведении 1:6, а затем в среде RPMI 1640 неполной среды до конечной концентрации 10 мкг / мкл.
- Vortex каждого решения и TransfER его стеклянная тара для хранения в морозильной камере (-20 ° C).
- Пластина клеток при 2500 клеток / лунку в 96-луночные планшеты для культуры ткани.
- Добавьте соответствующие полной среде, чтобы довести общее хорошо объема до 200 мкл для обработки клеток жирных кислот в подготовке к МТТ анализа.
- После 24-часового периода распространения ч, вынуть, и заменить его на свежую среду.
- Добавьте соответствующие концентрации каждого жирных кислот для тестирования в лунки (см. результаты). Добавить полную среду, чтобы довести общее хорошо объемы до 200 мкл.
- Инкубируйте обработанных пластин в течение 24 ч перед началом МТТ.
- Растворить холерного токсина в PBS при концентрации 1 мг / мл и аликвоты раствора в криопробирки и хранить криопробирок при 2-8 ° C.
- Для клеток лечение, разбавленной 1:100 в токсин или стерилизованный PBS (рН 7,4) или неполного DMEM до конечной рабочей концентрации 1 нг / мкл.
- Для лечения клеток холерного токсина вподготовки к МТТ анализа, пластиной клетками, как описано выше.
- После 24 часов период распространения, добавьте соответствующий концентрации холерного токсина (для нашего концентрации, см. результаты) для тестирования в лунки после процедур, используемых в приложениях жирные кислоты (выше).
- Инкубируйте обработанных пластин в течение 24 ч перед началом МТТ.
- В качестве положительного (положительная в течение бумага) и отрицательный контроль (отрицательный в), как жирные кислоты и токсин холеры лечения, клетки инкубируют с полной среде и 70% этанолом, соответственно.
- Для всех образцов и лечения используют не менее трех повторениях (п = 3), с большим количеством повторений для положительного контроля (п = 6 в данном исследовании).
3. МТТ
- Сделать МТТ раствора до концентрации 2,5 мг / мл.
- Удалить раствора в каждую лунку 96-луночного планшета для тестирования и заменить его на 200 мкл свежей полное решение сред.
- Объявлениед 10 мкл раствора МТТ в каждую лунку.
- Инкубировать при 37 ° С в течение 3-4 час.
- Отменить решение СМИ и добавить 100 мкл 0,04 М HCl в изопропаноле в каждую лунку.
- Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.
- Передача раствора из каждой лунки в новую пробирку центрифуги.
- Не центрифугируют при 20000 х г при комнатной температуре, в течение 1 мин или пока осадок образуется.
- Передача между 20-40 мкл каждого образца для микропланшет-ридера.
- Считать абсорбцию при 570 нм с использованием спектрофотометра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Определение оптимальной концентрации жирных кислот
Оптимальная концентрация жирных кислот определяется как максимальная концентрация, при которой рост клеток сравнима или превышает контрольные клетки с относительно низкой изменчивости результатов. Для определения оптимальной концентрации олеиновой, линолевой и линоленовой кислот клетки изначально получавших различные концентрации каждого жирная кислота в больших приращений, а затем с меньшим шагом. Рисунок 1 показывает выживание клеток изображены как функции положительного контроля для лечения с помощью увеличение концентрации жирных кислот. Очевидно, что клетки не допускать концентрации выше 100 нг / мкл для любого из жирных кислот. Один дисперсионный анализ показал, что для каждой из обработок, одно или несколько средств отличаются от других (р <0,001). Апостериорного теста (Тьюки) показали, что для олеиновой кислоты все процедуры, за исключением1 нг / мкл отличались от положительного контроля. Интересно, что в связи с высокой изменчивостью, это лечение было незначительно существенно не отличается от отрицательного контроля либо. Для обоих линолевой и линоленовой кислот, один дисперсионный анализ показал, что по крайней мере один средний отличается от других (р <0,001). Апостериорного теста Тьюки показали, что среднее значение 10 нг / мкл лечение или жирной кислоты существенно не отличается от положительного контроля, но с отрицательным контролем (р <0,05).
Этот эксперимент был повторен для концентраций, которые были ниже, чем 100 нг / мл, в 10 нг / мкл инкрементов (до 70 нг / мл, с использованием человеческих эпителиальных клеток). Выживаемость клеток предусмотрен для каждой концентрации на рисунке 2. Для олеиновой кислоты (2а), один дисперсионный анализ показал, что одно или более средств были разными (р <0,001). Тем не менее, это только лечение при более высоких концентрациях (40 и 50нг / мкл), которые оказали означает статистически отличается от положительного контроля. Интересно, что наблюдаемые различия были обусловлены увеличением жизнеспособности клеток (с более изменчивость, 2а). Один из способов ANOVA получены аналогичные результаты для линолевой и линоленовой кислот. В частности, ни одно из средств лечения не отличались от среднего значения положительного контроля. Еще раз, изменчивость, кажется, увеличивается для некоторых из более высоких концентрациях (фиг. 2b и 2с).
Определение оптимальной концентрации холерного токсина
Оптимальная концентрация для холерного токсина определяют как концентрацию, при которой жизнеспособность клеток не влияет или только начинает уменьшаться по сравнению с необработанными клетками. Для оценки минимальной концентрации холерного токсина, что минимально уменьшает жизнеспособность клеток, клетки сначала обрабатывают различными концентрациями холерного токсина в больших инкрементальныйтс, а затем с меньшим шагом Фиг.3а показывает снижение жизнеспособности тенденцию к выживанию клеток в результате холерного токсина лечения уровни токсина при относительно больших приращений (между 100-1000 нг, R 2; = 0,5436).. Как и ожидалось, жизнеспособность клеток весьма различны для каждой обработки (фиг. 3а). Большие наблюдаемые различия в жизнеспособности в результате не имеет значения разница между средней нашего положительного контроля с любым из обработок (односторонний ANOVA). На основании этих результатов, мы определили, что токсин уровни <100 нг должны быть проверены в дальнейшем. На фиг.3b показывает жизнеспособность клеток по меньшей процедуры токсин уровне. Жизнеспособность клеток сильно варьирует для почти всех концентрациях токсин, хотя небольшое увеличение наблюдалось в жизнеспособность в результате лечения. Это увеличение (рис. 3б) не являются статистически значимыми для любого из обработок по сравнению со средним положительного контроля (Один из способов ANOVA, Тьюки).
Рисунок 1. Определение полезной концентрации жирных кислот. Влияние различных концентраций жирных кислот в относительно больших приращений (100-1000 нг / мкл) для олеиновой кислоты, линолевой кислоты и линоленовой кислот Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Изобразительных масштабе жирных определение концентрации кислоты: Влияние различных концентраций жирных кислот с меньшим шагом (10 нг / мкл) на человеческих кишечных эпителиальныхвыживаемости клеток. Кишечные эпителиальные клетки обрабатывали различными концентрациями олеиновой (а), линолевая кислота (б) и линоленовая кислота (с). Положительный контроль клетках, обработанных только полной среде, и отрицательный контроль с 70% этанола. Для каждого испытания, N = 3 для всех процедур, кроме положительного контроля (n = 6). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 3. Определение концентрации полезной токсин холеры на основе оценки применения различных концентраций холерного токсина на выживание макрофагов мыши: Мышь макрофаги обрабатывали различными концентрациями холерного токсина с большим шагом (а)Затем мелкие (б). положительного контроля клетки, обработанные только полной среде, и отрицательный контроль с 70% этанола. Для каждого испытания, N = 3 для всех процедур, кроме положительного контроля (n = 6). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 4. Экспериментальные разработки определение соответствующих жирных кислот и токсин концентрации для использования в будущих исследований: Клеточные лизаты могут быть использованы для лечения макрофагов и цитокина динамика может быть качественно и количественно анализировали с помощью иммуноблоттинга и ELISA с использованием антител против специфических цитокинов в качестве маркеров для инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предложению концентрация жирных кислот и холерного токсина
Хотя точный механизм того, как жирные кислоты повышения иммунитета слизистой неизвестна, несколько исследований предпринимались попытки исследовать их положительный эффект. В нашем исследовании направлен на обеспечение методологии для определения максимальной концентрации жирных кислот, что клетки могут переносить а также максимальную концентрацию холерного токсина, что клетки могут переносить без существенного влияния на выживание клеток.
Для определения концентрации трех жирных кислот (олеиновой, линолевой и линоленовой), а также, что холерного токсина для лечения клетки, не очень значительное негативное воздействие на жизнеспособность клеток мы солюбилизированного жирные кислоты и токсин холеры и обработанной ткани культивируемых клеток к различным Концентрации последующим МТТ-анализа для оценки жизнеспособности. На основании наших методология и результаты мы обеспечиваем диапазонов жирных кислот и холерного токсина полезнойдальнейших исследований, направленных на использование этих жирных кислот или холерный токсин (см. ниже). Мы рекомендуем концентрациях 1, 5-10 и 5-10 (нг / мкл) для олеиновой кислоты, линолевой кислоты и линоленовой кислот, соответственно, для использования человеческих эпителиальных клеток кишечника. Мы также рекомендуем использовать <30 нг (на 200 мкл, см. методы) холерного токсина использованием BALB / C макрофагов мыши. Мы признаем, что, по крайней мере для холерного токсина, никаких существенных различий не наблюдалось между жизнеспособности клеток для положительного контроля по сравнению с процедурами. Тем не менее, рекомендацию основан на относительно высокой изменчивости жизнеспособности клеток, что было отмечено в результате более высокого уровня воздействия токсина.
Исследований Будущего
Данные, полученные в этом исследовании, на жирные кислоты и уровни холерного токсина могут быть использованы в дальнейших исследованиях. Мы предоставляем пример одного из таких расследований здесь.
Холера является заболеванием, связанным с разработчикомeloping стран, которые не имеют надлежащей канализации и очистных сооружений и безопасной питьевой водой. В 2009 году число погибших более 3000 был зарегистрирован в пяти месяцев в связи с симптомами холеры в Зимбабве в одиночку. +14 С 2011 года Холера остается эпидемии в различных регионах мира, включая вспышку на Гаити (CDC, 2010) . Молекулярной генетики исследование в 2010 году показало, доказательств того, что бактерии в этой вспышке был непальского происхождения. 15 Заболевание вызывается при попадании в организм фекально-загрязненную пищу или питьевую воду и колонизации кишечника В. вибрион, с последующим выпуском энтеротоксина. В то время как холера прививки существуют, они не всегда эффективны в профилактике инфекции во время вспышек. Эффективные и недорогие мероприятия необходимы для населения, где происходят вспышки холеры. Один из подходов заключается в изучении ли источники пищи, которые богаты производные, такие как олеиновая, линолевая и линоленовая кислотыобеспечить или усилить иммунитет слизистых оболочек от инфекции холеры. Слизистые функции иммунитета за счет использования белков рецепторов, обнаруженных на поверхности клеток, таких как Toll-подобных рецепторов 16 (TLRs) и нуклеотид-связывающие домены (NLRS). Посредством изменения состава мембраны и высвобождению лигандов, которые взаимодействуют с TLR, и NLRS, добавление жирных кислот в кишечном эпителии может усиливать функции рецептора в распознавании опасных микроорганизмов и подбора соответствующего иммунного ответа. Для определения жирных эффектов кислот на инфекцию холеры, цитокин динамика, таких как высвобождение клетки ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИЛ-12, должны быть изучены более в человеческих кишечных эпителиальных клетках, чем в макрофагах мыши (рис. 4). Такие знания из будущего исследования помогут нам лучше понять механизм, посредством которого жирных кислот может работать, чтобы предотвратить инфекцию, для того, чтобы в конечном итоге обеспечить эффективное вмешательство для подавления рассвирепелвспышек. Вполне возможно, что обработка клеток жирных кислот до заражения холерным токсином поможет индуцировать и / или повысить иммунный ответ слизистой оболочки в кишечном эпителии, в конечном счете, повышение жизнеспособности клеток при микробной инфекции холеры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы этого исследования не имеют финансовой заинтересованности от результатов этого исследования. Финансирование данного исследования была предоставлена футов на Кин университета, однако в настоящее время FT сотрудник Kingsborough Community College.
Acknowledgments
Мы благодарим Паула Кобос и доктор Эвроса Василиу лаборатории за помощь и предоставление макрофагах мыши соответственно. Мы также благодарим нашего менеджера лаборатории Ричарда Criasia для руководства и помочь с материалами. Наконец, авторы благодарят Ramanpreet Каур за помощь в видео-продукции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagent | |||
| Mus musculus macrophages | ATCC | ATCC RAW 264.7 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | ATCC | 30-2002 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2115 | |
| Fetal bovine serum | Bio-west | S0250 | |
| Antibiotic/antimycotic | Hyclone | SV3007901 | |
| Human intestinal epithelial cells | ATCC | ATTC CCL-241 | |
| HybriCare media | ATCC | 46-X | |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L-1376 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L-2376 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Equipment | |||
| BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates | BD Biosciences | 351172 | |
| Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software | Dynex | 91000101 | |
References
- Franceur, M. L., Golden, G. M., Potts, R. O. Oleic Acid: Its effects on stratum corneum in relation to (trans) dermal drug delivery. Pharm Res. 7 (6), 621-627 (1990).
- Tandon, P., et al. X-ray diffraction and spectroscopic studies of oleic acid-sodium acetate. Chem. Phys. Lipids. 109 (1), 37-45 (1990).
- Kris-Etherton, P. M. The debate about n-6 polyunsaturated fatty acid recommendations for cardiovascular health. Journal of the American Diabetic Association. 110 (2), 201-204 (2010).
- Rizzo, W. B., Phillips, M. W., et al. Adrenoleukodystrophy: dietary oleic acid lowers hexacosanoate levels. Annals of Neurology. 21 (3), 232-239 (1987).
- Bozan, B., Temelli, F. Chemical composition and oxidative stability of flax, safflower and poppy seed and seed oil. Bioresource Tech. 99, 6354-6359 (2005).
- Krein, S., Meldurm, H., Hawkins, S., Foy, V. Clinical benefits of conjugated linoleic acid to 3-dimensional wrinkle morphology. J. American Academy of Dermatology. 60 (3), AB30 (2009).
- Yu, Y., Correll, P. H., Heuvel, P. J. Conjugated linoleic acid decreases production of pro-inflammatory products in macrophages: Evidence for a PPARy dependent mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1581 (3), 89-99 (2002).
- Palombo, J., Ganguly, A., Bistrian, B., Menard, M. The anti-proliferative effects of biologically active isomers of conjugated linoleic acid on human colorectal and prostatic cancer cells. Cancer Letters. 177, 163-172 (2002).
- Granda, M., Sinclair, A. J. Fatty acids and obesity. Current Pharm. Design. 15 (36), 4117-4125 (2009).
- Rosenstein, E., Kushner, L., Kramer, N., Kazandjian, G. Pilot study of dietary fatty acid supplementation in the treatment of adult periodontitis. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential F.A. 68 (3), 213-218 (2003).
- Ferretti, A., Flanagan, V. Antithromboxane activity of dietary alpha-linolenic acid: a pilot study. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 54 (6), 451-455 (1995).
- Arpita, C., Pradeep, K. D., Chowdhury, R. Effect of Fatty Acids and Cholesterol Present in Bile on Expression of Virulence Factors and Motility of Vibrio cholera. Infection and Immunity. 75 (4), 1946-1953 (2007).
- Yamasaki, S., Asakura, M., Neogi, S. B., Hinenoya, A., Iwaoka, E., Aoki, S. Inhibition of virulence potential of Vibrio cholerae by natural compounds. Indian J. Med. Res. 133 (2), 232-239 (2011).
- WHO | Efforts must be intensified to control Zimbabwe cholera outbreak [WHO PRESS RELEASE] [Internet]. , World Health Organization. Available from: http://www.who.int/csr/don/2009_01_30/en/ (2010).
- Hendriksen, R. S., Price, L. B., et al. Population Genetics of Vibrio cholerae from Nepal in 2010: Evidence on the origin of the Haitian outbreak. mBio. 2 (4), 1-6 (2011).
- Schaeffler, A., Gross, P., et al. Fatty acid-induced induction of Toll-like receptor-4/nuclear factor-kappa B pathway in adipocytes links nutritional signaling with innate immunity. Immunology. 126 (2), 233-245 (2009).
