Summary
Ci proponiamo di determinare le concentrazioni tollerabili di tre acidi grassi (acido oleico, linoleico e linolenico) e la tossina del colera che non significativamente e influenzare negativamente la sopravvivenza delle cellule solubilizzando gli acidi grassi e le tossine e il loro utilizzo in saggi di sopravvivenza delle cellule.
Abstract
Il ruolo positivo degli acidi grassi per la prevenzione e la riduzione delle malattie non-umani e umani sono stati e continuano ad essere ampiamente documentato. Questi ruoli includono influenze sulle malattie infettive e non infettive tra cui la prevenzione di infiammazione e immunità mucosale a malattie infettive. Il colera è una malattia intestinale acuta causata dal batterio Vibrio cholerae. Essa si verifica nei paesi in via di sviluppo e, se non trattata, può portare alla morte. Mentre esistono vaccini per il colera, non sono sempre efficaci e sono necessari altri metodi preventivi. Ci proponiamo di determinare le concentrazioni tollerabili di tre acidi grassi (acido oleico, linoleico e linolenico) e la tossina del colera che utilizzano rispettivamente topo BALB / C macrofagi e cellule epiteliali intestinali umane. Noi solubilizzato degli acidi grassi sopra e saggi di proliferazione cellulare utilizzati per determinare gli intervalli di concentrazione e concentrazioni specifiche degli acidi grassi che non sonot pregiudizievoli per la vitalità delle cellule epiteliali intestinali umane. Noi solubilizzato tossina del colera e l'ho usato in un test per determinare gli intervalli di concentrazione e concentrazioni specifiche di tossina del colera che non statisticamente diminuire la vitalità cellulare in BALB / C macrofagi.
Abbiamo trovato le concentrazioni ottimali di acidi grassi per essere fra 1-5 ng / ml, e che per tossina colerica essere <30 ng per il trattamento. Questi dati possono aiutare i futuri studi che mirano a trovare un ruolo protettivo della mucosa di acidi grassi nella prevenzione o riduzione delle infezioni da colera.
Introduction
I benefici per la salute degli acidi grassi, come ad esempio acido oleico, linoleico e linolenico sono stati e continuano ad essere documentata. Per esempio acido oleico aiuta facilitare la penetrazione dei farmaci lipofili nel 1,2 corpo, riduce la malattia coronarica del 24% quando sostituite acidi grassi saturi 3, ed è usato per trattare malattie metaboliche come Adrenoleukodystrophy 4 che è un X-Linked malattia genetica del metabolismo degli acidi grassi. . Mentre un precursore necessario per l'acido arachidonico nei mammiferi, acido linoleico (a differenza acido oleico) non viene sintetizzata dal corpo e deve essere ottenuto attraverso fonti esterne come dal consumo di semi di lino 5 studi mostrano diversi effetti benefici sulla salute di acido linoleico, quali: proprietà anti-invecchiamento per la pelle; 6 proprietà antinfiammatorie; 7 ridotta proliferazione del colon-retto e della prostata cellule di carcinoma, 8 e la capacità di combattere l'obesità e la promozione of salute cardiovascolare. 9 acido linolenico ha un ruolo nel ridurre l'infiammazione parodontale, trombossano 10 e modulando e prostaciclina biosintesi 11.
Arpita 12 ha studiato l'influenza di acidi grassi biliari e del colesterolo su V. espressione di fattori di virulenza e la motilità cholerae s '. Yamasaki 13 indica che l'estratto di metanolo dal peperoncino rosso, e altri composti estratti naturali, può potenzialmente diminuire la produzione della tossina del colera. È concepibile considerare l'uso di prodotti alimentari che sono ricchi di acidi grassi superiori (come semi di lino) nella prevenzione e attenuazione di malattie infettive come il colera, formulando immunità mucosale. Abbiamo condotto indagini per solubilizzare gli acidi grassi e per determinare, mediante saggi di proliferazione cellulare, la massima concentrazione di acidi grassi che le cellule epiteliali intestinali umani possono tollerare senza effetti negativi sulla cevitalità ll. Abbiamo ipotizzato che gli acidi oleico, linoleico e linolenico forniscono un effetto benefico sulla vitalità cellulare a concentrazioni inferiori, ma che a concentrazioni più alte sono tossici per le cellule. Abbiamo anche solubilizzato la tossina del colera e determinata la concentrazione massima di tossina colerica che BALB / C macrofagi mouse possono tollerare senza un significativo decremento della vitalità cellulare. Ipotizziamo un effetto tossico di tossina colerica sulla vitalità cellulare anche a livello molto basso. Il metodo di solubilizzare una tossina del colera e utilizzarlo per determinare l'importo massimo della tossina che le cellule possono tollerare senza una diminuzione significativa nella sopravvivenza fornisce un vantaggio per studi futuri. Per esempio, una combinazione delle metodologie sopra può essere utilizzata per determinare se gli acidi grassi forniscono cellule con l'immunità mucosale contro le infezioni colera. Per quanto a nostra conoscenza, questa metodologia razionale e non è stato esplorato.
Noi discuss come i nostri dati preliminari possono essere utilizzati in successive investigazioni per determinare se oleico, linoleico e linolenico fornire cellule con l'immunità mucosale contro l'infezione colera.
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Protocol
1. Tissue Culture
- Utilizzare Mus musculus macrofagi (topi BALB / c) per le determinazioni della tossina del colera. Inizialmente cultura tutti M. cellule musculus seguendo le istruzioni del fornitore.
- Propagare BALB / c cellule topi in mezzo di coltura di Dulbecco modificato con L-glutammina completato con 10% di siero fetale bovino e 1% di antibiotici / antimicotici o RPMI 1640 supporti di base completato con 10% di siero fetale bovino, 5% di L-glutammina e 1 % antibiotico / antimicotico reagente.
- Crescere le cellule in 75 cm 2 corning boccette con tappi di sicurezza a 37 ° C, 95% di aria e 5% di CO 2.
- Portare le cellule epiteliali intestinali umane entro 24 ore di consegna secondo le indicazioni del produttore per la determinazione delle determinazioni di acidi grassi.
- Propagare le cellule epiteliali intestinali umane in 75 cm 2 corning boccette con tappi di sicurezza in HybriCare supporti completati con 10% FBS e 30 ng / ml di EGF umano a 37 ° C. Non usare antibioticiReagenti / antimicotici come da istruzioni del produttore.
- Dividere tutte le cellule (1,3) a circa il 70% di confluenza.
- Congelare e portare tutte le cellule in tutto lo studio utilizzando protocolli di congelamento standard.
- Nota: Per la determinazione scala maggiore concentrazione di acidi grassi, utilizzare la crescita più rapida, più facile da mantenere, macrofagi topo inizialmente. Per la determinazione multa scala grasso concentrazione di acido, usare le cellule epiteliali umane. Utilizzare i macrofagi del mouse per tutti i trattamenti di tossina del colera (vedi discussione).
2. Acidi grassi e Trattamenti tossina colerica
- Trasferire acido oleico, linoleico e linolenico da azienda-fornito ampolle di vetro per flaconi di vetro sterilizzati.
- Trasferire ciascun acido grasso di un tubo separato sterilizzato Eppendorf e scioglierlo prima in 100% di etanolo ad una diluizione di 1:6, e poi in RPMI 1640 supporti incompleti per una concentrazione finale di 10 mg / mL.
- Vortex ogni soluzione e trasfer per flaconi in vetro per la conservazione nel congelatore (-20 ° C).
- Cellule piastra a 2.500 cellule / pozzetto in 96 piastre di coltura tissutale bene.
- Aggiungere dei mezzi completi appropriati per portare il volume totale di 200 microlitri bene per il trattamento delle cellule con acidi grassi in preparazione per saggi MTT.
- Dopo un periodo di proliferazione ore 24, rimuovere il supporto e sostituirlo con mezzi freschi.
- Aggiungere le concentrazioni corrispondenti di ciascun acido grasso da testare ai pozzetti (vedi risultati). Aggiungi mezzi completi per portare il totale dei volumi e di 200 microlitri.
- Incubare le piastre trattate per 24 ore prima di iniziare il saggio MTT.
- Sciogliere la tossina del colera in PBS ad una concentrazione di 1 mg / ml e aliquota della soluzione in cryovials e memorizzare le cryovials a 2-8 ° C.
- Per trattamenti con le cellule, diluire la tossina 1:100 in PBS o sterilizzato (pH 7,4) o incompleto DMEM per una concentrazione finale di lavoro di 1 ng / ml.
- Per il trattamento di cellule con la tossina del colera inpreparazione per saggi MTT, cellule piastra come descritto sopra.
- Dopo un periodo di proliferazione ore 24, aggiungere le concentrazioni adeguate di tossina del colera (per le nostre concentrazioni, vedere i risultati) da testare ai pozzetti seguendo le procedure utilizzate in applicazioni di acidi grassi (di cui sopra).
- Incubare le piastre trattate per 24 ore prima di iniziare il saggio MTT.
- Come (c positivo durante la carta) positivo e controllo negativo (negativo C), sia per acidi grassi e trattamenti di tossina del colera, cellule incubate con mezzo completo e il 70% di etanolo, rispettivamente.
- Per tutti i campioni ed i trattamenti utilizzano un minimo di tre repliche (n = 3), con più repliche per i controlli positivi (n = 6 in questo studio).
3. MTT Assay
- Ottenere una soluzione stock MTT alla concentrazione di 2,5 mg / ml.
- Rimuovere la soluzione in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti da testare e sostituirlo con 200 ml di soluzione fresca multimediale completa.
- Annunciod 10 microlitri della soluzione MTT ad ogni pozzetto.
- Incubare la piastra a 37 ° C per 3-4 ore.
- Scartare la soluzione multimediale e aggiungere 100 ml di 0,04 M HCl in isopropanolo a ciascun pozzetto.
- Incubare la piastra a temperatura ambiente per cinque minuti.
- Trasferire la soluzione da ciascun pozzetto in una nuova provetta da centrifuga.
- Centrifugare a 20.000 xg, a temperatura ambiente, per 1 min, o fino a quando un pellet è stato formato.
- Trasferimento tra 20-40 ml di ogni campione per un lettore di micropiastre.
- Leggere l'assorbanza a 570 nm utilizzando uno spettrofotometro.
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Representative Results
Determinazione della concentrazione ottimale di acidi grassi
La concentrazione ottimale di acidi grassi è definito come la concentrazione massima alla quale la crescita cellulare è comparabile o superiore a quello delle cellule di controllo, con relativamente bassa variabilità nei risultati. Per determinare la concentrazione ottimale di oleico, cellule acidi linoleico e linolenico sono state inizialmente trattate con concentrazioni variabili di ciascun acido grasso in grandi incrementi e successivamente con incrementi più piccoli. Figura 1 mostra la sopravvivenza delle cellule rappresentata come una funzione del controllo positivo per trattamenti usando concentrazioni crescenti di acidi grassi. È evidente che le cellule non tollerano concentrazioni di sopra di 100 ng / ml per qualsiasi degli acidi grassi. Un'unica ANOVA ha mostrato che per ciascuno dei trattamenti, uno o più dei mezzi sono diversi dagli altri (p <0,001). Un test post-hoc (Tukey) ha dimostrato che l'acido oleico per tutti i trattamenti tranneil 1 ng / ml erano diversi dal controllo positivo. È interessante notare, a causa dell'elevata variabilità, questo trattamento non era significativamente differente marginalmente dal controllo negativo sia. Sia per gli acidi linoleico e linolenico, un modo ANOVA ha mostrato che almeno una media è diverso dagli altri (p <0,001). Test post-hoc di Tukey A ha rivelato che la media del trattamento 10 ng / ml per l'acido grasso non è significativamente diverso dal controllo positivo, ma sono dal controllo negativo (p <0,05).
Questo esperimento è stato ripetuto per concentrazioni inferiori rispetto a 100 ng / ml, in incrementi di 10 ng / ml (fino a 70 ng / mL, utilizzando cellule epiteliali umane). Sopravvivenza cellulare è fornito per ciascuna concentrazione in Figura 2. Per l'acido oleico (figura 2a), in un modo ANOVA ha mostrato che uno o più dei mezzi erano differenti (p <0.001). Tuttavia, è solo i trattamenti a concentrazioni più elevate (40 e 50ng / mL) che rendeva significa statisticamente differente da quella del controllo positivo. È interessante notare, le differenze osservate erano dovuti ad un aumento della vitalità cellulare (con più variabilità, figura 2a). Un modo ANOVA ha prodotto risultati simili per gli acidi linoleico e linolenico. Specificamente, nessuno dei mezzi di trattamento erano diversi dalla media del controllo positivo. Ancora una volta, la variabilità sembra aumentare per alcune delle concentrazioni superiori (figure 2b e 2c).
Determinazione della concentrazione ottimale di tossina colerica
La concentrazione ottimale per la tossina del colera è definita come la concentrazione alla quale la vitalità cellulare non è influenzato o semplicemente inizia a diminuire rispetto alle cellule non trattate. Per valutare la concentrazione minima di tossina colerica che diminuisce minimamente la vitalità cellulare, le cellule sono state inizialmente trattate con concentrazioni variabili di tossina colerica in grandi increts e poi con piccoli incrementi la figura 3a mostra un andamento decrescente vitalità per la sopravvivenza cellulare in seguito a trattamenti tossina del colera per livelli di tossine con incrementi relativamente grandi (tra 100-1.000 ng, R 2; = 0,5436).. Come previsto, la vitalità cellulare variava notevolmente per ciascun trattamento (Figura 3a). La grande variabilità osservata in vitalità comportato alcuna differenza significatività tra la media del nostro controllo positivo con uno dei trattamenti (ANOVA). Sulla base di questi risultati, abbiamo determinato che i livelli di tossine <100 ng deve essere testato ulteriormente. Figura 3b mostra la vitalità cellulare per i trattamenti più piccoli di livello tossina. La vitalità cellulare è altamente variabile per quasi tutte le concentrazioni di tossina, seppur lieve aumento si osservava in vitalità a seguito dei trattamenti. Questi aumenti (Figura 3b) non sono statisticamente significativi per qualsiasi dei trattamenti rispetto alla media del controllo positivo (Un modo ANOVA, Tukey).
Figura 1. Determinazione delle concentrazioni di acidi grassi utilizzabili:. Effetto di diverse concentrazioni di acidi grassi con incrementi relativamente grandi (100-1.000 ng / ml) per l'acido oleico, acido linoleico e linolenico Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Belle scala determinazione della concentrazione di acidi grassi: effetti di diverse concentrazioni di acidi grassi con incrementi più piccoli (10 ng / ml) sulla salute umana epiteliale intestinalesopravvivenza cellulare. cellule epiteliali intestinali sono state trattate con concentrazioni variabili di acido oleico (a), acido linoleico (b) e acido linolenico (c). Il controllo positivo è cellule trattate con solo supporti completi, ed il controllo negativo con il 70% di etanolo. Per ogni prova, n = 3 per tutti i trattamenti tranne controllo positivo (n = 6). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Determinazione delle concentrazioni di tossina del colera utilizzabili sulla base della valutazione della domanda di diverse concentrazioni di tossina del colera sul topo macrofagi sopravvivenza: i macrofagi del mouse sono stati trattati con diverse concentrazioni di tossina colerica con incrementi maggiori (a)poi quelli più piccoli (B). Il controllo positivo è cellule trattate con solo supporti completi, ed il controllo negativo con il 70% di etanolo. Per ogni prova, n = 3 per tutti i trattamenti tranne controllo positivo (n = 6). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Sperimentale Design-determinazione degli acidi grassi appropriato e concentrazioni di tossine per l'utilizzo in studi futuri: lisati cellulari può essere utilizzato per il trattamento di macrofagi e le dinamiche di citochine possono essere qualitativamente e quantitativamente analizzati mediante immunoblotting e ELISA utilizzando anticorpi contro specifiche citochine come marcatori di infezione.
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Discussion
Suggerimento di concentrazione di acidi grassi e di tossina colerica
Mentre il meccanismo esatto di come acidi grassi migliorare l'immunità mucosale è sconosciuta, diversi studi hanno tentato di investigare loro effetti benefici. Nostro studio mira a fornire metodologia per determinare la concentrazione massima di acidi grassi che le cellule possono tollerare nonché la concentrazione massima di tossina colerica che le cellule possono tollerare senza una significativa influenza sulla sopravvivenza cellulare.
Per determinare la concentrazione di tre acidi grassi (oleico, linoleico e linolenico), così come quella della tossina colerica per il trattamento di cellule senza molto significativo effetto negativo sulla vitalità cellulare abbiamo solubilizzati gli acidi grassi e la tossina del colera e tissutali cellule in coltura trattate a differenti concentrazioni seguiti mediante saggio MTT per valutare la vitalità. Sulla base della nostra metodologia e risultati forniamo catene di acidi grassi e tossina del colera utileper le future indagini che mirano a utilizzare questi acidi grassi o tossina colerica (vedi sotto). Suggeriamo concentrazioni di 1, 5-10, e 5-10 (ng / ml) per l'acido oleico, acido linoleico e linolenico, rispettivamente, per l'utilizzo di cellule epiteliali intestinali umane. Si consiglia anche l'uso di <30 ng (per 200 pl, vedere i metodi) della tossina colerica con BALB / C macrofagi del mouse. Riconosciamo che, almeno per la tossina del colera, è stata osservata alcuna differenza significativa tra la vitalità cellulare per il controllo positivo rispetto ai trattamenti. Tuttavia, la nostra raccomandazione è basata sul relativamente elevata variabilità della vitalità cellulare che è stato osservato in conseguenza di esposizioni di livello superiore tossina.
Studi futuri
I dati forniti in questo studio per acidi grassi e livelli di tossina colerica possono essere utilizzate in studi futuri. Forniamo un esempio di una tale indagine qui.
Il colera è una malattia associata devpaesi che non hanno una corretta depurazione e impianti di trattamento delle acque e delle acque potabile eloping. Nel 2009, un numero di vittime di oltre 3.000 è stato segnalato per un periodo di cinque mesi a causa di colera sintomi correlati, in soli Zimbabwe. 14 A partire dal 2011, il colera rimane una epidemia in diverse regioni del mondo, tra cui un focolaio di Haiti (CDC, 2010) . Uno studio di genetica molecolare, nel 2010 ha mostrato la prova che il batterio in questa epidemia era di origine nepalese. 15 La malattia è causata da ingestione di cibo o acqua contaminati da feci e la colonizzazione dell'intestino da V. cholerae, seguito dal rilascio di una enterotossina. Mentre colera vaccinazioni esistono, non sempre sono efficaci nel prevenire l'infezione durante le epidemie. Sono necessari interventi efficaci e poco costosi per le popolazioni in cui si verificano epidemie di colera. Un approccio è quello di studiare se le fonti di cibo che sono ricchi di derivati come acido oleico, linoleico e linolenicofornire o migliorare l'immunità mucosale contro l'infezione da colera. Funzioni di immunità mucosale attraverso l'uso di proteine recettori presenti sulla superficie delle cellule, come i recettori Toll-like (TLR 16) e domini nucleotide-binding (NLRs). Attraverso cambiamenti nella composizione della membrana e il rilascio di ligandi che interagiscono con i TLR e NLRs, l'aggiunta di acidi grassi all'epitelio intestinale può migliorare la funzione del recettore nel riconoscere microbi pericolosi e reclutare le risposte immunitarie adeguate. Per determinare grassi effetti acidi sull'infezione colera, dinamiche citochine, quali il rilascio della cellula di TNF-α, IL-6, IL-10 e IL-12, deve essere studiato più in cellule epiteliali intestinali umane che in macrofagi topo (Figura 4). Tale conoscenza da studi futuri ci aiuterà a capire meglio il meccanismo con cui gli acidi grassi potrebbero funzionare per prevenire l'infezione, al fine di fornire in ultima analisi, gli interventi efficaci per inibire la colleraa focolai. È possibile che il trattamento delle cellule con acidi grassi prima dell'infezione tossina colerica aiuterà indurre e / o potenziare la risposta immunitaria mucosale nell'epitelio intestinale, aumentando in ultima analisi la vitalità cellulare durante l'infezione microbica colera.
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Disclosures
Gli autori di questo studio hanno alcun interesse finanziario dei risultati di questo studio. Finanziamento per questo studio è stato fornito al FT da Kean University, tuttavia, FT è attualmente un dipendente a Kingsborough Community College.
Acknowledgments
Ringraziamo Paula Cobos e il Dr. Evros Vassiliou per l'assistenza di laboratorio e di fornire i macrofagi del mouse, rispettivamente. Ringraziamo anche il nostro laboratorio direttore Richard Criasia per guida e aiuto con i materiali. Infine, gli autori ringraziano Ramanpreet Kaur per un aiuto con la produzione video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagent | |||
| Mus musculus macrophages | ATCC | ATCC RAW 264.7 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | ATCC | 30-2002 | |
| L-glutamine | ATCC | 30-2115 | |
| Fetal bovine serum | Bio-west | S0250 | |
| Antibiotic/antimycotic | Hyclone | SV3007901 | |
| Human intestinal epithelial cells | ATCC | ATTC CCL-241 | |
| HybriCare media | ATCC | 46-X | |
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Linoleic Acid | Sigma-Aldrich | L-1376 | |
| Linolenic Acid | Sigma-Aldrich | L-2376 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Equipment | |||
| BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates | BD Biosciences | 351172 | |
| Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software | Dynex | 91000101 | |
References
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