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एक छोटे आणविक CLT1 पेप्टाइड लक्ष्य विपरीत एजेंट के साथ प्रोस्टेट कैंसर के एमआर आण्विक इमेजिंग

Published: September 3, 2013 doi: 10.3791/50565
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 2Department of Translational Hematology & Oncology Research, Cleveland Clinic, Case Western Reserve University, 3Department of Molecular Biology & Microbiology, Case Western Reserve University

Summary

एक माउस प्रोस्टेट कैंसर के मॉडल में ट्यूमर स्ट्रोमा में पका प्लाज्मा प्रोटीन के लिए विशिष्ट एमआरआई इसके विपरीत एजेंट लक्षित एक छोटे पेप्टाइड के साथ श्री कैंसर आणविक इमेजिंग प्रदर्शित करने के लिए.

Abstract

ट्यूमर बाह्य मैट्रिक्स कैंसर आणविक इमेजिंग के लिए बायोमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैंसर से संबंधित प्रोटीन की बहुतायत है. इस काम में, हम ट्यूमर स्ट्रोमा में पका प्लाज्मा प्रोटीन के लिए विशिष्ट लक्षित एमआरआई इसके विपरीत एजेंट के रूप में जी.डी.-DOTA monoamide जटिल लक्षित एक छोटे आणविक पेप्टाइड के साथ प्रभावी एमआर कैंसर आणविक इमेजिंग प्रदर्शन किया. हम एक माउस orthotopic पीसी -3 प्रोस्टेट कैंसर के मॉडल में एमआरआई के साथ प्रोस्टेट ट्यूमर की गैर इनवेसिव का पता लगाने के लिए एजेंट के प्रभाव का मूल्यांकन करने का प्रयोग किया. लक्ष्य विपरीत एजेंट 0.03 mmol जी.डी. / किलो के एक कम खुराक पर महत्वपूर्ण ट्यूमर विपरीत वृद्धि का उत्पादन करने के लिए प्रभावी था. एमआरआई इसके विपरीत एजेंट लक्षित पेप्टाइड प्रोस्टेट ट्यूमर के एमआर आणविक इमेजिंग के लिए वादा किया है.

Introduction

कैंसर से संबंधित आणविक लक्ष्य के प्रभावी इमेजिंग पहले कैंसर का पता लगाने और निदान की सटीकता में सुधार के लिए बहुत महत्व का है. चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के उच्च स्थानिक संकल्प और कोई आयनीकरण विकिरण 1 के साथ एक शक्तिशाली नैदानिक ​​इमेजिंग साधन है. हालांकि, कोई लक्ष्य विपरीत एजेंट नैदानिक ​​एमआर कैंसर आणविक इमेजिंग के लिए उपलब्ध है. लक्षित एमआरआई इसके विपरीत एजेंटों के अभिनव डिजाइन और विकास बहुत एमआर कैंसर आणविक इमेजिंग के आवेदन अग्रिम होगा. महत्वपूर्ण प्रयासों के कैंसर की कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त बायोमार्कर के एमआर इमेजिंग के लिए लक्ष्य विपरीत एजेंटों को विकसित करने के लिए बनाया गया है. कारण एमआरआई और इन बायोमार्कर की कम एकाग्रता की अपेक्षाकृत कम संवेदनशीलता के लिए, यह छोटे आणविक लक्ष्य विपरीत एजेंटों 2,3 का उपयोग प्रभावी एमआर आणविक इमेजिंग के लिए पर्याप्त विपरीत वृद्धि उत्पन्न करने के लिए एक चुनौती है. पर्याप्त वृद्धि प्राप्त करने के लिए, विभिन्न वितरण प्रणाली सफलतासमचुंबक जी.डी. (तृतीय) chelates के एक उच्च पेलोड के साथ liposomes, नैनोकणों और बहुलक conjugates के रूप में घंटे लक्ष्य साइटों 4,5 पर विपरीत एजेंटों की स्थानीय एकाग्रता बढ़ाने के लिए तैयार किया गया है. इन वितरण प्रणाली पशु मॉडल में महत्वपूर्ण ट्यूमर वृद्धि उत्पन्न करने में सक्षम थे, उनके बड़े आकार गंभीर सुरक्षा चिंताओं 6 कारण हो सकता है जो विषाक्त जी.डी. (तृतीय) आयनों के लंबे समय तक संचय में जिसके परिणामस्वरूप शरीर से धीमी गति से और अधूरा उन्मूलन में हुई. हाल ही में, कुछ अध्ययनों आणविक इमेजिंग के लिए एमआरआई की सीमाओं घावों में उच्च स्थानीय अभिव्यक्ति के साथ उचित आणविक बायोमार्कर का चयन और आसानी से 7,8 उत्सर्जित किया जा सकता है कि छोटे आणविक एजेंटों का उपयोग करके दूर किया जा सकता है दिखाया है. इन एजेंटों की प्रमुख विशेषता है कि वे सामान्य ऊतकों में थोड़ा उपस्थिति के साथ रोगग्रस्त ऊतकों में बहुतायत से मौजूद आणविक मार्कर है कि लक्ष्य है. इसके विपरीत एजेंटों के एक उच्च एकाग्रता suffi में जिसके परिणामस्वरूप, इन लक्ष्यों के लिए बाध्य कर सकते हैंप्रभावी एमआर आणविक इमेजिंग के लिए cient विपरीत वृद्धि. उनके आकार गुर्दे छानने का काम सीमा की तुलना में छोटी है, अनबाउंड विपरीत एजेंटों को आसानी से कम पृष्ठभूमि शोर के साथ शरीर से उत्सर्जित किया जा सकता है. हम बहुतायत से ट्यूमर स्ट्रोमा में मौजूद हैं, जो एक सार्वभौमिक कैंसर से संबंधित biomarker, पका प्लाज्मा प्रोटीन, चयनित, और सामान्य ऊतकों 9 में मुश्किल से ही मौजूद हैं. हम मजबूत PC3 प्रोस्टेट ट्यूमर मॉडल 10 के लिए बाध्य विशिष्ट, और चार जी.डी.-DOTA monoamide chelates पता चला है जो एक छोटे से निशाना पेप्टाइड CGLIIQKNEC (CLT1), जिसमें एक लक्ष्य विपरीत एजेंट संश्लेषित. यहाँ, हम चूहों में ट्यूमर का पता लगाने के लिए एमआर कैंसर आणविक इमेजिंग के लिए एक पद्धति प्रदान करते हैं.

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Protocol

प्रोटोकॉल एक पूर्व अध्ययन 11 से रूपांतरित किया.

1. CLT1 पेप्टाइड करने के लिए जी.डी.-DOTA के विकार

  1. मानक ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण का उपयोग करना, एक 2 chlorotrityl क्लोराइड राल (1.0 mmol) पर Fmoc-संरक्षित अमीनो एसिड से CLT1 पेप्टाइड (CGLIIQKNEC) synthesize.
  2. अंतिम अमीनो एसिड जोड़ने के बाद, 2 घंटे के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर DMF में थैलियम (तृतीय) trifluoroacetate (1.09 ग्राम, 2.0 mmol, 2 समकक्ष) के साथ पर राल रैखिक पेप्टाइड (20 मिलीग्राम) cyclize.
  3. अगला, संयुग्म खूंटी और Fmoc-एनएच खूंटी COOH (3.0 mmol), Fmoc-LYS (Fmoc), ओह (3.0 mmol) के साथ क्रमिक रूप से प्रतिक्रिया द्वारा राल पर CLT1 पेप्टाइड (1.0 mmol) के एन टर्मिनस तक लाइसिन क्रमिक रूप से, और Fmoc-LYS (Fmoc), ओह (6 mmol) के एक दूसरे बैच.
  4. Piperidine साथ Fmoc निकालें. DOTA-Tris (टी बू) (4.58 जी, प्रत्येक अमीनो समूह को 8.0 mmol, 2 समकक्ष) 2 घंटे के लिए राल पर लाइसिन dendrimer से चार मुक्त amines के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ें.
  5. अंत में, फोड़ना और उत्पाद deprotecttrifluoroacetic एसिड, पानी, और आरटी पर 8 घंटे के लिए triisobutylsilane (तीस) (20 मिलीलीटर, 95/2.5/2.5) के एक कॉकटेल के साथ इलाज के द्वारा राल से. Trifluoroacetic एसिड (TFA) से धोने के द्वारा पीछा निस्पंदन द्वारा राल निकालें. संयुक्त filtrates ठंड एथिल ईथर (200 मिलीलीटर), अपकेंद्रित्र को dropwise जोड़ें, और एथिल ईथर 4x से धो लें. एक रंगहीन ठोस (1.99 ग्राम, 61% उपज) देने के लिए शून्य के नीचे सूखी.
  6. 10 मिनट के लिए विलायक एक में 20 मिनट और 40-90% विलायक बी के लिए 0-40% विलायक बी के एक ढाल विलायक एक में (acetonitrile में 0.1% TFA) (0.1% TFA जलीय घोल) का उपयोग प्रारंभिक HPLC साथ कच्चे उत्पाद शुद्ध .
  7. CLT1-DL-(DOTA) डि पानी में 4 (250 मिलीग्राम, 0.077 mmol) (15 मिलीलीटर) को भंग करने और 1 एम NaOH का उपयोग 6 पीएच को समायोजित. जी.डी. (OAC) 3 .4 एच 2 ओ जोड़ें (472 मिलीग्राम, 0.462 mmol, DOTA monoamide 1.5 समकक्ष) समाधान करने के कुछ भागों में, 1 एम NaOH का उपयोग 6 पर पीएच बनाए रखने. 48 घंटे के लिए आरटी पर प्रतिक्रिया समाधान हिलाओ.
  8. परिसर ई के साथ अवशिष्ट जी.डी. (तृतीय)thylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (90 मिलीग्राम, 0.31 mmol), और अंतिम उत्पाद CLT1-DL-(जी.डी.-DOTA) 4 (169 मिलीग्राम, 57%) देने के लिए एक आकार अपवर्जन स्तंभ के साथ कच्चे तेल उत्पाद शुद्ध.

2. कंट्रास्ट एजेंटों की विशेषता

  1. उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा ऑप्टिकल उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ जी.डी. (तृतीय) सामग्री को मापने.
  2. एक मैट्रिक्स के रूप में 2,5-dihydroxybenzoic एसिड (2,5-DHB) के साथ रेखीय मोड में मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण समय की उड़ान (MALDI-TOF) जन स्पेक्ट्रा मोल.
  3. एक relaxometer साथ CLT1-DL-(जी.डी.-DOTA) 4 के विपरीत एजेंटों और एक nontargeted नियंत्रण एजेंट 60 मेगाहर्ट्ज (1.5 टी) पर विभिन्न सांद्रता के साथ sCLT1-DL-(जी.डी.-DOTA) 4 के जलीय घोल का विश्राम समय को मापने 37 डिग्री सेल्सियस पर टी 2 को मापने के लिए 500 गूँज के साथ टी -1 और एक कैर-परसेल-Meiboom-गिल अनुक्रम को मापने के लिए एक उलटा वसूली पल्स अनुक्रम का प्रयोग करें. टी -1 और टी वीं की 2 relaxivities की गणनाजी.डी. सांद्रता बनाम 1 / टी 1 और 1/2 टी के भूखंडों की ढलानों से ई एजेंटों.

3. Orthotopic PC3 प्रोस्टेट ट्यूमर के साथ पशु मॉडल की सेल संस्कृति और विकास

  1. / Μl पीबीएस 2.5 x 10 4 कोशिकाओं के घनत्व में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / fungizone, trypsinization द्वारा फसल और resuspend के साथ पूरक RPMI मध्यम में हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) के विधान अभिव्यक्ति के साथ संस्कृति PC3 प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं.
  2. CWRU संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित एक जानवर प्रोटोकॉल के अनुसार athymic पशु कोर सुविधा, केस वेस्टर्न रिजर्व विश्वविद्यालय (CWRU) में (4-5 सप्ताह पुराने) पुरुष एनआईएच athymic नग्न चूहों बनाए रखें.
  3. शल्य सतहों 2% chlorhexidine समाधान के साथ स्प्रे और फिर शोषक पर्दे के साथ कवर किया गया. बाँझ सर्जिकल दस्ताने प्रक्रिया के दौरान पहने थे. पशु शल्य चिकित्सा से पहले, आईपी anesthetiz को Avertin (250 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्षनचूहों ई. वैकल्पिक रूप से, Ketamine / xylazine / acepromazine 50/5/1 मिलीग्राम / किलो के एक एकाग्रता में इस्तेमाल किया जा सकता है. नेत्र मरहम संज्ञाहरण के दौरान पर्याप्त मात्रा में नमी बनाए रखने के लिए माउस को लागू किया गया था.
  4. एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग कर के बारे में 1 सेमी की लंबाई में कम midline के साथ त्वचा और पेरिटोनियम के माध्यम से एक छोटा सा चीरा काटने से सर्जरी शुरू करो. एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा अस्तित्व सर्जरी के दौरान चीरा स्थल के चारों ओर कवर किया गया था.
  5. धीरे अमल में और प्रोस्टेट बेनकाब करने के लिए प्रोस्टेट पृष्ठीय पालियों को स्थिर. एक 30 गेज सुई के साथ प्रोस्टेट में पीबीएस (20 μl) में PC3-GFP कोशिकाओं के निलंबन इंजेक्षन. अंत में 12 autoclip घाव के साथ चीरा बंद करें.
  6. बाद प्रक्रिया की निगरानी के लिए, 1 सप्ताह के लिए दिन में दो बार पशुओं की निगरानी. बीमारी के लक्षण खाने की कमी, मूत्रमार्ग के आसपास काले मूत्र एकत्रित करना, और स्टेपल में मूत्राशय के संक्रमण या रोड़ा का संकेत मिलता है जो अस्थिर चाल में शामिल हैं.
  7. 10 दिनों के बाद, टी हटानेवह स्टेपल एक प्रधान पदच्युत का उपयोग कर. ट्यूमर के आकार और वजन घटाने, व्यवहार विचलन, और मोटर दोष के रूप में दर्द का कोई सबूत का आकलन करने के लिए दैनिक जानवरों मॉनिटर. ट्यूमर के विकास के दौरान दर्द की नैतिकता की दृष्टि से स्वीकृत सीमा या सबूत से अधिक एक ट्यूमर के आकार से पता चला है जो पशुओं euthanize.

4. प्रतिदीप्ति इमेजिंग और ऊतक विज्ञान के साथ पेप्टाइड्स के ट्यूमर बंधन विशिष्टता की पुष्टि

  1. ट्यूमर सेल टीका के बाद, ट्यूमर के विकास की लगभग 4 सप्ताह इमेजिंग के साथ शुरू करने से पहले अनुमति देते हैं. पिछले पेप्टाइड जांच के इंजेक्शन को ट्यूमर की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति इमेजर पर लाइव चूहों के साथ GFP प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त.
  2. चतुर्थ टेक्सास लाल 10 nmol / माउस की एक खुराक पर चूहों असर ट्यूमर को पेप्टाइड्स लेबल इंजेक्षन.
  3. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद चूहों 2 घंटा त्याग, ट्यूमर और प्रमुख अंगों को इकट्ठा करने, और एक प्रतिदीप्ति इमेजर पर तुरंत छवि. GFP (उत्तेजना के लिए हरी बत्ती फिल्टर का उपयोग करें: 444-490 एनएम, उत्सर्जन: 515 एनएम लंबे पास फिल्टर, अधिग्रहण सेटिंग्स: 500-720 10 में एनएम कदम) और टेक्सास लाल (उत्तेजना के लिए लाल बत्ती फिल्टर: 576-621 एनएम, उत्सर्जन: 635 एनएम लंबे पास फिल्टर, अधिग्रहण सेटिंग्स: 630-800 10 में एनएम कदम). GFP और टेक्सास लाल के लिए 150 मिसे के लिए 10 मिसे समय जोखिम.
  4. इसके तत्काल बाद पूरे ऊतक प्रतिदीप्ति की माप के बाद, ट्यूमर ऊतकों इकट्ठा formalin के साथ ठीक है, और cryosection 5 माइक्रोन स्लाइस में.
  5. पीबीएस के साथ rinsing के बाद, तुरंत एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग पर 4 युक्त बढ़ते मध्यम की 1 बूंद ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), छवि के साथ माउंट.

5. चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)

  1. लगभग 4 सप्ताह ट्यूमर सेल टीका के बाद, ट्यूमर व्यास में 0.3-0.6 सेमी तक बढ़ने की अनुमति देते हैं. एमआरआई अध्ययन के लिए एक मात्रा रेडियो आवृत्ति (आरएफ) तार के साथ एक 7 टी एमआरआई स्कैनर का प्रयोग करें.
  2. एक isoflurane प्रेरण कक्ष में एक 2 isoflurane% ऑक्सीजन के मिश्रण के साथ माउस anesthetize. Ophthalmic मरहम संज्ञाहरण के दौरान पर्याप्त मात्रा में नमी बनाए रखने के लिए माउस को लागू किया गया था.
  3. Heparinized खारा से भरा एक 1.0 मीटर लंबी ट्यूबिंग में एक 30 गेज सुई डालें. माउस पूंछ नस में स्वयं बनाया कैथेटर रखें.
  4. चुंबक में माउस प्लेस और एक नाक शंकु के माध्यम से 1.5 isoflurane% ऑक्सीजन के साथ साँस लेना संज्ञाहरण के तहत रहते हैं.
  5. दर और श्वसन की गहराई पर नजर रखने के पेट पर एक निगरानी प्रणाली से जुड़े एक श्वसन सेंसर रखें. एक प्रतिक्रिया नियंत्रण प्रणाली के माध्यम से चुंबक में गर्म हवा बह द्वारा 37 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए रखें.
  6. ट्यूमर स्थान (टी.आर. / ते = 200/3.7 मिसे, FOV = की पहचान करने के लिए एक स्थानीयकृत अनुक्रम का उपयोग बाण के समान अनुभाग छवियों के साथ शुरू 3.0 सेमी, टुकड़ा मोटाई = 2.2 मिमी, टुकड़ा संख्या = 16, औसत = 2, फ्लिप कोण = 45 °, मैट्रिक्स = 128 x 128).
  7. CE-एमआरआई (टी.आर. / ते = 151.2/1.9 मिसे, FOV = 3.0 सेमी x 3.0 सेमी, के लिए 2 डी अक्षीय छवियों को प्राप्त करने के लिए एक 2 डी T1 भारित ढाल वसा दमन अनुक्रम का उपयोग हैजूँ मोटाई = 1.2 मिमी, टुकड़ा संख्या = 12, औसत = 1, फ्लिप कोण = 80 °, मैट्रिक्स = 128 x 128).
  8. पूर्व इंजेक्शन आधारभूत एमआर छवि अधिग्रहण के बाद, खारा के 200 μl के साथ निस्तब्धता द्वारा 0.03 mmol जी.डी. / किलो की एक खुराक पर लक्षित एजेंट या नियंत्रण एजेंट इंजेक्षन करने लगते हैं.
  9. अप करने के लिए 30 मिनट के लिए अलग अलग समय बिंदुओं पर CE-एमआरआई छवियों को प्राप्त करने के लिए आगे बढ़ें.

6. इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण

  1. छवि विश्लेषण के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
  2. दो आयामी इमेजिंग विमान में पूरे ट्यूमर पर ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों और गुर्दे ड्रा और औसत संकेत तीव्रता को मापने.
  3. (एस 0 - ΔSNR = (एस टी / σ T): CE-एमआरआई डेटा यों, निम्न समीकरण का उपयोग पूर्व विपरीत SNR ओवर के बाद विपरीत SNR में वृद्धि के हिसाब से ट्यूमर या गुर्दे विपरीत वृद्धि (ΔSNR) उपाय / σ 0), एस 0 और एस टी Tum में संकेत निरूपित जहांया या गुर्दे से पहले और इसके विपरीत, और σ 0 और σ टी के बाद इसके विपरीत पहले और बाद में पृष्ठभूमि हवा से मापा शोर का मानक विचलन कर रहे हैं.
  4. पी <0.05 पर सांख्यिकीय महत्व संभालने, छात्र की दो पूंछ टी परीक्षण का उपयोग कर पी मूल्यों की गणना.

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Representative Results

चित्रा 1 लक्ष्य विपरीत एजेंट CLT1-DL-(जी.डी.-DOTA) 4 और प्रयोग की समग्र योजना के संश्लेषण को दर्शाया गया है. नैदानिक ​​जी.डी.-DOTA (1 टेबल) से CLT1-DL-(जी.डी.-DOTA) 4 शो बहुत अधिक relaxivity. 1.5 टी में पीबीएस में CLT1-DL-(जी.डी.-DOTA) 4 (7.4 पीएच) के gadolinium प्रति 1 टी relaxivity जी.डी.-DOTA 10 की तुलना में लगभग 3 गुना अधिक है. गैर विशिष्ट (sCLT1 टी.आर.) (चित्रा 2) के बंधन बहुत छोटे ट्यूमर से पता चलता है पेप्टाइड तले जबकि उस्ताद इमेजिंग, लाल सामान्य अंगों और ऊतकों को थोड़ा बाइंडिंग के ट्यूमर को CLT1 (CLT1 टी.आर.) लेबल टेक्सास के बंधन मजबूत विशिष्ट पुष्टि करता है. चित्रा 3 ठेठ पूर्व से पता चलता है और बढ़ाया बाद इंजेक्शन विपरीत (सीई) टी 1 भारित छवियों. लक्षित एजेंट गैर लक्षित तले एजेंटों की तुलना में ट्यूमर के ऊतक में अधिक से अधिक और लंबे समय तक वृद्धि में यह परिणाम है. मूत्राशय में विपरीत वृद्धि धीरे - धीरे खत्म बढ़ जाती हैसमय, विपरीत एजेंटों गुर्दे छानने का काम के माध्यम से उत्सर्जित कर रहे थे कि यह दर्शाता है. मात्रात्मक संकेत विश्लेषण लक्षित एजेंट 30 मिनट के लिए ऊपर नियंत्रण एजेंट (पी <0.05) की तुलना में ट्यूमर के ऊतक में अधिक महत्वपूर्ण संकेत वृद्धि का उत्पादन किया है कि पता चलता है. biodistribution अध्ययन एजेंट 2 दिनों के इंजेक्शन के बाद मुख्य अंगों और ऊतकों में न्यूनतम जी.डी. प्रतिधारण है दिखाता है. हमारी प्रारंभिक आंकड़ों CLT1 एमआरआई इसके विपरीत एजेंट विशेष रूप से अपेक्षाकृत कम खुराक (नैदानिक ​​खुराक की एक तिहाई) में ट्यूमर को दिया जा सकता है कि लक्षित पता चलता है.

आर 2 (मिमी -1. एस -1) आर 1 (मिमी -1. एस -1) जी.डी. सामग्री (mmol-जी.डी. / छ)
प्रति जी.डी. अणु प्रति प्रति जी.डी. पीएर अणु
CLT1-(जी.डी.-DOTA) 4 10.1 ± 1.0 40.4 ± 3.0 13.0 ± 3.1 52.0 ± 9.6 1.05 ± 0.10
sCLT1-(जी.डी.-DOTA) 4 11.5 ± 1.4 46.0 ± 5.0 12.4 ± 0.3 49.6 ± 1.3 0.97 ± 0.08
जी.डी.-DOTA 4 2.9 * 2.9 * 3.2 * 3.2 *

तालिका 1. 1.5 टी पर लक्षित और तले हुए एमआरआई इसके विपरीत एजेंटों के भौतिक गुणों, 37 डिग्री सेल्सियस (* 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी में जी.डी.-DOTA के लिए Relaxivities संदर्भ 10 से कर रहे हैं).

चित्रा 1
> चित्रा 1. संश्लेषण की प्रक्रिया और समग्र प्रयोग की चित्रमय चित्रण. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. CLT1 टी.आर. के बंधन ट्यूमर. CLT1 टी.आर. (ए) और गैर लक्षित sCLT1 टी.आर. (बी) लक्षित 10 nmol / माउस की एक खुराक पर orthotopic PC3-GFP प्रोस्टेट असर नग्न चूहों athymic को नसों में इंजेक्शन थे. 2 घंटे के बाद, ट्यूमर और विभिन्न अंगों एकत्र किए गए थे और imaged. हरी प्रतिदीप्ति छवियों PC3-GFP ट्यूमर कोशिकाओं से कर रहे हैं. लाल प्रतिदीप्ति छवियों CLT1 टी.आर. (ए) और sCLT1 टी.आर. (बी) जांच से हैं. 1. ट्यूमर, 2. तिल्ली, 3. दिल, 4. गुर्दे, 5. अंडकोष, 6. जिगर, 7. फेफड़ों, 8. मांसपेशी, 9. मस्तिष्क.565fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रतिनिधि T1 भारित अक्षीय 2 डी ढाल orthotopic पीसी-3 मानव प्रोस्टेट ट्यूमर की छवियों CLT1-DL-(जी.डी.-DOTA) 4 (क) और sCLT1-DL-(जी.डी.-DOTA) 4 (बी) की नसों में इंजेक्शन से पहले और बाद में परमाणु / परमाणु चूहों लाल वृत्त और ग्रीन सर्कल के साथ लेबल मूत्राशय के साथ लेबल. ट्यूमर में 0.03 mmol जी.डी. / किग्रा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

गंभीर कदम

उचित biomarker और छोटे पेप्टाइड को निशाना बनाने का चयन

सफलतापूर्वक छोटे आकार के साथ एक लक्ष्य विपरीत एजेंट को विकसित करने के लिए, दो महत्वपूर्ण बिंदुओं पर विचार करने की आवश्यकता है. सबसे पहले, यह सामान्य ऊतकों में थोड़ा उपस्थिति के साथ रोगग्रस्त ऊतकों में बहुतायत से मौजूद हैं, जो उचित आणविक बायोमार्कर का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे चयनित कैंसर से संबंधित biomarker, पका प्लाज्मा प्रोटीन, इस आवश्यकता को पूरा करती है. पर्याप्त विपरीत एजेंटों काफी विपरीत वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप, इन लक्ष्यों के लिए बाध्य कर सकते हैं ताकि दूसरा, चयनित लक्षित छोटे आणविक एजेंट बायोमार्कर के लिए उच्च बंधन संबंध होना चाहिए. इस अध्ययन में, हम ट्यूमर 11 में पका प्लाज्मा प्रोटीन के लिए बाध्य मजबूत विशिष्ट पता चलता है कि थक्का बाध्यकारी पेप्टाइड CLT1 चुना है.

एजेंट संश्लेषण कंट्रास्ट

पेप्टाइड संश्लेषण बैल शामिलअंतिम चक्रीय CLT1 पेप्टाइड के लिए फार्म रैखिक पेप्टाइड अणु में दो thiol समूहों idizing. पेप्टाइड cyclisation आमतौर पर संभावित एकत्रीकरण, dimerization और oligomerization कम करने के लिए कम एकाग्रता में समाधान में आयोजित किया जाता है, whilst पर राल चक्रगति छद्म कमजोर पड़ने घटना का लाभ लेता है और साथ ही सरल धोने और छानने का काम 13 से अभिकर्मकों को हटाने. हमारे संश्लेषण की प्रक्रिया में, हम इसे संभाल जबकि थैलियम (तृतीय) trifluoroacetate बहुत विषाक्त और देखभाल है, हालांकि, उच्च उपज और थोड़ा dimerization के साथ अच्छी तरह से काम करता है trifluoroacetate थैलियम (तृतीय) के प्रयोग पर राल चक्रगति लिया जाना चाहिए कि लगता है. एक दूसरा दृष्टिकोण कम पेप्टाइड एकाग्रता पर समाधान में 20% DMSO का उपयोग करता है. हालांकि अधिक कदम DMSO को दूर करने की जरूरत है, और बड़ी मात्रा समाधान lyophilizing अब लगता है. किसी भी विधि का उपयोग करके, यह intramolecular डाइसल्फ़ाइड बांड की पूरी गठन के बारे में सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. जी.डी. साथ पेप्टाइड ligand complexing जब, मुफ्त thiols पैदा कर सकते हैंपर्याप्त aggregations बफर में धातु का पता लगा polymerization 14 के लिए फार्म सिस्टीन की overoxidation में जिसके परिणामस्वरूप, हवा ऑक्सीकरण को उत्प्रेरित करता है. यह आमतौर पर नाटकीय रूप से अंतिम उत्पाद की उपज और शुद्धता कम हो जाती है. सुनिश्चित करें कि पूरा डाइसल्फ़ाइड बैंड गठन करने के लिए, पहले हम डिमर या उच्च oligomer गठन में जिसके परिणामस्वरूप intermolecular डाइसल्फ़ाइड बांड के गठन से बचने के लिए हल्के oxidization शर्तों का उपयोग करने की आवश्यकता है. दूसरे, लंबे समय पर्याप्त प्रतिक्रिया समय सभी thiol समूहों जी.डी. संयुग्मन कदम से पहले ऑक्सीकरण रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए बनाए रखा जाना चाहिए.

माउस पूंछ नस के पशु मॉडल और cannulation

पशु ट्यूमर मॉडल और पूंछ नस केन्युलेशन की तैयारी भी इस प्रक्रिया की बहुत महत्वपूर्ण पहलू हैं. सर्जरी के दौरान, उपकरण / बेंच चूहों घायल या मार सकता है जो संभावित संक्रमण से बचने के लिए स्वच्छ और बाँझ रखा जाना चाहिए. Injec पहले और बाद में माउस को ले से बचने के लिएtion, यह माउस पूंछ नस cannulate करने के लिए आवश्यक है. , केन्युलेशन के लिए कैथेटर तैयार हब से एक 30 गेज सुई तोड़ने के लिए और एक 1.0 मीटर लंबी ट्यूबिंग में कुंद अंत डालें, और 1% heparinized खारा के साथ भरी हुई एक सिरिंज के लिए ट्यूबिंग का एक और अंत कनेक्ट करने के लिए. ट्यूबिंग को भरने के लिए सिरिंज पुश. गर्म पानी (~ 105 ° एफ) के साथ पूंछ चौड़ा करना. नस में सुई डालें. ट्यूबिंग में रक्त backflow कैथेटर की सफल प्रविष्टि को इंगित करता है. सुई नस में है, यह सत्यापित करने के लिए, धीरे सिरिंज धक्का और खारा सुचारू नस खारा की एक छोटी राशि के इंजेक्शन के साथ मंजूरी दे दी है, इंजेक्शन जा सकता है. स्कैनर के लिए माउस को ले से पहले टेप के साथ जगह में कैथेटर को ठीक करें.

सीमाओं और संभावित संशोधन

कई सीमाएं हमारे वर्तमान अध्ययन में शामिल हैं. सबसे पहले, प्रारंभिक परिणामों से हम यह श हालांकि CLT1 लक्ष्यीकरण साइट से बहुत जल्दी बाहर washes कि नोटिसअन्य कल्याणकारी योजनाएं ट्यूमर के लिए बाध्य उत्कृष्ट. में vivo proteolytic गिरावट की संभावना CLT1 की अस्थिरता का कारण बनता है. Proteolytic गिरावट के खिलाफ की रक्षा के लिए CLT1 के संशोधन इसकी स्थिरता में सुधार और इन विवो में अपने नाकारा व्यक्ति लम्बा समय चाहिए. प्राकृतिक एल प्रकार अमीनो एसिड को बदलने के लिए डी टाइप अमीनो एसिड का उपयोग कर इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए एक संभावित रणनीति है. दूसरा, वर्तमान अध्ययन CLT1 पेप्टाइड को बांध पका प्लाज्मा प्रोटीन में जो सटीक घटकों को स्पष्ट नहीं करता है. अंत में, हम मुख्य रूप से अपेक्षाकृत कम उपज और उच्च लागत के साथ ठोस चरण संश्लेषण का उपयोग विपरीत एजेंटों synthesize. एक तरल चरण संश्लेषण विधि का विकास उपज बढ़ाने और लागत कम करना चाहिए.

ऐप्लकेशन

हम इसके विपरीत बढ़ाकर एमआरआई के साथ छोटे घातक ट्यूमर की सटीक पहचान के लिए तकनीक विकसित कर रहे हैं. लक्षित एजेंट के साथ एमआरआई कैंसर आणविक इमेजिंग के लिए एक अधिक प्रभावी और सुरक्षित विकल्प प्रदान करता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन जीआरए स्प्रिंग 09 Postdoctoral फैलोशिप (09POST2250268) और एनआईएच R01 CA097465 द्वारा भाग में समर्थित है. हम अत्यधिक ट्यूमर आरोपण पर उसकी सहायता के लिए डा. वेन ली और डॉ. विकास Gulani एमआरआई प्रोटोकॉल परीक्षण और स्थापना के लिए, और सुश्री वॉन्नी पार्कर सराहना करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Fmoc protected amino acids EMD Chemicals Inc
DOTA-tris(t-Bu) TCI America
PyBOP, HOBt, HBTU Nova Biochem
DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TIS Sigma-Aldrich Corp.
Texas Red, succinimidyl ester, single isomer Invitrogen T20175
EQUIPMENTS
Agilent 1100 HPLC system Agilent
ZORBAX 300SB-C18 PrepHT column Agilent
ICP-–S Optima 3100XL Perkin-Elmer
MALDI-TOF mass spectrometer Bruker AutoflexTM Speed
Maestro FLEX In Vivo Imaging System Cambridge Research Instrumentation, Inc.
Biospec 7T MRI scanner Bruker

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References

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Wu, X., Lindner, D., Yu, G. P.,… More

Wu, X., Lindner, D., Yu, G. P., Brady-Kalnay, S., Lu, Z. R. MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent. J. Vis. Exp. (79), e50565, doi:10.3791/50565 (2013).

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