La mort cellulaire associée à la mitose anormale constatée par imagerie confocale dans des cellules vivantes du cancer

Résumé

L'activité cytotoxique de l'phénanthridiniques PJ-34 dans les cellules cancéreuses en mitose a été documentée en temps réel par imagerie confocale en direct. 34-PJ cancer du sein humain éradiqué MDA-MB-231 cellules hébergeant des extra-centrosomes dans la mitose. Contrairement à la mitose bifocal normale, les extra-centrosomes sont regroupés dans les deux pôles du fuseau, en présence d'PJ-34.

Résumé

Dérivés de phénanthrène agissant comme inhibiteurs puissants PARP1 empêché le regroupement bi-focal de centrosomes surnuméraires dans les cellules cancéreuses humaines multi-centrosomales en mitose. Le phénanthridiniques PJ-34 est la molécule la plus puissante. Declustering d'extra-centrosomes provoque l'échec de la mitose et la mort cellulaire dans les cellules multi-centrosomales. Cancers humains les plus solides ont une forte présence des extra-centrosomes. L'activité de PJ-34 a été documentée en temps réel par imagerie confocale de cancer du sein humain vivant des cellules MDA-MB-231 transfectées avec des vecteurs codant pour fluorescent γ-tubuline, ce qui est très abondant dans les centrosomes et fluorescent histone H2B présent dans les chromosomes. Arrangements de chromosomes aberrants et de cluster-foyers γ-tubuline représentant centrosomes declustered ont été détectés dans les cellules transfectées MDA-MB-231 après le traitement avec PJ-34. Un-cluster-centrosomes supplémentaire dans les deux pôles du fuseau précédé leur mort cellulaire. Ces résultats liés for la première fois l'activité cytotoxique exclusive récemment détecté de PJ-34 dans les cellules cancéreuses humaines avec des extra-centrosomes de-regroupement dans la mitose, et l'échec de la mitose conduisant à la mort cellulaire. Selon les résultats précédents observés par imagerie confocale de cellules fixes, PJ-34 cellules cancéreuses exclusivement éradiqué avec Multi-centrosomes sans altérer les cellules normales en mitose avec deux centrosomes et les broches bi-focal. Cette activité cytotoxique de PJ-34 n'a pas été partagée par d'autres PARP1 inhibiteurs puissants, et a été observée dans PARP1 déficientes MEF extracentrosomes hébergeant, suggérant son indépendance de PARP1 inhibition. Vivez l'imagerie confocale offre un outil utile pour identifier de nouvelles molécules éradiquer les cellules en mitose.

Introduction

Phénanthrène dérivé PARP1 inhibiteurs, y compris PJ-34, ont été conçus pour protéger les cellules au repos de la mort cellulaire par apoptose induite par le consommateur d'énergie PARP1 médiation réparation de l'ADN dans des conditions de stress (accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde) ^1. Toutefois, récemment, nous avons découvert que PJ-34, à une concentration deux fois plus élevée que celle induisant PARP1 inhibition, peut exclusivement provoquer la mort cellulaire dans les cellules cancéreuses humaines ^2,3. Le plus rapide de la prolifération de la cellule était, le plus efficace à l'éradication des cellules était. L....

Protocole

1. Culture cellulaire Préparation

Cellules MDA-MB-231 ont été achetés auprès de l'ATCC (American Type Culture Collection) et stockés dans de l'azote liquide.

1. Seed 10 ⁶ cellules MDA-MB-231 cellules dans 92 mm de diamètre boîte de Pétri dans 10 ml de milieu complet contenant Dulbeco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% de sérum de cheval, 1% de L-glutamine et 1% Penstrep-Amphotéricine B. Laisser les cellules à proliférer à environ 80-100% de confluence.
2. Retirer milieu de culture de plat et le jeter.
3. Laver la couche de cellules brièvement avec 0,25% (p / v) solution de trypsine-EDTA pou....

Résultats

PJ-34 est un stable soluble dans l'eau phénanthridiniques ¹ (figure 1). Nos résultats précédents ont révélé la mort cellulaire et de-regroupés extra-centrosomes dans plusieurs types de cellules cancéreuses multi-centrosomales fixes qui ont été traités avec PJ-34. En revanche, les cellules proliférantes normales n'ont pas été altérées ^2,3. Centrosomes ont été identifiés par un double marquage avec des anticorps dirigés contre centrine1 et γ-tubuline dans les cellules extra-c.......

Discussion

Vivez l'imagerie confocale a fourni une documentation en temps réel de l'effet cytotoxique de PJ-34 dans les cellules multi-centrosomales en direct pendant la mitose (Figure 3 et les informations supplémentaires). Ce fut la première documentation en direct attribuant la cytotoxicité de PJ-34 dans les cellules humaines de cancer de centrosomes supplémentaires de-regroupement et la mort cellulaire, suggérant l'induction de la mort cellulaire de la catastrophe mitotique par PJ-34 ^5-9.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
REAGENTS
DMEM	Invitrogen (GIBCO)	41965	;
FBS (Sérum de veau fœtal)	Invitrogen (GIBCO)	12657	;
Solution Pen-Strep-Ampho	Biological Industries, Israël	03-033-1B	;
L-glutamine	invitrogène (GIBCO)	25030-024	;
0,25 % Tripsin-EDTA	Invitrogen (GIBCO)	25200	²
Boîtes de Pétri 92 mm	Nunc,Thermo scientific	150350	;
Boîtes de culture à fond en verre revêtu de poly-D-lysine de 35 mm	MatTek Corporation, USA	P35GC-0-14-C	;
Kit de dosage de détection ATP luminescente	Abcam	ab113849	;
NDS (Sérum d’âne normal)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	;
Anticorps anti-alpha-tubuline	Sigma	T9026	dilution 1:250 (IF)
Anticorps anti-&gamma ;-tubuline	Sigma	T5192	dilution 1:200 (IF)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A-11017	dilution 1:1 000 (IF)
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit	IgG Invitrogen	A-10042	dilution 1:1 000 (IF)
Réactif anti-décoloration ProLong Gold avec DAPI (montage)	Invitrogen	P36935	;
JetPEI (réactif de transfection liposomale)	Polyplus	101-10	;
/fort>
Microscope confocal	Leica (Mannheim, Allemagne)	TCS SP5II	;