Summary
הפעילות ציטוטוקסית של phenanthridine PJ-34 בתאים סרטניים שעברו מיטוזה תועדה בזמן אמת על ידי ההדמיה confocal חי. סרטן PJ-34 להכחיד אנושי שד מד"א-MB-231 תאי מחסה Extra-centrosomes במיטוזה. בניגוד למיטוזה דו מוקדי רגילים, את centrosomes במיוחד לא התקבצו בשני קטבי הכישור בנוכחות של PJ-34.
Abstract
נגזרי Phenanthrene מתנהגים כמו PARP1 מעכבים חזקים מנעו אשכולות דו מוקדי של centrosomes העודפים בתאים סרטניים אנושיים רב centrosomal במיטוזה. Phenanthridine PJ-34 הייתה המולקולה חזקה ביותר. Declustering של Extra-centrosomes גורם לכישלון mitotic ומוות של תאים בתאים מרובים centrosomal. יש לי הסרטן אנושי מוצק ביותר שכיחות גבוהה של Extra-centrosomes. הפעילות של PJ-34 תועדה בזמן אמת על ידי ההדמיה confocal של סרטן השד אנושי Live-231-MB מד"א תאי transfected עם וקטורי קידוד עבור γ-טובולין הניאון, שהוא נרחב ביותר בcentrosomes ולניאון הווה H2B ביסטון את הכרומוזומים. הסדרי כרומוזומים חריגים וביטול התקבצו מוקדי γ-טובולין המייצגים centrosomes declustered התגלו במד"א-MB-231 תאי transfected לאחר טיפול עם PJ-34. Un-התקבץ מחוץ לcentrosomes בשני קטבי הכישור קדמו המוות של התאים שלהם. תוצאות אלו מקושרות עבורR בפעם הראשונה את הפעילות ציטוטוקסית הבלעדית זוהתה לאחרונה של PJ-34 בתאים סרטניים אנושיים עם Extra-centrosomes דה אשכולות במיטוזה, וכישלון mitotic מוביל למוות של תאים. על פי ממצאים קודמים שנצפו על ידי ההדמיה confocal של תאים קבועים, PJ-34 תאים סרטניים להכחיד באופן בלעדי עם Multi-centrosomes מבלי לפגוע בתאים נורמלים עוברים מיטוזה עם שני centrosomes וכישורים דו מוקדי. פעילות ציטוטוקסית זה של PJ-34 לא הייתה שותפים PARP1 מעכבי עוצמה אחרים, ונצפתה בPARP1 extracentrosomes מחסה MEF לקוי, דבר המצביעה העצמאות של PARP1 עיכוב שלה. לחיות הדמיה confocal הציע כלי שימושי לזיהוי מולקולות חדשות להשמיד את התאים במהלך מיטוזה.
Introduction
Phenanthrene נגזר PARP1 מעכבים, כולל PJ-34, שנועד להגן על תאים שקטים ממוות של תאים אפופטוטיים הנגרמים על ידי אנרגיה רב PARP1 תיווך-DNA תיקון תחת תנאי לחץ (אוטם שריר הלב או שבץ מוחי) 1. עם זאת, לאחרונה גילה שPJ-34, בריכוז גבוה פי שתיים מזה ישכנע עיכוב PARP1, ניתן אך ורק לגרום למוות של תאים בתאים סרטניים אנושיים 2,3. המהירה יותר ההתפשטות של התא הייתה, יעיל יותר למיגור התאים היה. הפעילות ציטוטוקסית של PJ-34 יוחסה לExtra-centrosomes דה אשכולות במיטוזה 2. רבים נמל תאי סרטן אנושי multicentrosomes 4,5. דגירה של תאים אנושיים של סרטן שד מד"א-MB-231, אשר נמל centrosomes העודפים, עם 20 מיקרומטר PJ-34 יעילות להכחיד את התאים האלה בתוך 72-96 שעות מבלי לפגוע בתאים שקטים או כמה תאים מתרבים פירים מחסה שני centrosomes במיטוזה
ההרכבה centrosome דו קוטבית היא קריטית להיווצרות ציר דו קוטבי במיטוזה 4,5. לכן, תאים עם יותר משני centrosomes פיתחו מנגנון מולקולרי הבין בקושי, אשכולות centrosomes נוסף שלהם בשני קטבים 4-9. כישלון של הרכבה דו קוטבית של centrosomes עלול לגרום להפרדת צירים וחריגים כרומוזומים קוטביים מעוותת שמעצרי מחזור התא במעצר G2 / M, ומוביל למוות של תאים המיוחס לכישלון mitotic 4,5. המנגנונים המולקולריים שבבסיס Extra-centrosomes דה אשכולות נחקרים באינטנסיביות <sup> 10. הבנת מנגנון המוות הזה תאפשר מיגור בלעדי של תאים סרטניים תוך חוסך 5,10 רקמות בריאות.
לכן, תרכובות המפעילות מות תאי קטסטרופה mitotic מציעות מצב חדש של טיפול בסרטן סלקטיבית, שעשויה להיות יעילה במגוון רחב של תוצאות cancers.Our מוצקות אדם מראה כי הדמיה confocal יכולה לשמש כדי לזהות מולקולות המשפיעות על אשכולות במיוחד בcentrosomes 2,3 מיטוזה, עיבוד תרכובות סרטן אלה מיקוד לתרופות.
אנחנו תעדו את הפעילות ציטוטוקסית של phenanthridine PJ-34 על ידי סריקת תאים קבועים ולחיות עם אדם סרטן (שכיחות גבוהה של Extra-centrosomes במיטוזה) לעומת תאים נורמלים. צעד אחר צעד התיאור של נהלי ההדמיה המשמשים לזיהוי הפעילות ציטוטוקסית של PJ-34 בתאים סרטניים אנושיים כלול להלן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תרבית תאים
מד"א-MB-231 תאים נרכשו מATCC (אוסף תרבות סוג אמריקאי) ומאוחסנים בחנקן נוזלי.
- זרעי 10 6 מד"א-MB-231 תאים בצלחת פטרי בקוטר 92 מ"מ ב10 מ"ל המכילים בינונית מלא Dulbeco שינוי נשר בינוני (DMEM), 10% סוס בסרום, L-גלוטמין 1%, ו -1% Penstrep-Amphotericine אפשר תאי B. להתרבות לכ 80-100% מפגש.
- סור בינוני תרבות מצלחת וזורקים.
- שטוף את שכבת התאים לזמן קצר עם (w / v) פתרון טריפסין-EDTA כדי להסיר את כל העקבות של סרום 0.25%.
- הוסף 2.0 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA לצלחת ולצפות בתאים על ידי מיקרוסקופ ההפוכה עד ששכבת תאים מפוזרת (בדרך כלל תוך 5 עד 15 דקות).
- הוסף מדיום גידול מלא 18 מ"ל ולשאוב בעדינות את התאים על ידי פיפטה. מעביר צינור.
- צנטריפוגה ההשעיה התא ב1,200 סל"ד.
- Re-להשעות תא גלולה ב 24 מ"ל של מ"קlture בינונית.
- הוסף 2 מ"ל של השעיה תא 35 מנות מ"מ זכוכית תחתונות (כ -25% מפגש) ומקום בחממה (5% CO 2, 37 מעלות צלזיוס).
- פתרונות:
- בינוני מלא לתאי התפשטות: DMEM עם 10% FBS, אנטיביוטיקה 1% (פתרון העט סטרפטוקוקוס-Ampho 100 יחידות / מיליליטר פניצילין G, סטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל, 100) ו 2 מ"מ L-גלוטמין.
- פתרון טריפסין-EDTA, המכיל 0.25% טריפסין-EDTA.
- מנות:
92 צלחות פטרי בקוטר מ"מ.
מנות 35 מ"מ קוטר פולי-D-ליזין מצופה זכוכית תחתונה התרבות.
2. הכנת תאים להדמית confocal חיים
- זרעי 2 x 10 5 מד"א-MB-231 תאים במנות התרבות תחתיות זכוכית ב2 מ"ל בינוני מלא כאמור בסעיף 1. כאשר תרבית תאים מגיעה לנקודת מפגש של 60-70% (כ 10 5 תאים לכל צלחת 3-4 x), המשך עם transfection.
- Transfect התאים עם שני פלסמידים encoding היתוך חלבוני γ-טובולין-GFP (לגילוי ניאון של centrosomes) והיסטון אדום (H2B אדום, לגילוי ניאון של כרומוזומים) באמצעות מגיב transfection liposomal Jet-PI, בעקבות פרוטוקול הייצור. בקצרה, לערבב 2 מיקרוגרם מפלסמיד בצינור עם 100 NaCl μl (150 מ"מ). מערבבים את מגיב transfection (100 μl) עם 100 NaCl μl (150 מ"מ) במבחנה שנייה, ודגירת 5 דקות בטמפרטורת חדר (RT). לאחר מכן לשלב את שני פתרונות, לערבב (באמצעות מערבולת קלה) וספין למטה. דגירה במשך 30 דקות ב RT.
- במהלך הדגירה של תערובת transfection, לשטוף את תאי פעם עם PBS ולהחליף את המדיום הסלולרי עם 2 מ"ל של DMEM החם ללא תוספים (37 מעלות צלזיוס).
- בעדינות להוסיף את תערובת transfection לתאים בDMEM ולאחר מכן להחזיר את התאים לאינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) עבור 8 שעות.
- אחרי 8 שעות של דגירה, להחליף DMEM עם 2 מ"ל בינוני מלא ודגירת התאים בחממה במשך 24משאבי אנוש.
- 24 שעות לאחר transfection, להחליף את המדיום של התאים עם 2 בינוניות מלא המכיל 20 מ"ל מיקרומטר PJ-34.
- דגירה התאים עבור 18 שעות נוספות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
- נושא התאים לחיות הדמיה confocal לפחות 16 שעות בחדר הדמיה שמירה על התאים ב5% CO 2 ו 37 ° C.
- במקביל, יבחן transfection transfection יעילות 36 שעות הודעה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדלקמן:
- זרעי 2 x 10 5 מד"א-MB-231 תאים בצלחת 6 היטב המכילה coverslip 1 לכל גם ב2 בינוניות מלא מ"ל.
- Transfect התאים כאמור בסעיפים 2.2-2.5.
- 36 שעות לאחר transfection לתקן את תאי transfected רכובים על coverslip על ידי דגירה במתנול הקר: אצטון (1:1) פתרון, 7 דקות, -20 ° C.
- לשאוב את פתרון הקיבעון ולתת coverslip עם התאים רכובים לייבוש במנדף כימי.
- החל להאריך מגיב antifade זהב עם DAPI ולתת הדואר coverslip להתייבש בחושך במשך 6 שעות.
- בדוק את השקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחשב את אחוז תאי transfected (אותות אדומים וירוקים) מהאוכלוסייה של תאים (מכתים-DNA על ידי DAPI). אחוז transfection הרצוי הוא כ 20-40%, כאשר 100-200 תאים נספרים.
3. פרמטרים טכניים של הגדרות סורק ההדמיה confocal חי
- ScanMode XYZT; חריר [אוורירי] 1.00; זום 3.5; 8 סיביות רזולוציה; ננומטר לייזר DPSS 561; ארגון, לייזר גלוי 488 ננומטר, לייזר הוא / Ne 633 ננומטר גלוי; מטרת HCX PL APO CS 63x 1.40 UV נפט; מספרי צמצם 1.4; מהירות סריקה 700 הרץ; מדד שבירה 1.52.
- מצגת 3-D תמונה הוכנה על ידי Imaris הדמיה תוכנה 7.0.
4. Confocal הדמיה של מיטוזה בתאים קבועים
- זרעי 2 x 10 תאי סרטן שד (ATCC), fibroblasts העכבר העוברי הנורמלי (MEF), או PARP1 מד"א-MB-231 חסרים לי 5F (PARP - / -, שהוכן על ידי ד"ר פרנסואז Dantzer) על coverslips זכוכית בצלחת 6 היטב ב2 בינוניות מלא מ"ל. Coverslips נשטפו עם 96% אתנול, בעקבות על ידי שטיפה עם המים DD סטרילי, התייבש במשך שעה 2, והניח בבאר כל צלחת 6 באר.
- הוסף PJ-34 (10-30 מיקרומטר) לבינוניות ודגירת התאים לתקופה הנדרשת (HR בדרך כלל עד 96).
- שטוף את coverslips פעם עם PBS (בופר פוספט), ולתקן את התאים באמצעות דגירה במתנול קר כקרח: אצטון (1:1) פתרון, 7 דקות, -20 ° C.
- לשאוב את פתרון הקיבעון ולתת את coverslips לייבוש במנדף כימי (בשלב זה, יכול להיות כל הזמן את coverslips ב-20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות).
- שטוף את coverslips פעם אחת עם PBST (PBS בתוספת 0.1% Tween-20) לpermeabilize את קרום התא ולחסום את התאים עם 10% NDS (רגיל חמור בדם) בPBST ("פתרון חסימה ') במשך שעה 1 ב RT.
- דגירה התאים הקבועים permeabilized עם antibodi העיקריes לשעה 2 ב RT (לצירים וcentrosomes מכתים). את הנוגדנים הם מדוללים בפתרון החסימה כדלקמן: טובולין אנטי α (1:250 דילול) ואנטי טובולין γ (1:200 דילול). נוגדנים ראשוניים מיושמים כדלקמן: להחיל 100 μl (בירידה) מתערובת של הנוגדנים בחסימת פתרון לכל coverslip על כריכת צלחת 6 היטב (הכיסוי הוא הפוך). בעדינות לשים את coverslip על ירידת הנוגדנים, תאי זרע מול הירידה. דגירה coverslips העומדים בפני הנוגדנים במשך שעה 2 בטמפרטורת חדר.
- הנח את coverslips בחזרה בבארות ולשטוף את התאים 3 פעמים עם PBST. לאחר מכן להשתמש באותו ההליך מתואר ב4.6 עבור תיוג תאים על coverslips עם נוגדנים משני הניאון. דגירה התאים על coverslips עם נוגדנים משני לשעת 1, RT, בחושך. את הנוגדנים הם מדוללים בפתרון החסימה כמו בצע: Alexa פלואוריד 488 (1:1,000 דילול; ירוק) ואלקסה פלואוריד 568 (1:1,000 דילול;אדום).
- הר את coverslips באמצעות להאריך מגיב antifade זהב עם DAPI (לצביעת כרומוזומים) ו דגירה הלילה ב RT בחשכה לייבוש.
- בדוק את התלושים לכסות על ידי מיקרוסקופיה confocal.
5. כדאיויות תא נמדד על ידי ייצור ה-ATP
ייצור ה-ATP שנמדד על ידי assay ערכת זיהוי ה-ATP זורח.
- תאי זרע בצלחת 96 היטב, כ -20,000 תאים בינוניים μl 800 בכל טוב. שלוש בארות ריקות אמורים לשמש לקביעת הארה הרקע של המדיום.
- הכן סדרת דילול הסטנדרטית ATP מ כ 10 מיקרומטר עד 100 מיקרומטר ולשמור על קרח.
- הוסף 50 μl של חומר ניקוי לזה היטב ולנער את הצלחת למשך 5 דקות בהקפה ייקרה, 700 סל"ד.
- מחדש כל בקבוקון של 'מצע lyophilized' עם 5 מ"ל של "חיץ מצע 'בערכה.
- הוסף 50 μl של פתרון המצע המחודש לבארות, ולנערהצלחת למשך 5 דקות על המסלול שייקר, 700 סל"ד.
- שמור את הצלחת בחושך במשך 10 דקות.
- מדוד luminiscence של כל אחד גם על ידי ELISA microplate קורא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PJ-34 הוא מים יציבים מסיס 1 phenanthridine (איור 1). התוצאות הקודמות שלנו גילו מוות של תאים ודה התקבצו מחוץ לcentrosomes במספר סוגים של תאי סרטן רב centrosomal הקבועים שטופלו בPJ-34. לעומת זאת, תאים מתרבים נורמלים לא היו נפגעים 2,3. Centrosomes זוהה על ידי תיוג כפול עם נוגדנים המכוונים נגד centrine1 וγ-טובולין בתאים במיוחד centrosomal 2 הקבועים.
כאן, הפעילות ציטוטוקסית של PJ-34 תועדה בתאים במיוחד centrosomal החיים האלה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה confocal חי. לחיות סרטן השד אנושי מד"א-MB-231 תאים, אשר יש שכיחות גבוהה (> 50%) של Extra-centrosomes 4,5, נסרקו במשך לפחות 16 שעות על ידי ההדמיה confocal התמקדה בתאי transfected עם γ-טובולין-GFP ( ניאון תיוג של γ-טובולין מוקדים 2) ועם היסטון H2B אדום (הניאון Labeלינג של כרומוזומים). שישה עד עשרה תאי transfected חיות נסרקו במקביל בכל ניסוי. immunolabeling הכפול של מוקדי γ-טובולין בתאי transfected עם centrin1 היה אפשרי מבחינה טכנית.
התפזרו γ-טובולין מוקדים וסידור הכרומוזומים חריג התגלו במד"א-MB-231 תאים שלא טופלו שנבחרו באקראי במיטוזה רק לעתים נדירות. אשכולות דו מוקדי של מוקדי γ-טובולין, המייצגים Extra-centrosomes אשכולות דו מוקדי, תועדו ברוב המכריע של מד"א-MB-231 תאים שלא טופלו חיים (איור 2), לעומת זאת, בלתי התקבצה centrosomes והסדר חריג של כרומוזומים התגלו בשידור חי transfected מד"א-MB-231 תאים מודגרות עם PJ-34 (20 מיקרומטר), ומיטוזה בתאים אלה שהסתיימו במוות של תאים (איור 3). תאים אלה הודגרו עם PJ-34 ל18 - 24 שעות לפני הסריקה ועבור 16 שעות נוספות במהלך סריקה (איור 3). התיעוד בזמן אמת של תא דהath במהלך מיטוזה תומך בתוקף במתאם חיובי שהוגדר בעבר בין מספר התאים ממאירים אדם עם צירים רב קוטבי במיטוזה ושיעור המוות של תאים בתאי מודגרות עם PJ-34 (20 מיקרומטר) 2.
PJ-34 פועל כמעכב חזק PARP1 1. לפיכך, אנו בחנו את האפשרות של עיכוב PARP1 גרימת מות תא מזוהה עם כישלון mitotic. בניגוד להדמיה לחיות, הדמיה של מד"א-MB-231 תאים קבועים אפשרה בחינה של אוכלוסייה גדולה של תאים בתרביות התאים, ובכך מאפשרת ניתוח סטטיסטי של ההשפעות של מעכבי PARP1 במגוון רחב של שורות תאי סרטן אנושיות. הפעילות של PJ-34 הושוותה לפעילות של PARP1 מעכבים אחרים חזקים, שאינם רגיל או בphenanthrene PARP1 תאים לקויים (כלומר נורמלי וPARP1 (- / -) fibroblasts העכבר העוברי (MEF)) (איור 4). PARP1 רב centrosomes לקוי MEF הנמל במיטוזה, אבל הם לאתאים סרטניים לא 11. תאים אלה הוכנו על ידי ד"ר פרנסואז Dantzer, שטרסבורג, צרפת.
קבוע ונורמלי PARP1 (- / -) MEF היו immunolabeled לα-γ-טובולין ושכותרתו הצירים וcentrosomes, בהתאמה, כפי שדווח לפני 2. כמה מתרביות התאים שנבדקו, טופלו במעכבי PARP1 PJ-34 או אחרים שאינם חזקים phenanthrene, כולל ABT-888 וAG01469, אשר מעכבים את הפעילות האנזימטית של PARP1, וBSI-201, מתחם שככל הנראה פוחת PARP1 מחייב חתוכות DNA 12-14. אף אחד מPARP1 מעכבים הנבדקים לקויים MEF הרגיל בריכוזי PARP1 פעילות עיכוב (איור 4). לעומת זאת, PJ-34 גרמו מינון dependently בלתי התקבצות של γ-טובולין מוקדים, עיוות של צירים ומוות של תאים בPARP1 (- / -) MEF (איורים 4 א ו-B). זו לא נצפתה במטופלים עם MEF הנורמלי PJ-34 (Figurדואר 4B) או בPARP1 (- / -) MEF מטופלים עם אי - phenenthrene PARP1 מעכבי ABT-888 או AG014699 (איור 4C). יצוין כי PJ-34 בריכוזים העולים על 20 מיקרומטר לא לפגוע MEF הנורמלי, אם כי MEF הנורמלי היו עמיד יותר לפעילות PJ-34 מPARP1 (- / -) MEF.
העובדה שPJ-34 להכחיד PARP1 (- / -) MEF למרות מחסורם PARP1, והמתאם בין היווצרות של צירים רב מוקדי ומיגור תא בPARP1 (- / -) MEF מודגרות עם PJ-34 בריכוזים גבוהים יותר מאשר אלה הנדרשים לPARP1 עיכוב, לא היו עולים בקנה אחד עם הצמדה סיבתי בין Extra-centrosomes דה אשכולות בPARP1 (- / -) MEF וPARP1 עיכוב (איור 4 א). הפעילות ציטוטוקסית של PJ-34 בPARP1 (- / -) MEF יכול להיות טוב יותר מוסבר על ידי פעילותו כסוכן דה אשכולות תוספת-centrosomes בתאים מרובים centrosomal 2 ( מידע משלים "/> איור 3. תיעוד חי confocal הדמיה של מוות של תאים במד"א-MB-231 תא שנבחר באקראי במיטוזה עם בלתי התקבץ γ-טובולין שכותרתו במיוחד centrosomes. מד"א-MB-231 תאים הודגרו עם PJ-34 למשך 24 שעות לפני סריקה, ובמהלך 16 שעות של ההדמיה confocal חי. PJ-34 הוחל 24 שעות לאחר transfection עם וקטורים המבטאים γ-טובולין-GFP (ירוק, מוקדי γ-טובולין וcentrosomes) וH2B אדום (אדום, הכרומוזומים). 
איור 1. Phenanthridine PJ-34: N-(6-OXO-5 ,6-dihydro-phenanthridin-2-י.ל.)-N, N-דימתיל-acetamide. 
איור 2. אשכולות Bi-מוקד של Extra-centrosomes בתא מד"א-MB-231 חיה שנבחר באקראי במיטוזה. א פנל עליון: centrosomes שכותרתו בתא מד"א-MB-231 חיה שנבחר באקראי transfected עם γ-טובולין-GFP פנל תחתון:. כרומוזום מחדש הסדרים במיטוזה בתא מד"א-MB-231 שנבחר באקראי transfected עם היסטון H2B אדום. מיטוזה דו מוקדי ב 'עם התקבץ מחוץ לcentrosomes המזוהה בפולחן שנבחר באקראיured מד"א-MB-231 תא. תאים היו transfected על ידי שני γ-טובולין-GFP (תיוג γ-טובולין מוקדים; ירוק) (סימון אדום) כרומוזומים; היסטון H2B אדום ו. 48 שעות לאחר transfection, תאים נחשפו להדמית confocal חי עבור 16 שעות. שישה תאים נסרקו במקביל בכל ניסוי. ארבעה ניסויים שונים שבוצעו. ראה גם מידע משלים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. 
איור 3. Extra-centrosomes דה אשכולות קדמו מוות של תאים בתאים חיים מד"א-MB-231 שטופלו בPJ-34. תא מד"א-MB-231 חיה שנבחר באקראי במיטוזה עם centrosomes מפוזר (ST מסגרת 1 בצד שמאל) שהסתיימו במוות של תאים ( 2 nd ו3 מסגרות Rd). זה ceLL היה שנבחר באקראי בתרבית תאים טופחה במשך 24 שעות עם PJ-34 (20 מיקרומטר) הוחלו 24 שעות לאחר transfection עם וקטורים המבטאים γ-טובולין-GFP (תיוג מוקדי γ-טובולין כולל centrosomes; ירוק) והיסטון H2B אדום ( תיוג כרומוזומים; אדום). התא נסרק במשך 16 שעות על ידי ההדמיה confocal חי. שישה תאים נסרקו במקביל בכל ניסוי. שלושה ניסויים שונים שבוצעו. ראה גם מידע משלים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. 
איור 4. פעילות ציטוטוקסית של PJ-34 בPARP1 (- / -) fibroblasts העכבר העוברי. א '(משמאל) אחוז צירים רב מוקדי מחושב בnormal (קו שחור) וParp1 - / - (קו אפור) MEF, טופח במשך 48 שעות עם PJ-34 בריכוזים שצוינו. אחוז הצירים רב קוטבי חושבה מתוך זוהו ב3 ניסויים שונים 20 צירים כולל. (מימין) הפחית הישרדות תא זוהתה בתרביות תאים טופחו במשך 72 שעות עם PJ-34 (20 מיקרומטר) ביחס להישרדות של תאים שלא טופלו בקרה ((קו שחור רגיל) וParp1 - / - (קו אפור) MEF). הישרדות תא הייתה assayed על ידי התאים "ה-ATP ייצור (פרוטוקול 5). הערכים הממוצעים של 4 מדידות עבור כל שורת תאים ב3 ניסויים שונים מוצגים ב 'כוש בנורמלי קבוע שנבחר באקראי וParp1 -. / - MEF במיטוזה, ללא טיפול (ביקורת) או מודגרות עם PJ-34 במשך 48 שעות בצוינו ריכוזים. PJ-34 גרמו קוטביים צירים. תאים היו קבועים, וpermeabilized immunolabeled לα-γ-טובולין ו( תיוג ירוק של צירים ו תיוג אדום של centrosomes, בהתאמה). הכרומוזומים תויגו עם מגיב DAPI (כחול). . נציג תוצאות של 3 ניסויים שונים PARP1 מעכבים הלא phenanthrene חזקים ג לא השפיעו אשכולות centrosomes בPARP1 (- / -) MEF. צירים מרגילים נבחר באופן אקראי וParp1 - / - MEF מוצגים; MEF מטופל (שליטה) או MEF טופל במשך 48 שעות עם מעכבי PARP אינו phenanthrene, AG01469 (20 מיקרומטר) או ABT888 (20 מיקרומטר). הכרומוזומים מסומנים עם מגיב DAPI (כחול). תוצאות דומות התקבלו בניסויים שונים 3. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. 
לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. איור משלים. מד"א-MB-231 תא שנבחר באקראי בanaphase עם דו מוקדי התקבצו γ-טובולין שכותרתו במיוחד centrosomes נסרק במשך 16 שעות על ידי הדמיה confocal בשידור חייה, 48 שעות לאחר שtransfected עם וקטורים המבטאים γ-טובולין-GFP ו H2B אדום (תיוג מוקדי γ-טובולין וcentrosomes בתאים הקבועים (ירוק) ותיוג H2B היסטון של הכרומוזומים (אדום), בהתאמה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לחיות ההדמיה confocal סיפק תיעוד בזמן אמת של האפקט הרעיל לתאים של PJ-34 בתאים מרובים centrosomal חיה במהלך מיטוזה (איור 3 ומידע משלים). זה היה התיעוד החי הראשון מייחס cytotoxicity של PJ-34 בתאים סרטניים אנושיים לcentrosomes נוסף דה אשכולות ומוות של תאים, דבר המצביע אינדוקציה של מוות של תאי הקטסטרופה mitotic ידי PJ-34 5-9. בניגוד לכך, באשכולות דו מוקדי של centrosomes סופר numerary נצפו במד"א-MB-231 תאים שלא טופלו חיים העוברים מיטוזה הרגילה עם דו focali centrosomes נוסף התקבץ (איור 2, מידע נוסף).
על פי תוצאות אלו, לחיות ההדמיה confocal של תאי transfected יכולה להיות שימושית לאיתור טרנסלוקציה של חלבונים מעורבים בExtra-centrosomes אשכולות בתאי transfected במהלך מיטוזה 5,9,15,16. זיהוי של חלבונים מושפעים PJ-34 ברב centrosתאי omal עשויים לספק כמה רמזים להבנת מנגנוני המוות מופעלים על ידי Extra-centrosomes דה באשכולות.
היתרון של ההדמיה confocal לחיות במתן מידע בזמן אמת במהלך מיטוזה בתאים חיים, גם הוא קשור למספר מגבלות. מספר התאים שנסרקו לניסוי מוגבל. לכן סיכויים לגילוי תאים במיטוזה הם נמוכים, ומספר ניסויים חוזרים נדרשים לתיעוד בזמן אמת של מיטוזה בתאים הסרוקים. בנוסף, ההצלחה תלויה מאוד ביעילות גבוהה של transfection של תאים עם וקטורים המבטאים חלבונים שכותרת. וכך, למרות היותו אמין, ההדמיה confocal לחיות זמן רב ודורשת עובדים קשים מאוד מנוסים.
לשם השוואה, immunocytochemistry וconfocal הדמיה של תאים קבועים תאפשר בדיקה של מספר רב של תאים לכל ניסוי, הנדרש לניתוח סטטיסטי אמין. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי להשוותהשפעות של PJ-34 במיטוזה של תאים נורמלים שפירים להשפעותיו בתאי הסרטן העוברים מיטוזה עם centrosomes העודפים 2,3. כמו כן, שיטה זו שימש להשוואה בין ההשפעות של PJ-34 לזה של PARP1 מעכבים הלא phenanthrene בPARP (- / -) MEF מחסה Extra-centrosomes (תאים עם שכיחות גבוהה של Multi-centrosomes 11) (איור 4).
לסיכום, התוצאות שלנו מצביעות על היתרון של שילוב המידע בזמן אמת היקר ביותר המסופק על ידי ההדמיה confocal של תאי חיים במיטוזה (איורים 2 ו -3) עם cytochemistry וניתוח confocal של תאים קבועים. שילוב של שיטות אלה עשוי להיות שימושי לזיהוי הפעילות ציטוטוקסית של מולקולות קטנות, כמו PJ-34, יעד מנגנונים ספציפיים חיוניים להישרדות תא. התלות הייחודית של תאים סרטניים אנושיים רבים על אשכולות דו קוטבי במיוחד centrosomes להתפשטות ושרידתםאל הופך PJ-34 מועמד אפשרי לטיפול בסרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מקורות מימון של מחקר זה: קרן משותפת של החברה באוניברסיטת תל אביב העברת טכנולוגיה, רמות ומרכז הרפואי שיבא, (מ 'ע"א וע"כ.), ICRF - ישראלי לחקר סרטן בבסיס (מ' ע"א.) וקרן לאומית למדע ( SI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen (GIBCO) | 41965 | |
| FBS (Fetal bovine Serum) | Invitrogen (GIBCO) | 12657 | |
| Pen-Strep-Ampho solution | Biological Industries, Israel | 03-033-1B | |
| L-glutamine | Invitrogen (GIBCO) | 25030-024 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Invitrogen (GIBCO) | 25200 | |
| 92 mm Petri dishes | Nunc,Thermo scientific | 150350 | |
| 35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes | MatTek Corporation, USA | P35GC-0-14-C | |
| Luminescent ATP detection assay kit | Abcam | ab113849 | |
| NDS (Normal Donkey Serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Anti α-tubulin antibody | Sigma | T9026 | 1:250 dilution (IF) |
| Anti γ-tubulin antibody | Sigma | T5192 | 1:200 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11017 | 1:1,000 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-10042 | 1:1,000 dilution (IF) |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting) | Invitrogen | P36935 | |
| JetPEI (liposomal transfection reagent ) | Polyplus | 101-10 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal microscope | Leica (Mannheim, Germany) | TCS SP5II | |
References
- Jagtap, P., et al. Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents. Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).
- Castiel, A., et al. A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent. BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).
- Inbar-Rozensal, D., et al. A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors. Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).
- Gergely, F., Basto, R. Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall. Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).
- Doxsey, S. Re-evaluating centrosome function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).
- Walczak, C. E., Heald, R. Mechanisms of mitotic spindle assembly and function. International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).
- Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy. Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).
- Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B. Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells. The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. Schatten, E. , Humana Press Springer. 255-277 (2012).
- Galimberti, F., et al. Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy. Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).
- Kanai, M., et al. Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).
- Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future. Cancer J. 16, 83-90 (2010).
- Wahlberg, E., et al. Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors. Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).
- Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. PARP inhibition: PARP1 and beyond. Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).
- Leber, B., et al. Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells. Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes. Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).
