Summary
Nos genéticamente-codificar el aminoácido no natural, p-azido-L-fenilalanina en varias posiciones específicas en los GPCR y mostrar la versatilidad del grupo azido en diferentes aplicaciones. Estos incluyen una tecnología fotorreticulación dirigido a identificar los residuos en el bolsillo de unión a ligando de un GPCR, y la modificación bioorthogonal específica de sitio de los GPCR con una etiqueta de epítopo de péptido o de la sonda fluorescente.
Abstract
Para facilitar los estudios estructurales y dinámicas de proteína G-receptor acoplado (GPCR) de señalización complejos, se necesitan nuevos enfoques para introducir sondas o etiquetas informativas en receptores expresados que no perturban la función del receptor. Se utilizó tecnología de supresión de ámbar codón para genéticamente a codificar el aminoácido no natural, p-azido-L-fenilalanina (azf) en varias posiciones específicas en los GPCRs heteróloga expresadas en células de mamífero. La versatilidad del grupo azido se ilustra aquí en diferentes aplicaciones para estudiar los GPCR en su ambiente celular nativo o bajo condiciones de detergente solubilizadas. En primer lugar, demostramos una tecnología fotorreticulación específica basada en células para identificar los residuos en el bolsillo de unión a ligando de GPCR en donde un ligando de molécula pequeña marcada con tritio se reticula a un aminoácido codificado genéticamente azido-. Se demuestra a continuación, la modificación específica de sitio de los GPCR por la bioorthogonal ligadura de reacción de Staudinger-Bertozzición que se dirige el grupo azido el uso de derivados de fosfina. Se discute una estrategia general para el objetivo marcado péptido epítopo de las proteínas de membrana expresadas en la cultura y su detección mediante un enfoque basado en ELISA de células enteras. Por último, se muestra que AZF-GPCR pueden ser etiquetados de forma selectiva con sondas fluorescentes. Las metodologías discutidos son generales, en que pueden, en principio, aplicarse a cualquier posición del aminoácido en cualquiera de GPCR expresado para interrogar a los complejos de señalización activo.
Introduction
Receptores acoplados a proteínas G (GPCRs heptahelical) comprenden una superfamilia de proteínas de la membrana altamente dinámicos que median señales extracelulares importantes y diversos. En el paradigma clásico, la activación del receptor se acopla con los cambios conformacionales inducidos por ligando. 1, 2 avances recientes en biología estructural de los GPCR han proporcionado información significativa sobre los mecanismos moleculares de la señalización transmembrana. 3-5 Sin embargo, para entender con mayor precisión la química mecanismo funcional y dinámica estructural de señalización de GPCR, se requiere un conjunto de herramientas de enfoques para incorporar sondas moleculares y químicas informativas para interrogar a los complejos de señalización activo.
Para este fin, se adaptó un método para introducir específicamente en el sitio no o mínimamente sondas perturbadores en receptores expresados sobre la base de aminoácido no natural (SAU) mutagénesis usando codón ámbar tecnología de supresión previamente por primera vez por Schultz y C. oworkers 6 Hemos optimizado la metodología de mutagénesis SAU para lograr una expresión de alto rendimiento y sistema de mutagénesis para las proteínas tales como los GPCR, que son difíciles de expresar en sistemas más heterólogas distintas de las células de mamíferos. El uso de un supresor ARNt ortogonal diseñado y desarrollado aminoacil-ARNt-sintetasa par de UAA específica, hemos introducido específicamente en el sitio UAAs en GPCRs objetivo expresado. La incorporación con éxito de UAAs, p-acetil-L-fenilalanina (ACF), p-benzoil-L-fenilalanina (BZF), y p-azido-L-fenilalanina (AZF) se ha demostrado en nuestros GPCR modelo - rodopsina humana y receptor de quimiocinas CC, CCR5. 7, 8
En principio, un UAA puede ser codificada genéticamente en cualquier posición dentro de la secuencia de la proteína, y esta propiedad es una herramienta bioquímica invaluable, ya que permite el escaneo de un solo codón de un GPCR diana. Nos centramos aquí específicamente en la versatilidad de la UAA, AZF, que tiene un azi reactivahacer fracción. Además de servir como un (IR) de la sonda única de infrarrojos, 8, 9 azf también puede servir como un agente de reticulación fotoactivable por reacción con aminas primarias vecinas o hidrógenos alifáticos. Además, el grupo azido biológicamente inerte puede participar como un asa química selectiva en las reacciones de etiquetado bioorthogonal. Aquí se presentan ejemplos que ilustran las aplicaciones útiles de la incorporación específica de sitio de AZF en GPCRs, como fotorreticulación dirigida a atrapar a un complejo receptor-ligando, y la modificación de los GPCRs de etiquetado epítopo bioorthogonal y estrategias de marcaje fluorescente.
Reactivos fotoactivables se han utilizado para estudiar los sistemas biológicos desde la década de 1960. 10 En este período, se ha informado de una gran cantidad de experimentos de reticulación de receptor-ligando para estudiar complejos de GPCR, la mayoría de las cuales implicó el uso de ligandos de fotoafinidad. 11, 12 Sin embargo, estos las aplicaciones son técnicamente limitados, ya que requiere síntesis de ligandos que portan un grupo de reticulación. 13-15 Además, con el resto reticulante en el ligando, es un reto para identificar la ubicación de la reticulación en el GPCR. La introducción específica de sitio grupos fotorreticulación como UAAs en proteínas utilizando el codón ámbar tecnología de supresión es un avance valioso. 16, 17 Hemos desarrollado una técnica fotorreticulación para identificar la interfaz de unión sobre un receptor que está implicado en la formación de un complejo receptor-ligando en células vivas mediante la introducción de grupos fotolábiles en los GPCR. 18, 19 Aquí se describe el protocolo experimental y método de análisis de datos para la aplicación de esta tecnología fotorreticulación dirigido a identificar el sitio de unión de un ligando de molécula pequeña, maraviroc tritiada, en el CCR5. Este método aprovecha la cuantificación precisa de la manija radiactivo en el ligando, además de retener la estructura química nativa del ligando.
Las técnicas basadas en la fluorescencia apoyan la comprensión precisa de la base estructural de la activación del receptor mediante el sondeo directamente el estado conformacional del receptor. 20, 21 Sin embargo, las técnicas que poseen la flexibilidad para introducir etiquetas fluorescentes en los GPCR específica de sitio son limitados. Estamos interesados en el empleo de estrategias de modificación química bioorthogonal para facilitar la detección de moléculas individuales (SMD) de complejos de señalización de GPCR. 22 El grupo azido puede participar en las químicas bioorthogonal como la ligadura de Staudinger-Bertozzi, 23, 24 azida-deformación-promovido sin cobre cicloadición alquino (SpAAC) 25 y azida alquino cicloadición catalizada por cobre (CuAAC). 26 Nos centramos aquí en la reacción de ligación Staudinger-Bertozzi que implica la reacción específica entre una azida y una fosfina. Se demuestra el uso de dos derivados de fosfina diferentes, conjugados a un epítopo de péptido (péptido FLAG) o un marcador fluorescente(Fluoresceína) para lograr la modificación específica de sitio de los GPCR.
Previamente Hemos optimizado las condiciones para el etiquetado específico del sitio de la rodopsina AZF variantes utilizando la estructura cristalina de rayos X y simulaciones dinámicas para elegir los sitios de destino que estén expuestos al disolvente. 27, 28 también ilustra la factibilidad de lograr un etiquetado fondo libre por Staudinger- ligadura Bertozzi. 29 Se demuestra aquí el procedimiento general empleado para conseguir el marcaje fluorescente de un receptor solubilizada con detergente que está inmovilizado sobre una matriz de inmunoafinidad y posteriormente visualizada por fluorescencia en gel. Además, demostramos una útil extensión de esta estrategia de etiquetado para identificar posiciones susceptibles de etiquetado en un receptor de estructura desconocida, CCR5. Esto se lleva a cabo utilizando una estrategia de marcado epítopo de péptido dirigido que se basa en la modificación de bioorthogonal azf-GPCR variantes en un formato semi-alto rendimiento basado en células. 30 Estamétodo explota las propiedades de detección de varios pasos de un ELISA de la superficie celular para monitorear eventos de etiquetado.
Las metodologías que se discuten aquí son generales y, en principio, se pueden aplicar a cualquier GPCR incorporado con AZF utilizando el codón ámbar tecnología de supresión. En los protocolos presentados aquí detallamos los pasos involucrados en la expresión de células de mamíferos de los receptores incorporados con UAAs como AZF utilizando el método de mutagénesis de aminoácidos no naturales y sus aplicaciones posteriores para facilitar los estudios estructurales y dinámicas de los GPCRs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sitio específico de incorporación genética de Unnatural Aminoácidos en GPCRs
- Mantener las células HEK293T en medio DMEM (4,5 g / l de glucosa, glutamina 2 mM) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%.
- Transfectar las células cultivadas a 60-80% de confluencia en una placa de 10 cm usando reactivo Lipofectamine Plus.
- Para 750 l de DMEM, añadir 10 l de reactivo Plus, 3,5 g de ADNc de GPCR (pMT4. Rho o pcDNA 3.1. CCR5) que contiene el codón de parada ámbar en una posición deseada, 3,5 g de ADNc supresor de ARNt (pSVB.Yam) y 0,35 g de ADNc sintetasa mutante-amino acil ARNt para p-azido-L-fenilalanina (pcDNA.RS). Incubar a temperatura ambiente durante 15 min. También realizar una transfección similar utilizando el ADNc de GPCR en peso (que no contiene un codón de parada ámbar) para servir como un control. Añadir esta mezcla a 750 l de DMEM con 17 l Lipofectamine. Después de equilibrar 15 min a temperatura ambiente, llevar elvolumen total de 4 ml.
- Aspirar los medios sobre 10 cm de placa, se aplican mezcla de transfección a las células, y volver a 37 ° C en el 5% atmósfera de CO 2. Después de 4-6 horas, complementar las células con 4 ml de DMEM que contiene 20% de SFB y 1 mM AZF.
- Al día siguiente, vuelva a colocar el medio de cultivo por DMEM que contiene 10% de SFB y 0,5 mM AZF.
- Células de cosecha 48 horas después de la transfección, para analizar la expresión o proceder a procedimientos fotorreticulación o de etiquetado descritos en las siguientes secciones.
- Confirmar la expresión de la mutante ámbar de GPCR en presencia de la SAU en el medio de crecimiento. Hacemos esto mediante la detección de inmunotransferencia Western. Lyse el sedimento celular en 1% (w / v) de dodecil-β-D-maltósido (DDM) en 20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM durante 1 hora a 4 ° C. Centrifugar el lisado a 16.000 xg y resolver el sobrenadante en condiciones reductoras por SDS-PAGE. Transferencia a una membrana de PVDF y llevar a cabo el análisis de inmunoblot para detectar la expresión del receptor de longitud completa utilizando the 1D4 mAb (Nacional de Cultivo Celular Center), que reconoce un epítopo de ingeniería en el extremo C-terminal del receptor. 31
2. Asignación de un sitio de unión al ligando Usando Targeted fotorreticulación
- 48 horas después de la transfección, los medios de comunicación el aspirado de células y reemplazar con 4 ml 1x Tampón fosfato salino (PBS). Volver a 37 ° C durante 15 min.
- Resuspender las células con PBS 1x y transferir a un tubo Falcon. Centrifugar a 1500 rpm durante 2 min para sedimentar las células y aspirar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento de células en solución salina tamponada de Hank 1x que contenía HEPES, pH 7,5, 0,2% de BSA y el ligando tritiado a concentraciones saturantes de unión para la longitud requerida de tiempo y temperatura para asegurar la formación del complejo receptor-ligando 20.
- Transferir la suspensión celular a una placa de 24 pocillos o de 96 pocillos para la fotoactivación del AZF a 365 nm (por ejemplo, usar una lámpara UV-A) durante 15 min a 4 ° C. Mantenienn de la placa en hielo para evitar el calentamiento de la muestra y la lisis celular.
- Transfiera las células a un tubo Eppendorf, centrifugar para sedimentar las células, separar el sobrenadante y proceder a su análisis. Los gránulos se pueden almacenar a -20 ° C para su uso futuro.
- Resuspender los sedimentos celulares en tampón de lisis que contiene 1% (w / v) de DDM, mM de Tris-HCl 20, pH 7,5 y los inhibidores de la proteasa. Después de la incubación de 1 hora a 4 ° C, centrifugar el lisado de células durante 10 min a 16.000 xg, y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
- Añadir resina 2B mAb 1D4-Sepharose al sobrenadante y se incuba durante la noche a 4 ° C a immunopurify el GPCR usando el C-terminal 1D4 mAb epítopo de ingeniería. Al día siguiente, lavar las perlas varias veces con tampón de lisis. Muestras se eluye con 1% SDS a 37 º C durante 1 hora con agitación.
- Transferir una porción del eluyente a un vial que contiene 15 ml de fluido de centelleo y contar en un contador beta de centelleo para cuantificar la cantidad de unión específica del ligando tritiado a thcorreo del receptor.
- Resolver el restante 1D4 mAb eluyente purificado por electroforesis en gel estándar. Nosotros usamos un gel SDS-PAGE al 4-12% y luego la transferencia semiseco a una membrana de PVDF para inmunotransferencia. También se incluyen un carril con la escala estándar de proteínas para guiar aproximación visual de peso molecular.
- Bloquear la membrana de PVDF con leche 5% en tampón TBS que contiene 0,05% de Tween-20. Sonda de la membrana para confirmar la expresión del receptor de longitud completa con mAb 1D4 seguido por el anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP.
- Tratar con un aumento de quimioluminiscencia reactivo (ECL) y exponer la membrana a autorradiografía película para visualizar las bandas.
- Cortar la membrana con una hoja de afeitar para separar cada carril muestra, seguido por el corte en marcadores específicos de peso molecular. Transferir los segmentos de membrana a viales que contenían fluido de centelleo. Cuantificar la cantidad de tritio en cada segmento de la membrana mediante el recuento en un contador de centelleo beta.
- Identificar lo positivophotocrosslink con la detección de tritio en la masa molecular aparente igual a la suma de la del GPCR y el ligando.
3. Targeted Epitope Etiquetado y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas Superficie Celular (ELISA)
- 24 horas después de la transfección, lavar las células con 1 ml de PBS 1X y trypsinize con 1 ml de tripsina al 0,25% durante 3 min. Complementar con 9 ml de DMEM que contiene 10% de SFB y 0,5 mM AZF. Resuspender las células y contar la densidad celular. Utilizamos un hemocitómetro estándar.
- Pre-tratamiento de una placa de 96 pocillos de alto vinculante, de fondo claro con 100 ml de 0,01 mg / ml de poli-D-lisina por pocillo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lava varias veces con 1x PBS y secar al aire.
- Placa de 200 l de las células transfectadas a una densidad de 6 x 4 al 08 10 x 10 4 células / pocillo a la placa de 96 pocillos y se vuelven a 37 ° C en 5% de CO 2 atmósfera.
- Al día siguiente preparar células para el etiquetado. Lave suavemente tres veces con 100 l / pocillo de PBS 1x to eliminar cualquier que contiene medio de crecimiento del AZF. Asegúrese de células permanecen adheridas, por ejemplo, mediante el uso de PBS que contenía Ca 2 + y Mg 2 +.
- Preparar 50-200 M reactivo marcador FLAG-triarilfosfina en 1x HBSS / PBS a partir de una acción mantenida a 5-20 mM en PBS. Aplicar 60 ml a cada pocillo (por triplicado para cada mutante ámbar) y volver a 37 ° C durante 30 min a 4 h. Mantener un conjunto de pozos sin tratamiento en la etiqueta 1x HBSS / PBS. También incluya un control de GPCR en peso para comparar con variantes AZF-GPCR.
- Lavar las células 3 veces con 100 l / pocillo de tampón de bloqueo, BB (1x PBS, 0,5% de BSA), para eliminar por completo la etiqueta sin reaccionar.
- Aplicar 100 l / pocillo de 4% de paraformaldehído (preparado a partir de una población 16% en 1x PBS) a las células. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente. Lavar tres veces con BB.
- Realizar el protocolo de ELISA de la superficie celular estándar para detectar receptor marcado y la expresión del receptor. Incubar con el anticuerpo primario durante 1,5 h en hielo seguido de una secundariatibody incubación a temperatura ambiente durante 1 h.
- Añadir 100 l de anticuerpo anti-FLAG M2 (por ejemplo, 1:2.000 dilución de anticuerpo realizados en BB) para detectar el epítopo Flag péptido del reactivo etiquetado con FLAG triarilfosfina. También sondear los pocillos tratados que no tiene etiqueta como un control negativo. Añadir anti-CCR5 2D7 (usamos una dilución 1:500) de anticuerpos a un conjunto separado de pozos para determinar en peso o azf-GPCR expresión en la superficie celular.
- Lavar las células tres veces con BB, y se incuba con 100 l de anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con HRP (1:2000 dilución).
- Lave cuidadosamente las células cinco veces con BB. Añadir 50 l de tampón de detección: Amplex Red, 20 mM de H 2 O 2, 1x PBS (1:10:90 relación) e incubar 15 min a temperatura ambiente. Recopilar datos espectrales en un lector de placas de pocillos múltiples fluorescencia a λ ex = 530 y λ em = 590.
4. Bioorthogonal Marcaje fluorescente de un GPCR
- Lyse10 7 células cosechadas expresan en peso o azf-rodopsina variantes en 1 ml de tampón de solubilización que contiene 1% (w / v) de DM, HEPES 50 mM o Tris-HCl, pH 6,8, NaCl 100 mM, CaCl2 1 mM e inhibidores de proteasa para 1 horas a 4 ° C. Centrifugar el lisado de células a 15.000 xg durante 10 min y recoger la fracción sobrenadante.
- Añadir 100 l de resina Sepharose 2B 1D4-mAb para capturar el receptor usando el C-terminal epítopo 1D4 de ingeniería. Incubar durante 12 horas a 4 ° C. La resina se lava tres veces con 0,1% (w / v) de DDM en 0,1 M de tampón de fosfato de sodio, pH 7,3.
- Añadir 0,1 mM de fluoresceína-fosfina en un volumen total de 0,3 a 0,5 ml para etiquetar receptor inmovilizado en la matriz de inmunoafinidad (1D4-mAb Sepharose 2B). Incubar durante 12 horas a temperatura ambiente. Centrifugar y eliminar el sobrenadante. La resina se lava para quitar la etiqueta que no ha reaccionado.
- Eluir el receptor marcado con tampón de elución que contiene 100 ml de 0,1% (w / v) de DDM y 0,33 mg / ml de nonapéptido (C9 péptido contra el epítopo 1D4)en tampón de fosfato 2 mM, pH 6,0 mediante incubación en hielo durante 1 h.
- Resolver muestras marcadas por SDS-PAGE en condiciones reductoras. Lavar geles brevemente en PBS y luego visualizar etiquetado de azf-GPCR por fluorescencia en gel. Por ejemplo, utilizar un escáner de fluorescencia confocal con un láser de longitud de onda de 488 nm para detectar el receptor modificado con fluoresceína.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Se empleó la metodología de mutagénesis de aminoácidos no naturales a sitios específicos introducir sondas moleculares en un GPCR utilizando el codón ámbar tecnología de supresión. El esquema de la figura 1 resume los pasos más destacados de la metodología y de las diversas aplicaciones de la incorporación de la SAU versátil, p-azido-L-fenilalanina (AZF), en GPCRs. Expresión de AZF-GPCR en células de mamíferos permite dirigido fotorreticulación a ligandos, y dirigido etiquetado péptido epítopo o modificaciones fluorescentes de un GPCR a través de la química de etiquetado bioorthogonal.
La técnica de fotorreticulación se puede utilizar para investigar los aspectos estructurales de los complejos de ligando GPCR en células vivas (Figura 1A). Los datos representativos obtenidos a partir de uno de tales experimentos se muestran en la Figura 2. 19 Aquí hemos utilizado un ligando marcado de pequeña molécula radioactiva, maraviroc tritiada, para identificar su unión a sentarsee en el CCR5. En este ejemplo, la irradiación UV sobre las células que expresan CCR5-azf variantes de pre-incubó con tritiados resultados de maraviroc en complejos covalentemente reticulados que se pueden identificar utilizando la etiqueta radioactiva sensible en el ligando. Entre las varias posiciones en CCR5 probados, I28azF y W86azF pudieron photocrosslink a maraviroc tritiada como se muestra con recuentos significativamente mayores de centelleo (barras rojas, panel inferior, Figura 2). El receptor de peso no mostró reticulación al ligando radiactivo.
Las químicas de etiquetado bioorthogonal se pueden utilizar para modificar específicamente en el sitio variantes azf-GPCR. Se empleó la química ligadura de Staudinger-Bertozzi para etiquetar dos GPCRs: CCR5 y rodopsina utilizando derivados de fosfina (Esquema 1). Una estrategia implica el etiquetado epítopo específico de un GPCR en células vivas usando una etiqueta de péptido conjugado (Figura 1b). Demostramos uno de tales experimentos, en el que un Peptid BANDERAreactivo de marcaje e-triarilfosfina se utiliza para sitios específicos y modificar selectivamente variantes AZF-CCR5. En la Figura 3 presentamos los datos representativos de una estrategia de detección ELISA sensible y de varios pasos se utiliza para identificar las posiciones que se han etiquetado con la péptido FLAG. 30 Entre las posiciones en CCR5 investigado, todas las variantes del AZF-CCR5 fueron expresados en la superficie celular (en rojo bares, Figura 3) y aproximadamente la mitad de ellos se sometió con éxito epítopo específico de etiquetado (barras azules, la Figura 3). en peso de CCR5 sirvió como un control negativo para el etiquetado epítopo, exhibida por la falta de señal de anti-FLAG. En una estrategia alternativa, que etiquetados azf-GPCR solubilizada con detergente inmovilizadas sobre una matriz de inmunoafinidad, tales como anti-1D4 mAb conjugados a Sepharose 2B de resina, con una etiqueta de fluoróforo conjugado (Figura 1c). La imagen de fluorescencia en gel se muestra en la Figura 4 demuestra el éxito fluorescenteetiquetado del GPCR, la rodopsina, en tres posiciones diferentes incorporados con azf por la ligadura de Staudinger-Bertozzi el uso de un derivado de fosfina de la fluoresceína. 29 Como era de esperar, la rodopsina en peso no mostró etiquetado fondo como se ve por la ausencia de una banda fluorescente a la espera peso molecular del receptor.
Esquema 1. La reacción de ligación de Staudinger-Bertozzi entre una triarilfosfina y una azida para formar un aducto unida a amida estable.
Figura 1. Esquema que ilustra la incorporación específica de sitio de una SAU (AZF) y sus aplicaciones a la s . tudy GPCR SAU mutagénesis específica de sitio se consigue mediante co-transfección de tres plásmidos separados en las células de mamíferos que llevan: un evolucionada amino ortogonal acil-tRNA sintetasa específica para el UAA, un ARNt supresores ortogonales que reconoce un codón de parada ámbar (UAG) , y el gen que codifica el GPCR que contiene una mutación etiqueta a la posición deseada. Las células cultivadas en presencia de la SAU expresan un GPCR de longitud completa con un azf introducido específicamente en el sitio. Estas células entonces pueden ser (a) se incubaron con el ligando y se activan con luz UV para identificar enlaces cruzados entre un GPCR y su ligando, (b) utilizados para específica de sitio epítopo etiqueta de un GPCR en cultivo con una etiqueta química-péptido conjugado, o (c) solubilizado para purificar los GPCR, que luego se bioorthogonally modificarse con un marcador fluorescente bajo condiciones en las que el receptor se inmoviliza sobre una resina de sefarosa conjugada con anticuerpo.0588/50588fig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande
Figura 2. Fotorreticulación dirigida de un GPCR a un ligando tritiado. Aparece aquí están los resultados representativos de un experimento de entrecruzamiento entre las variantes AZF-CCR5 y un ligando de molécula pequeña marcada con tritio, maraviroc. Panel superior: La inmunotransferencia Western generada después de un experimento típico, que muestra la expresión de las variantes azf-CCR5 probados. Los segmentos de color ponen de relieve donde la membrana de PVDF fue cortado por recuento de centelleo y se corresponden con los recuentos de centelleo detectados trazados en el gráfico de barras en el panel inferior. El segmento de color rojo representa la masa molecular esperado (alrededor de 40 kDa) del complejo reticulado covalente entre el receptor y el ligando. LaRefore, que sería de esperar para detectar tritio en aquellos segmentos sólo cuando azf se introduce en una posición en el receptor que está en estrecha proximidad a la cavidad de unión a ligando-y pueden formar una reticulación covalente con el ligando. Reproduce (adaptado) con permiso de Grunbeck, A., et al. Genéticamente codificados foto-reticuladores Mapa del sitio de unión de un fármaco alostérico en un receptor de la proteína G-junto. ACS Chemical Biology 7, 967-972 (2012). Derecho de Autor (2012) American Chemical Society. Haz clic aquí para ver la imagen más grande
Figura 3. ELISA de detección dirigido al epítopo de etiquetado de un panel de GPCR Top:. Expresión en la superficie celular de HEK 293T cells que expresan variantes AZF-CCR5 y controles transfectados wt y simulacros probaron con anti-CCR5 mAb 2D7 utilizando todo el ELISA basado en células (barras rojas). Panel inferior: Las células de la misma transfección se trataron con 0,05 mM de FLAG-triarilfosfina durante 1 hora en células vivas y luego cuantificados por ELISA usando posterior anti-FLAG M2 mAb para determinar el grado de etiquetado epítopo de péptido en cada posición (barras azules) . Las barras de error representan el error estándar de la media de dos o más conjuntos de datos replicados. Reproducido (adaptado) con permiso de Naganathan, S., et al. Sitio específico de epítopo marcado de los GPCR por la modificación bioorthogonal de un aminoácido no natural codificada genéticamente Bioquímica DOI:. 10.1021/bi301292h (2013). Derecho de Autor (2013) American Chemical Society. Haz clic aquí para ver la imagen más grande
Figura 4. Etiquetado fluorescente de la rodopsina AZF incorporado en varias posiciones. WT y mutantes AZF-rodopsina inmovilizados en una matriz de inmunoafinidad marcado con fluoresceína fosfina. Muestras purificadas se separaron por 4-12% SDS-PAGE y la imagen de fluorescencia en gel muestra fue tomada con un 488-nm escáner de fluorescencia láser confocal utilizando un conjunto de filtros de emisión optimizado para la detección de fluoresceína. Figura adaptado de Huber, T., et al. Bioorthogonal etiquetado de receptores funcionales acoplados a la proteína G en grupos azido codificados genéticamente. presentado (2013). Haga clic aquí para ver la imagen más grande
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Se describe aquí una metodología sólida para la incorporación específica de sitio de una sonda reactiva, AZF, en GPCRs y demostrar tres aplicaciones útiles de esta herramienta para el estudio de la estructura y dinámica de los GPCRs. Nuestro método para sitios específicos incorporar UAAs elude un problema fundamental con una estrategia alternativa basada en el etiquetado químicamente 32, 33 o adjuntar photocrosslinkers 34 a un solo mutante cisteína accesible. Aunque, las químicas que se dirigen a grupos tiol de cisteína se han utilizado para unir sondas fluorescentes, una estrategia de este tipo requiere la generación de una proteína de fondo-cisteína libre. Esto puede ser limitante ya que todos los GPCR poseen más de una cisteína, muchos de los cuales puede ser esencial para mantener la función del receptor apropiado. Por lo tanto, la viabilidad de introducir un UAA que es susceptible de modificación química o puede ser activado por la luz UV es extremadamente atractivo.
La reacción covalente de un Photreticulante oactivatable con una molécula diana depende de la distancia y lateral próximos cadenas. Por lo tanto, estas sondas pueden ser utilizadas en la identificación de interacciones que están dentro de una distancia específica desde el agente de reticulación, por ejemplo, agentes de reticulación a base de benzofenona se sugiere tener una dependencia de la distancia de 3 Å. 35 Anteriormente, hemos introducido tanto azf y BZF, un SAU que contiene un grupo reactivo benzofenona, para identificar los residuos en un GPCR que están dentro de una distancia definida de una fluoresceína marcado con tritio o ligando. 18, 19 La aplicabilidad general de esta tecnología depende únicamente de la disponibilidad de dichos ligandos marcados y la generación de mutantes de color ámbar de un GPCR diana. Además, en teoría esta técnica fotorreticulación objetivo se puede aplicar para identificar las interacciones entre los GPCRs y sus otras parejas de unión, tales como una proteína G o β-arrestina. Los datos obtenidos de estos estudios de reticulación se pueden utilizar para crear MO más precisamodelos moleculares de complejos de señalización de GPCR.
Varias reacciones químicas bioorthogonal se han descrito en la literatura que permiten la modificación específica de sitio de los residuos de UAA. La UAA, AcF, por ejemplo, posee un grupo ceto que puede participar en reacciones de hidrazona o de ligación oxima. 36, 37 Anteriormente comparó la modificación de grupos ceto y grupos azido con reactivos conjugados con biotina y fluoresceína. 29 Nuestras observaciones indican que el azido grupo de AZF es, verdaderamente, más que su contraparte bioorthogonal ceto. Por lo tanto, posteriormente centrado en el uso de la ligadura de Staudinger-Bertozzi para modificar dos GPCR con un marcador de epítopo peptídico o un marcador fluorescente. Es de destacar, sin embargo, que la unión de Staudinger-Bertozzi exhibe sub-estequiométricas 38 y pobres propiedades cinéticas de etiquetado. Además, las fosfinas son altamente susceptibles a la oxidación por el aire. 25 Hemos observado que el Staudinger-Sealigadura rtozzi sólo alcanza el etiquetado del 30% después de la incubación durante 12 horas a temperatura ambiente. 29 Por estas razones, en este momento estamos evaluando alternativas químicas etiquetado como CuAAC y SpAAC a sitios específicos etiquetar AZF-GPCRs.
Aunque los inconvenientes de reacciones de ligación de Staudinger-Bertozzi, se demuestra aquí el uso de una estrategia de marcado epítopo de péptido de células vivas para identificar posiciones en un GPCR diana que son accesibles para el etiquetado fluorescente futuro. Además, esta estrategia de marcado epítopo tiene otras numerosas aplicaciones útiles, tales como, la introducción de una etiqueta de epítopo en un único residuo modificado en contraste con la inserción de todo el epítopo mediante la sustitución de secuencias nativas. Esta característica es de importancia específica con los GPCR desde la modificación de la longitud y secuencia de segmentos de bucle altamente conservadas podría alterar dramáticamente la función. Por último, también se muestra aquí los experimentos de prueba de concepto para etiquetar GPCRs con fluoróforos, marey los adecuados para experimentos de detección de una sola molécula.
En conclusión, azf es una herramienta versátil para el estudio de la estructura y función de los GPCR. Hemos demostrado que azf es específica de sitio incorporado en los GPCR expresado en células de mamífero utilizando el codón ámbar sistema de supresión. Esto permite la modificación de un GPCR sólo en una posición única. La estructura y la función del receptor marcado pueden entonces ser evaluados ya sea en el entorno nativo de la membrana de plasma o en una solución de detergente. Ahora estamos preparados para investigar los complejos de señalización de GPCR con la flexibilidad de la sonda AZF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias al generoso apoyo de varias fundaciones y donantes filantrópicos (ver SakmarLab.org).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
| Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
| Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
| HEK 293T cells | Adherent cells | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
| p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
| Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
| Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
| HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
| Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
| Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
| Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
| Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
| Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
| LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
| Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
| Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
| Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
| 0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
| M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
| anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| 96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
| Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
| 16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
| HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
| CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
| Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
| Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
| Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
| 1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
| 1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
| NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
| Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
| Table 4. Fluorescent labeling materials |
References
- Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
- Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
- Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
- Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
- Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
- Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
- Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
- Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
- Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
- Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
- Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
- Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
- Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
- Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
- Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
- Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
- Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
- Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
- Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
- Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
- Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
- Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
- Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
- Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
- Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
- Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
- Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
- Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
- Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
- Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
- Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).
