Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A fra Gram-negative bakterier

Published: September 16, 2013 doi: 10.3791/50623
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Section of Molecular Genetics and Microbiology, The University of Texas at Austin, 2Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Texas at Austin, 3The Institute of Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

Summary

Isolering og karakterisering av lipid Et domene av lipopolysakkarid (LPS) fra gramnegative bakterier gir innsikt i celleoverflatebaserte mekanismer for antibiotikaresistens, bakteriell overlevelse og fitness, og hvordan kjemisk mangfoldig lipid A molekylære arter differentially modulere vert medfødte immunresponser.

Abstract

Lipopolysakkarid (LPS) er en viktig celleoverflate-molekyl av gram-negative bakterier, avsettes på den ytre paknings av den ytre membran-dobbeltlag. LPS kan deles inn i tre domener: den distale O-polysakkarid, en kjerne oligosakkarid, og lipid A domene som består av en lipid A-molekylære arter og 3-deoksy-D-manno-okt-2-ulosonic ester (KDO). De lipid A-domenet er den eneste komponent avgjørende for bakteriecelleoverlevelse. Etter at syntesen er lipid A kjemisk modifisert som reaksjon på ytre påvirkninger som for eksempel pH-verdi eller temperatur, for å fremme resistens mot antibiotika forbindelser, og for å unngå gjenkjennelse av mediatorer av verten medfødte immunrespons. Den følgende protokoll beskriver liten og stor skala isolering av lipid A fra gram-negative bakterier. Isolert materiale blir deretter kjemisk karakterisert ved tynnsjiktskromatografi (TLC) eller masse-spektrometri (MS). I tillegg til matriks-assistert laser desorpsjon / ionisering-tid på flys (MALDI-TOF) MS, vi også beskrive tandem MS protokoller for å analysere lipid A molekylære arter ved hjelp av electro ionisering (ESI) koplet til kollisjon indusert dissosiasjon (CID) og nytilsatte ultrafiolett photodissociation (UVPD) metoder. Våre MS protokoller tillate utvetydig bestemmelse av kjemisk struktur, viktig å karakterisering av lipid A molekyler som inneholder unike eller nye kjemiske modifikasjoner. Vi beskriver også en radioisotopisk merking, og etterfølgende isolering, med lipid A fra bakterielle celler for analyse ved hjelp av TLC. I forhold til MS-baserte protokoller, gir TLC en mer økonomisk og hurtig karakterisering metode, men kan ikke brukes til å tilordne entydig lipid A kjemiske strukturer uten anvendelse av standarder med kjent kjemisk struktur. I løpet av de siste to tiårene isolering og karakterisering av lipid A har ført til en rekke spennende funn som har gitt bedre kunnskap om fysiologi av gramnegative bakterier, mekanismer for antibiotika motstandheten, menneskets medfødte immunrespons, og har gitt mange nye mål i utviklingen av antibakterielle forbindelser.

Introduction

Lipopolysakkarid (LPS) er en hoved ytterflate molekyl av nesten alle gram-negative organismer, og består av tre molekylære domener: en distal O-antigen polysakkarid, en kjerne oligosakkarid, og den membran-assosiert lipid A domain avsatt på den ytre paknings av ytre membran-dobbeltlag 1,2. De lipid A domenet består av 3-deoksy-D-manno-okt-2-ulosonic (Kdo) rester og en lipid A-molekylære arter, der lipid A kan defineres som kloroform oppløselig del av LPS ved mild syrehydrolyse 1, 2. Standarden lipid A-molekylet kan være kjemisk definert som en diglucosamine ryggrad som er hexa-acylerte og bis-fosforylert, i overensstemmelse med de store lipid A-artene ble observert i modellen organismen Escherichia coli (E. coli) 1,2. Ni konstitutivt uttrykte gener, som bevares i hele gram-negative bakterier, er ansvarlig for produksjonen av lipid A domene (figur 1) 1,2. De fleste bakterier har et ekstra sett med gener, som varierer i grad av fylogenetisk bevaring, som deltar i ytterligere kjemisk modifikasjon av lipid A 3. Dephosphorylation, fjerning av acylkjeder, og tilsetning av kjemiske rester som for eksempel amino-sukkere (f.eks aminoarabinose) og / eller phosphoethanolamine er de mest vanlig observerte aktiviteter (figur 1). Mange av de enzymer som er ansvarlige for lipid A modifikasjon blir direkte aktivert av miljøsignaler, slik som divalente kationer, eller deres ekspresjon er regulert av to komponent-regulator-systemer reaksjon 3.

Anerkjennelse av lipid A arter av verten medfødte immunsystemet er mediert av Toll-like receptor 4/myeloid differensiering faktor 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Hydrofobe krefter mellom MD2 og lipid A acylkjeder, så vel som mellom TLR4 og 1 og 4 'fosfatgruppene lipid A fremmer sterke assosiasjon av leppenid A med TLR4/MD2 4,5. Modifikasjoner som endrer acyleringen staten eller negativ ladning av lipid A innvirkning TLR4/MD2 basert lipid En anerkjennelse og nedstrøms stimulering av det medfødte immunrespons aktivatorer NF-κB og mediatorer av inflammasjon som TNF-alfa og IL1-β 6,7. Modifikasjoner som maskere den negative ladningen av lipid A også hindre bakteriedrepende kationiske antimikrobielle peptider fra binding til gram-negative celleoverflater 3,8. Mange lipid A modifikasjoner er antatt å øke bakterie fitness under spesielle miljøforhold, for eksempel inne i menneske host eller i en økologisk nisje. Av denne grunn er mange modifikasjonsenzymer er attraktive mål på rasjonell utvikling av antimikrobielle forbindelser. Den kjemiske mangfold av lipid A-strukturer, med hensyn til organismer og / eller omgivelser, og de biologiske virkningene av disse forskjellige strukturer gjør strukturell karakterisering av lipid A en viktig oppgave i tHan studere av gram-negative bakterier.

Isolering av lipid A-molekyler fra hele bakterier omfatter utvinning av LPS fra bakteriecelleoverflaten, et hydrolytisk trinn å frigjøre lipid A, etterfulgt av en avsluttende renseprosess 9-11. Den hyppigst siterte LPS utvinning prosedyren er hot-fenol vann utvinning prosedyre, først introdusert av Westphal og Jann 10. Etter ekstraksjon hele LPS underkastes mild sur hydrolyse, som er kjemisk skiller Kdo fra 6'-hydroksyl av det distale glukosamin sukker av lipid A (figur 1). Mange fallgruver finnes for det varme-fenol vann prosedyre inkludert bruk av en høy fare reagens, blir behovet for å degradere ko-ekstraherte nukleinsyrer og proteiner, og flere dager for å fullføre protokoll 10..

Vårt laboratorium har videreutviklet utvinning og isolering av lipid A som først utviklet av Caroff og Raetz 12,13. Sammenlignet med varm fenol-vann-fremgangsmåten, idet fremgangsmåten er presentert her er raskere og mer effektiv, og kan tilpasses en lang rekke kulturvolumer fra 5 ml til flere liter. Videre, i motsetning til hot-fenol vann utdrag, ikke vår metode velger ikke for grov-eller glatt-typer av LPS, som gir optimal utvinning av lipid A arter. I vår-protokollen, er kjemisk lysering av hele bakterieceller utført med en blanding av kloroform, metanol og vann, hvor LPS kan bli pelletert ved sentrifugering. En kombinasjon av mild syrehydrolyse og oppløsnings ekstraksjoner (Bligh-Dyer) blir brukt til å frigjøre lipid A fra kovalent bundet polysakkarid. Metoden med Bligh and Dyer ble først brukt til utvinning av fettarter fra en rekke dyre-og plantemateriale 14, modifisert her for å separere hydrolysert polysakkarid fra lipid A. I denne siste separasjonstrinn, kloroform oppløselige lipider selektivt fordeles i det nedre organiske fase. For ytterligere å rense lipid A, revers-fase elleranionisk bytterkolonne-kromatografi kan anvendes 12.

Etter isolering av lipid A-arter fra hele celler, kan anvendes en rekke analysemetoder for å karakterisere den kjemiske strukturen av det isolerte materiale, slik som NMR, TLC og MS-baserte analyser. NMR gir mulighet for ikke-destruktiv strukturoppklaring, og gir strukturelle detaljer knyttet til glykosid bindinger, entydig tildeling av acylkjede stillinger, og tildeling av festeplasser for lipid A modifikasjoner som aminoarabinose eller phosphoethanolamine 15-17. NMR-analyse av lipid A er ikke diskutert i vår protokollen, men er blitt beskrevet andre steder tilstrekkelig 15,16. For rask analyse TLC baserte metoder brukes ofte, men ikke klarer å gi direkte informasjon om fine kjemiske struktur. MS baserte protokoller som er mest hyppig brukt metode for å karakterisere lipid A strukturer 18,19. Matrix forbundet laser desorpsjon ionisering (MALDI)-MS er ofte brukt til utgangspunktet kartlegge intakte lipid A arter. Enkeltvis ladede ioner genereres fra analytten fremstilt i henhold til vår ekstraksjonsmetoder. Som kreves flere fine strukturanalyse, MS / MS-baserte metoder bevise mer informativ enn MALDI-MS. Koplet til Elektro ionisering (ESI) enkeltvis eller formere ladet lipid en forløper ioner er ytterligere fragmentert ved kollisjon indusert dissosiasjon (CID) eller ultrafiolett photodissociation (UVPD), å generere strukturelt informative produktioner 18,20,21. Nøytrale tap produkter fra Lipid en forløper ioner er også ofte genereres under ESI-MS som gir et ekstra lag med strukturell informasjon.

Tandem massespektrometri (MS / MS) har vist seg å være et uunnværlig og allsidig fremgangsmåte for belysning av lipid A-strukturer. Under MS / MS, blir ioner aktiveres for å gi en diagnostisk fragmenteringsmønster som kan brukes til å belyse den strukturen av forløperen ion. Den mest available MS / MS metoden er CID. Denne metoden gir fragmentioner via kollisjoner av den valgte forløper ion med en inert target gass, noe som er energi nedfall som fører til dissosiasjon. CID har vist seg en kritisk verktøy for tildeling av lipid A struktur for et bredt spekter av bakteriearter 22-33.

Selv CID er den mest universelt implementert MS / MS metoden, genererer det et begrenset utvalg av produktioner. 193 nm UVPD er et alternativ, og komplementære MS / MS-metode. Denne metoden benytter en laser for å bestråle ioner, og absorpsjon av fotoner resulterer i energisering av ioner og etterfølgende dissosiasjon. Denne høyere energi MS / MS teknikk gir en mer variert utvalg av produkt ioner enn CID og dermed gir mer informative fragmentering mønstre. Spesielt gir UVPD informasjon om subtile endringer i lipid A arter basert på splittelsene i glycosidic, amin, acyl og CC indeksobligasjoner 18,21,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle løsningene bør bli fremstilt med ultrarent vann, og HPLC-kvalitet metanol og kloroform. Preparerte oppløsninger som inneholder organiske oppløsningsmidler slik som metanol, kloroform eller pyridin, og konsentrerte syrer eller baser skal fremstilles og brukes i henhold til et avtrekksskap. Alle løsningene kan bli lagret ved romtemperatur. Løse skal måles i en gradert glassylinder og lagret i glassflasker med løsemiddel PTFE-foret caps. For langtidslagring kloroform-holdige oppløsningsmidler bør lagres i tonede gule glassflasker for å unngå produksjon av fosgen, en svært reaktive syrekloridet. PTFE sentrifugerør og rotasjonsfordamper kolber skylles med metanol og kloroform før bruk. Følg nødvendige føderale, statlige og / eller institusjonelle avfallshåndtering bestemmelser for avhending av løsemidler og / eller radioaktivt avfall.

En. Large Scale Lipid A Extraction (50 ml til 1,5 L)

  1. Forbered en enfase Bligh-Dyer blanding: klorskjema-metanol-1X fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4; 1:2:0.8 v / v). Kombiner 200 ml kloroform, 400 ml metanol og 160 ml PBS i 1 L løsningsmiddel flaske. Cap flasken og bland ved inversjon (> 30x). Løsne lokket med jevne mellomrom under miksing for å lufte og lagre forseglet.
  2. Tilbered en pre-ekvilibrert to-fase Bligh-Dyer-blanding av kloroform: metanol: vann (2:2:1.8 v / v). Kombiner 400 ml kloroform, 400 ml metanol og 180 ml vann i 1 L løsningsmiddel flaske. Cap flaske og bland ved inversjon, og pass på å løsne lokket med jevne mellomrom under miksing for å lufte. La likevekt O / N og butikk forseglet.
  3. Klargjør mild syrehydrolyse-buffer (50 mM natriumacetat, pH 4,5, 1% natrium-dodecyl-sulfat (SDS)). Til 500 ml av mild syrehydrolyse buffer, veie 2,05 g natrium-acetat og overfør til en 500 ml begerglass. Tilsett vann til et volum på ~ 350 ml og omrør, tilsett 50 ml 10% SDS. Bland og justere pH til 4,5, overføre til en gradert sylinder, og tilsett vann til 500 ml.
  4. Forberedkloroform: metanol (4:1, v / v): Mål 100 ml kloroform og overfør til løsningsmiddelflaske. Mål 25 ml metanol og blandes med kloroform. Oppbevar i rav glassflaske.
  5. Vaksinere 5 ml av media (Luria buljong eller andre) fra en enkelt bakteriekoloni. Dyrk O / N ved 37 ° C, eller i det kreves ° C for vekst. Et diagram av ekstraksjon prosedyren er vist i figur 2..
  6. Den neste dagen, måle OD 600 og bruke 5 ml O / N kultur å vaksinere 200 ml av kultur til en start OD 600 på 0,05. Grow celler til en OD 600 av 0,8-1,0 er nådd.
  7. Slakte celler via sentrifugering ved 10 000 xg i 10 min. Lengre spinner kan være nødvendig for stammer som pellet dårlig. Hell av media supernatant.
  8. Vask cellepelleten med 50 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Gjenta sentrifuge til pellet cellene. Hell av supernatanten og lagre cellepelleten ved -20 ° C, og videre til trinn 1.9.
  9. Suspender cellene i 40 mlav 1x PBS og skillet mellom to 250 ml PTFE sentrifugerør (givende 20 ml cellesuspensjon / tube). Tilsett 25 ml kloroform og 50 ml metanol til hvert rør, for en enkelt fase Bligh-Dyer (kloroform: metanol: vann; 1:2:0.8 v / v) (figur 2). Bland ved inversjon og inkuberes ved RT i> 20 minutter for å sikre fullstendig cellelyse.
  10. Sentrifuger blandingen ved 2000 xg i 20 min. LPS vil klumpe sammen med proteiner og nukleinsyrer (figur 2), men vil fosfolipider, isoprenyl lipider, og små, hydrofobe peptider forblir i supernatanten. Kast supernatanten.
  11. Vask LPS pellet med ~ 100 ml enfase Bligh-Dyer blanding. Sentrifuger ved 2000 x g i 20 min. Kast supernatant. Når isolere lipid A fra E. coli eller Salmonella, er bare én vaske nødvendig, men ytterligere vasketrinn kan være nødvendig for å redusere fosfolipid kontaminering ved avstegning lipid A fra noen organismer.
  12. Legg 27 ml mild syrehydrolyse-buffer (50 mM natriumacetat, pH 4,5, en% SDS, se trinn 1.3) til LPS pellet, og bland ved å pipettere opp og ned til det bare gjenstår små partikler. Sonicate til homogent resuspender pelleten i LPS-løsning med sondespissen sonicator ved en konstant driftssyklus i 20 sek ved 50% effekt. Gjenta sonication av prøve 2x (20 sek / sprekke, ~ 5 sek mellom bursts).
  13. Kok prøver i et vannbad i 30 min. Forsiktig: Pass på at hettene er stramt, men ikke helt forseglet. Noen organismer, som Vibrio cholerae (V. cholerae) kreve lengre inkubasjonstider (1 time) for å øke den totale utbyttet av lipid A. fjerne flaskene fra vannbadet og tillate prøven å avkjøles til romtemperatur før fortsetter.
  14. For å trekke ut lipider etter hydrolyse, konvertere SDS-løsning i et to-fase Bligh-Dyer (figur 2) blandingen ved tilsetning av 30 ml kloroform og 30 ml metanol, til en kloroform: metanol: vann (2:2:1.8, v / v) blanding. Bland ved inversjon og sentrifuger prøven i 10 min ved 2,000 x g. Ekstraher den nedre fase i en ren PTFE-sentrifugerør ved hjelp av en glass-pipette.
  15. Utføre en andre ekstraksjon ved å tilsette 30 ml av nedre fase fra en pre-ekvilibrert to-fase Bligh-Dyer blandingen (trinn 1.2), til den øvre fasen fra trinn 1.14. Bland deretter sentrifuger ved 2000 xg i 10 min. Ekstraher den nedre fase, og basseng med den nedre fasen ekstrahert i trinn 1.14.
  16. Vask de samlede nedre faser (60 ml totalt) ved å tilsette 114 ml av pre-ekvilibrert tofaset Bligh-Dyer øvre fase (trinn 1.2) for å skape et to-fase Bligh-Dyer-blanding (kloroform: metanol: vann, 02:02: 1,8, v / v). Bland. Sentrifuger ved 2000 x g i 10 min.
  17. Fjern den nedre fase til et rent glass rotasjonsfordamper kolbe og tørr prøve ved anvendelse av rotasjonsfordampning (figur 2).
  18. Tilsett 5 ml kloroform: metanol (4:1, v / v) til den roterende kolbe, og bad-sonicate (> 30 sek) for å hjelpe til med suspensjonen av lipid fra sidene av kolben. Bruke et glass-overførings pipette for å overføre lipid til en renglassrør (13 x 100 mm eller større) avkortet med PTFE foret fenoliske skrulokk. Tørr prøve under en strøm av nitrogen ved hjelp av en nitrogen tørketrommel.
  19. Resuspender tørket lipid i 1 ml kloroform: metanol (4:1, v / v). Overføring til lite glass sample hetteglass (12 x 32 mm) med en konisk base for mer kvantitativ resuspensjon ved hjelp av små volumer (se tabell av utstyr / reagenser). Tørr ved hjelp av en nitrogen tørketrommel.
  20. Tørket prøve kan bli lagret ved -20 ° C før påfølgende TLC (protokoll 2) eller MS-analyse (protokoll 3, 4 eller 5). (Merk: Mengde materiale isoleres og anvendes i de følgende protokoller er foreslått basert på det som er tilstrekkelig for de fleste organismer Det samme lipid prøven kan brukes i Protocols 2-5, tar notere% materiale fjernet se Diskusjon for flere detaljer...).

2. Visualisering av Lipid A Art via Tynnsjiktkromatografi

  1. Klargjør TLC mobil fase løsningsmiddelsystem (kloroform: pyridin: 88% maursyre: vann, 50:50:16:5 v / v). Combine 200 ml kloroform, 200 ml pyridin, 64 ml 88% maursyre og 20 ml av vann i en 1 L løsningsmiddel flaske. Cap flaske, bland ved inversjon flere ganger, og vent.
  2. Bruk en TLC tank som vil romme 20 x 20 cm plater. Linje TLC tank med ~ 40 cm kromatografi papir.
  3. Til TLC tank tilsett 200 ml kloroform: pyridin: 88% maursyre: vann (50:50:16:5, v / v) blanding. Tillat tank til pre-stabilisering i> 3 timer, ofte O / N er foretrukket og mer praktisk.
  4. Fjern tørket lipid prøver fra fryseren (trinn 1.20) og la varm til RT.
  5. Med en barberhøvel fjerne silika fra den øvre kanten av en silikagel-TLC-60 plate. Ved hjelp av en sløv blyant, trekke en linje parallell med bunnen av platen, 2 cm fra bunnen. Denne linjen er opphavet for å fange opp prøver. Mark intervaller langs denne referanselinje for å få øye på prøvene 1 cm fra hverandre.
  6. Oppløs tørket lipid fra trinn 2.4 i 200 ul kloroform: metanol (4:1, v / v), vortex-og sonicate (3x, ~ 15 sek hver), utbytter ~ 100 -500 ng / mL lipid A hvis hentet fra E. coli.
  7. Ved hjelp av en microcapillary glass pipette, spot en tiendedel av volumet (20 mL) på TLC plate som er merket i trinn 2.5. Tillat prøvene lufttørke på TLC plate for ~ 15 min. (Merk: Prøver i små glassflasker kan tørkes ved hjelp av en nitrogentørker og lagret ved -20 ° C for etterfølgende bruk i protokoller 3-5 Legg merke% materiale fjernes.).
  8. Plasser TLC-plate inneholdende oppdaget prøvene inn i det pre-ekvilibrert tank. Når løsningsmiddelfronten når toppen av TLC-platen (~ 2,5-3 timer), fjernes platen og lufttørkes (> 60 minutter). En kald-luftkanon kan brukes for å sikre fullstendig tørrhet.
  9. Mens platen er tørking, slå på varmeplate ved 250 ° C i forkulling.
  10. I en ventilert avtrekksskap, klar 10% svovelsyre-etanol-blanding for forkulling lipider løst på silica TLC-plate (konsentrert svovelsyre: 100% etanol; 01:09 v / v). Mål 10 ml svovelsyre og tilsett langsomt til 90 ml av 100% etanol. Carefullt mikse og overføre til et glass kromatografisk reagens atomizer.
  11. I avtrekksskap, bruk en glass kromatografisk reagens atomizer å sprøyte den tørkede TLC-plate med 10% svovelsyre-etanol-blanding. Spray blandingen jevnt over hele platen.
  12. Plasser TLC plate på 250 ° C varm plate til forkullede lipid prøver vises som svarte / brune flekker (<1 min). Ikke overeksponere platen, da dette vil føre til at hele platen for å bli brun og gjøre visualisering av lipid A arter vanskelig.

Tre. Strukturelle Karakterisering av Lipid A via MALDI-TOF massespektrometri

  1. Fra trinn 1.20, (eller trinn 2.7) fjerne lipid En prøve fra fryseren og la varm til RT. Resuspender tørket lipid En prøve på ~ 20 ul kloroform: metanol (4:1, v / v) og vortex å oppnå en ~ 1-5 pg / mL lipid En oppløsning hvis ekstrahert fra E. coli. (Merk: 10% mindre konsentrert om materiale som brukes fra trinn 2.7).
  2. Forbered ATT matrikskomponenter. Mettet 6-aza-2-thiothymine i 50% acetonitril: Tilsett 500 ul vann og 500 ul acetonitril til et 1,5 ml mikrosentrifugerør, og deretter legge til> 10 mg 6-aza-2-thiothymine slik at 50% acetonitril er super-mettet. Mettet trebasisk ammonium-citrat-løsning: Legg> 1 mg til 500 pl vann, bunnfallet skal være lett synlig. Vortex-og sentrifuger-løsninger før bruk; kun mettet supernatant er brukt.
  3. Forbered ATT matriseblandingen: mettet 6-aza-2-thiothymine i 50% acetonitril, mettet trebasisk ammonium citrat (20:1, v / v). Bland matrikskomponenter sammen ved å legge til 20 mL av ATT-løsning til en mL mettet tribasic ammoniumsitrat løsning i 500 mL mikrosentrifuge tube, vortex å blande, og sentrifuger før søknad til MALDI plate.
  4. Forbered MALDI plate ved å legge 0,5 mL kalibrerings blandingen til MALDI plate på et sted i nærheten av der de prøvene vil bli deponert, for å gi den mest nøyaktige masse / belaste forholdet besluttsomhet.
  5. Deponere 0,5 mLav ATT matrise på MALDI plate på hvert sted hvor lipid En prøve vil bli deponert.
  6. Forekomst 0,5 ul prøve (2,5% av totalt prøve) på stedet i ATT matrise, å blande den plate, og skaffe spektra ved scanning prøven for optimale ion-signaler (fig. 3). Merk: Beløp for den mest optimale MS signalet kan variere med organisme og må bestemmes empirisk. For å legge til mer materiale kan man få øye på 0,5 mL flere ganger slik at flekket blandingen tørke i mellom tillegg av mer prøven. Prøven kan også bli konsentrert (tørr og resuspender i et mindre volum) eller fortynnes etter behov. Mer utgangsmateriale (volumet av startcellekultur) kan også brukes (se diskusjon).

4. Elektro Ionization massespektrometri og kollisjons Induced Dissosiasjon av Lipid A

  1. Tilbered en kloroform: metanol oppløsningsmiddel-blanding (1:1, v / v) ved å blande en 200 mL lager av HPLC-kvalitet metanol med 200 ml HPLC-kvalitet kloroform i en glass sollufte flaske.
  2. Overfør 200 ul av kloroform: metanol løsningsmiddel blandingen til ampullen med lipid A (for eksempel fra trinnet 1.20, 2.7, og tørket etter protokoll 3) og sonicate lipidet en løsning i 5 minutter eller inntil alt materiale er oppløst.
  3. Sett opp massespektrometer for negativ modus electro ionisering.
  4. Ved hjelp av en 250 mL sprøyte og en sprøytepumpe, direkte tilføre den fortynnede lipid En prøve med en strømningshastighet på 2,0 til 3,5 mL / min.
  5. Optimalisere og forbedre lipid A ion signal ved å justere de ion-optikk. En full massespektrum kan nå hentes av lipid A-arter (figur 4).
  6. Isolere og aktivere målet lipid A ved å velge CID som MS / MS metoden.
  7. Øk CID spenning (eller normaliserte kollisjonsenergi, NCE) inntil den forløper lipid A art er om lag 10% relativ mengde i forhold til den høyeste produkt ion.
  8. Erverve og gjennomsnittlig spektra før tilstrekkelig signal-til-støy er oppnådd for the produktioner. Det antall skanninger nødvendig er avhengig av signalintensiteten av den opprinnelige forløper og kan variere 3-300 skanner (Figur 5A).

5. MS / MS på Lipid A ved ultrafiolett Photodissociation

  1. Forbered prøven og massespektrometer som i trinn 4.1 til 4.5.
  2. Slå på laser tilkobles massespektrometer. Den massespektrometer ble utstyrt med en 193 nm ekscimer-laser modifisert til å tillate UV-aktivering i HCD celle av instrumentet. Photodissociation ble gjennomført på en måte lignende den som er beskrevet tidligere 35. Vi bruker en modifisert vakuum manifold med en CaF to optisk vindu for å sende fotoner inn i høyere energi C-felle dissosiasjon (HCD) celle. Laseren blir utløst ved MS / MS av en transistor-transistorlogikk (TTL) signalet fra massespektrometeret til en puls / forsinkelsesgenerator.
  3. Sett opp instrumentet programvare, slik at laseren vil utløse excimer laser nårioner angi HCD celle. Dette krever et moderat modifisering av programvaren.
  4. Slå på pulsgeneratoren slik at laseren er pulset hvert 2 msek (500 Hz).
  5. Isoler lipid En forløper ion ved å velge HCD som MS / MS metoden og justere collisional energi til 1% NCE. Dette tillater isolering av forløper-ioner for ultrafiolett dissosiasjon i HCD cellen. Selv om HCD cellen er i bruk, er programvaren modifisert for å utføre UVPD i løpet av dette intervallet.
  6. Aktiver isolerte lipid A ion ved å øke laserenergi og å justere antallet laserpulser. En typisk UVPD eksperimentet blir utført ved hjelp av ti 6 ml pulser.
  7. Som i trinn 4.8, anskaffe og gjennomsnittlig spektra før tilstrekkelig signal-til-støy er oppnådd for de UVPD produktioner. Det antall skanninger nødvendig er avhengig av signalintensiteten av den opprinnelige forløper og kan variere 3-300 skanner (figur 5B).

6. 32 P-merkingav Lipid A og Følgende Isolation

  1. Vaksinere 5 ml av media (Luria buljong eller andre medier) fra en enkelt koloni. Grow O / N ved 37 ° C eller ved ønsket temperatur.
  2. Den neste dag, måle OD 600 og bruk O / N kultur for å inokulere 7 ml av kulturen til en utgangs OD 600 på ~ 0,05, dyrkes i et standard 20 x 150 mm engangs glassrøret kultur. Legg 2,5 my Ci / ml av uorganisk 32 P. Grow celler til en OD 600 av 0,8-1,0 er nådd. Følg føderale, statlige og / eller institusjonelle retningslinjer for sikker og forsvarlig håndtering av radioaktivt materiale.
  3. Slakte celler i 16 x 125 mm glass-sentrifugerør med PTFE-foret lokk ved hjelp av en fast vinkel klinisk sentrifuge ved 1500 xg i 10 min. Fjern supernatanten inn passende radioaktivt avfall. Skal kastes alt radioaktivt avfall (for eksempel flytende, glass, biohazard) generert i etterfølgende trinn i overensstemmelse med føderale, statlige og / eller institusjonelle guiRetningslinjene.
  4. Vask cellepelleten med 5 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Sentrifuger i 10 minutter ved 1500 x g. Kast supernatant.
  5. Resuspender celler i 5 ml av enfase Bligh-Dyer blandingen (figur 2) som består av kloroform: metanol: vann (1:2:0.8, v / v). Vortex å blande og inkubere ved RT i> 20 minutter for å sikre fullstendig cellelyse.
  6. Sentrifuger i klinisk sentrifuge ved 1500 xg i 20 min. Forsiktig hell av supernatanten, som inneholder fosfolipider og isoprenyl lipider.
  7. Resuspender pelleten LPS i 1,8 ml 50 mM natrium-acetat, pH 4,5, 1% SDS buffer ved virvling. Sonicate prøven ved hjelp av et sonicator-bad inntil pelleten er jevnt dispergert (~ 30 sek).
  8. Inkuber prøven i 30 minutter i kokende vannbad. Kontroller at Caps er stramt, men ikke forseglet.
  9. Fjern fra vannbadet og tillate prøven å avkjøles ved RT i 5 til 10 min.
  10. Konverter oppløsningen inn i en to-fase Bligh-Dyer blandingen ved tilsetning av 2 ml kloroform og 2 mlmetanol, hvilket ga en kloroform: metanol: vandig (2:2:1.8 volum / volum) blanding. Vortex å blande, og sentrifuger i 10 min i klinisk sentrifuger ved 1500 xg til separate faser.
  11. Ekstraher den nedre fase i en ren glass sentrifugerør ved hjelp av en glass-pipette (første ekstraksjon).
  12. Utføre en andre ekstraksjon på prøven ved å tilsette 2 ml av pre-ekvilibrert to-fase Bligh-Dyer nedre fase (fremstilt som i trinn 1.2) til det gjenværende øvre fase fra trinn 11. Vortex og sentrifuger i 10 min. Fjern nedre fase og kombineres med den nedre fase fra den første ekstraksjon.
  13. Til den samlede nedre fase (~ 4 ml totalt volum), tilsett 7,6 ml av pre-ekvilibrert øvre fase (trinn 1.2), hvilket ga en to-fase Bligh-Dyer-løsning (kloroform: metanol: vann; 2:2:1.8, v / v). Vortex og sentrifuger i 10 min.
  14. Fjern den nedre fase til en ren glassrør og tørt med en nitrogen tørketrommel. Tørkede prøver kan bli lagret ved -20 ° C inntil videre bruk.

7. Visualiseringssering av 32 P-merkede Lipid A Art via Tynnsjiktkromatografi

  1. Forbered 32 P-merket lipid En prøve, TLC tank, og TLC-plater som beskrevet i trinn 2.1 til 2.8.
  2. Oppløs 32 P-merket prøve i 500 mL av 04:01 kloroform-methanol (v / v). Vortex og bad sonicate å fullstendig oppløse lipid materiale. Tilsett 5 ul av prøven til scintillasjonsglass inneholdende 5 ml scintillasjonscocktail. Telle i scintilasjonsteller og beregne total teller / min av prøven.
  3. Ved å visualisere radioaktivt merkede fettarter, kan 10 x 20 cm eller 20 x 20 cm TLC-plater anvendes. For 10x20 cm plater, må prøvene bli oppdaget langs opprinnelse merket i trinn 2.5, slik at platens lengste dimensjon er loddrett (dvs. prøver flekket på opprinnelse merket 2 cm over 10 cm kant).
  4. Ved hjelp av en microcapillary pipette, spot 10,000-20,000 kpm / prøven på plate og la flekker å tørke (> 15 min). Prøvene kan trenge å bli konsentrert ved tørking undernitrogen og resuspendert i et egnet volum, for å oppnå 10,000-20,000 tellinger / min / flekk (2 mL eller 2 ul av gangen for <10 mL totalt).
  5. Plasser TLC-plate inneholdende radioaktivt merkede prøvene inn i det pre-ekvilibrert tank. Når løsningsmiddelfronten når toppen av TLC-platen (~ 3 timer), fjernes platen og lufttørkes (> 60 minutter). Forsiktig: TLC plater løper i nærvær av pyridin må tørkes grundig i et avtrekksskap, og spormengder av pyridin kan skade phosphorimaging skjermer. En kald-luftkanon kan brukes for å sikre fullstendig tørrhet.
  6. Pakk platen i plastfolie og utsettes for phosphorimager skjermen i en autoradiography kassett O / N. Den neste morgen, skann skjermen for å få bildet (figur 6). Ved hjelp av bilde densitometry analyse programvare, gir denne metoden for nøyaktig, relativ kvantifisering av lipid A arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Canonical lipid A til E. coli-og Salmonella ente serovar typhimurium er et hexa-acylert disakkarid av glukosamin med fosfatgrupper i 1 - og 4 '-stillingene. Under vekst i rike medier (f.eks Luria Broth) en del av lipid A inneholder et pyrofosfat-gruppe ved 1-stillingen som gir en Tris-fosforylert arter 36 (figur 1). Kdo (3-deoxy-D-manno-octulosonic syre), er festet på 6'-hydroksyl og tjener som en bro for å koble lipid A til de gjenværende karbohydrat domener (dvs. kjerne oligosakkarid-og O-antigen domener) av LPS. Selv om gram-negative bakterier deler en konservert veien for lipid A biosynthesis lik den for E. coli K-12, er det en stor mengde av diversitet i lipid A-strukturer. Dette mangfold oppstår ved innvirkning av latente enzymer som modifiserer lipid A strukturen, som aktiveres som respons på miljømessige stimuli. For example, i S. entefosfatgrupper lipid A kan bli modifisert med kationiske sukker L-4-aminoarabinose (figur 1, blå) eller med en phosphoethanolamine rester (figur 1; magenta). I Salmonella disse modifikasjoner er hentet fra to-komponent-regulator-systemer respons, tilsatt som respons på lave [Mg 2 +], mild sur pH, og tilstedeværelsen av kationiske antimikrobielle peptider. I tillegg i Salmonella, kan palmitat tilsettes for å danne et hepta-acylert lipid A, som fremmer motstandsdyktighet mot kationiske antimikrobielle peptider (figur 1; grønn) 8. Andre modifikasjoner omfatter, men er ikke begrenset til, fjerning av fosfatgrupper og acylkjeder, eller dioksygenase-katalysert addisjon av en hydroksylgruppe til 3'-koblede sekundær acylkjeden observert i en rekke organismer 1,3.

Isolering av intakt lipid A fra hele celler av vår modifikasjon av metoden ifølge Caroff og Raetz er beskrevet i protokollen 1 (figur 2). Denne isolasjonen metoden har vært brukt til å anslå at 10 6 molekyler av lipid A eksisterer per bakteriecelle av E. coli 37. Følgende protokoller 1 og 3, den negative ion MALDI-TOF-massespektrum av lipid A fra E. coli K-12 (W3110) gir den enkeltvis deprotonert ion ([MH] -) ved m / z 1,796.20 som majorly observert arter (figur 3). MALDI-TOF MS ble utført i negativ-reflectron modus for å forbedre spektral oppløsning. Alternativt kan de samme lipid prøven utsettes for negativ modus nano-ESI (protokoll 4) gir hovedsakelig dobbelt deprotonert lipid A-ioner ved m / z 898,1 betegnet med [M-2H] 2 - (Figur 4). Enkeltvis deprotonert lipid A-ioner [MH] - i m / z 1,796.20 er observerbar, men er av mindre relative overflod til [M-2H] 2 - ioner (figur 4). Multipliser ladede arter predominate når du bruker ESI. Fragmentering av CID (figur 5A) eller 193 nm UVPD (Figur 5B) ble utført på [MH] - lipid A ion m / z 1,796.20. Disse teknikkene kan brukes for bedre å tildele kjemiske strukturer, særlig av lipid A-arter inneholdende komplekse kombinasjoner av modifiseringer eller tidligere uncharacterized kjemiske modifikasjoner. Fragmentering profiler er vist med stiplede linjer representerer spaltningsseter og er matchet med m / z verdier under hvert gitt struktur (figur 5). De m / z verdier og spaltningsseter uthevet i rød skrift representerer unike produktioner assosiert med UVPD.

Som beskrevet i protokoller 6 og 7, 32 P-merket lipid A isolert fra to forskjellige E. coli-K-12-stammer ble analysert ved TLC (figur 6). W3110 meste inneholder bis-og tris-fosforylert lipid A (figur 6;venstre felt), mens en mer kompleks TLC mønsteret observert med 32 P-lipid A, isolert fra E. coli stamme WD101 (figur 6, høyre felt) 38. WD101 produserer lipid En sterkt modifisert med aminoarabinose (L-Ara4N) og phosphoethanolamine (PETN). Siden både 1 - og 4 '- fosfat, er tilgjengelige for modifikasjon, kan lipid A fra WD101 beskrives som enkeltvis modifisert, som bare inneholder en L-Ara4N eller PETN i enten fosfat eller dobbelt modifisert hvor begge fosfat er modifisert på en kombinatorisk måte. I tillegg til modifisering ved 1 - og 4 '- fosfater, palmitat tillegg er også observert (se figur 1) og øker R f verdien av lipid A-arter i dette løsningsmiddelsystem (figur 6). Hvis ønskelig, densitometry analyse ved hjelp av en phosphorimager, kan brukes til å quantifiably estimat relative mengder av lipid A-arter i den samme prøven.


Figur 1. Representant lipid Et domene strukturer fra E. coli K-12 og S. enterica serovar Typhimurium. Modifikasjoner på konservert lipid En struktur er vist (til høyre), som beskrevet i Representant Resultater. Klikk her for å se større figur .

Fig. 2
Figur 2. Skjematisk av lipid A isolasjon prosedyre. Outline skildrer kjemisk lyse av bakteriecellen pellet bruker enfase Bligh-Dyer blanding, sentrifugering av lysatet til pellets LPS, mild-en cid hydrolyse å frigjøre lipid A fra vedlagte polysakkarid, og endelig rensing av lipid A med to fase Bligh-Dyer utvinning. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. MALDI-MS analyse av lipid A isolert fra E. coli K-12 (W3110). Spectra oppnådd fra gjennomsnittet av> 300 skudd. Enkeltvis ladet [MH] - lipid A er observert som molekylært ion ved m / z 1,796.2, noe som tilsvarer et deprotonert arter av strukturen vist til høyre.

0623/50623fig4.jpg "/>
Figur 4. ESI-MS analyse av lipid A isolert fra E. coli K-12 (W3110) Enkeltvis [MH] og dobbelt-ladet [M-2H] 2 -. lipid A arter er observert som molekylære ioner av m / z 1,796.2 og m / z 898,1, henholdsvis.

Figur 5
Figur 5. MS / MS-analyse av lipid A isolert fra E. coli K-12 (W3110). Collision indusert dissosiasjon (A) eller ultrafiolett photodissociation (B) ble anvendt for å fragmentere forløper ion m / z 1,796.2. UVPD spesifikke produktioner er angitt i rødt. En fragmentering kartet er gitt (C), hvor svart stiplede linjene indikerer fragmentering assosiert med både KID og UVPD, og røde stiplede linjene indikerer UVPD spekrete fragmentering. Verdiene som er oppført under kartet fragmentering tilsvarer eksakte masser av [MH] -. Produkt ioner Klikk her for å se større figur .

Figur 6
Figur 6. TLC-baserte separasjon av lipid A arter isolert fra E. coli K-12 32 P-merket lipid A ble isolert fra W3110 (venstre felt) eller WD101 (høyre felt), og separert i en tank TLC løsningsmiddelsystem inneholdende kloroform. pyridin: 88% maursyre: vann (50:50:16 : 5 v / v).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen har vi inngående isolering av lipid A arter fra hele celler av bakterier, og beskrev TLC eller MS baserte analytiske metoder til kjemisk karakter dette isolerte materialet. Tandem massespektrometri er en kraftfull strategi for de novo strukturell karakterisering av biologiske forbindelser, og er verdifull for den kjemiske karakterisering av panoply av lipid A-molekyler som observeres i naturen. CID og UVPD er to komplementære aktiveringsmetoder som skaper ulike typer produktioner som gir viktige fingeravtrykk for lipid En molekyler. MS / MS fragmentering bruker både KID og UVPD tillater belysning av subtile forskjeller i lipid A strukturer, og gir finere detaljer for kjemisk struktur oppdrag. Data av denne type er det nødvendig å fastsette nøyaktige korrelerer struktur / funksjonsforholdet i biologi of lipid A molekylære arter. Vi har også beskrevet en fremgangsmåte for 32 P-radiomerking lipid A-arter i small-skala bakterielle kulturer, hvor den kjemiske mønster av 32 P-lipid A-arter kan visualiseres ved hjelp av TLC og autoradiografi.

Det finnes en rekke funksjoner til denne protokoll som alle brukere bør være klar over. For stor-skala lipid A-preparater (protokoll 1), kan andelen av startoppløsningsmiddel til mengden av bakteriell pellet være optimalisert for å forbedre totalt utbytte. Men dette forhold bare kan bestemmes empirisk. Beløpene som er beskrevet i denne protokollen representerer et godt utgangspunkt for de fleste bakteriestammer. Kultur volumer for lipid A utvinning og isolasjon kan også bli justert avhengig av bakteriestammen du arbeider med. For eksempel V. cholerae krever minst 200 ml kultur for å oppnå høy kvalitet massespektra, men volumet kultur for E. coli kan skaleres ned til 5 ml. Mer utgangsmateriale (større kulturvolum) er nødvendig for enkelte bakteriearter, fordi de hydrolyser skritt som frigjør lipid A fra hele LPS er mindre effektiv. For eksempel organismer inneholder en funksjonell Kdo dioxygenase eller Kdo kinase utstillings redusert lipid A rentene etter mild-syrehydrolyse 39. Ofte mutanter med endret LPS / lipid A-strukturer eller en spesiell bakteriearter er ofte vanskelige å pelletere under celle innhøsting. For disse stammene, kan lengden av sentrifugering bli utvidet for å øke utbyttet. Også verdt å merke, etter cellelyse i en enfase Bligh-Dyer blandingen og LPS er pelletert (se trinn 1.9), kan kreves ekstra vaske tiltak for å redusere fosfolipid forurensning. Når isolere lipid A fra E. coli eller Salmonella, er bare én vaske nødvendig. Imidlertid, hvis isolering lipid A fra andre organismer (f.eks V. cholerae eller Helicobacter pylori), er flere vasketrinn er nødvendig.

Etter mild syrehydrolyse i SDS, utbyttet av lipid A arter med redusert hydrofobitet (dvs. mer phosphate grupper> 2 eller færre acylkjeder <5) kan forbedres ved bruk av et surt Bligh-Dyer-ekstraksjon. For de volumer som benyttes i protokoll delen 1, tilsett 225 pl av konsentrert HCl til SDS-oppløsning inneholdende hydrolysert lipid A, etterfulgt av 30 ml kloroform og 30 ml metanol i en to-fase Bligh-Dyer-blanding av kloroform: metanol: 0,1 M HCl (2:2:1.8, v / v). For de volumer som benyttes i protokoll delen 6 tilsettes 15 mL konsentrert HCl til SDS-oppløsning inneholdende hydrolysert lipid A, etterfulgt av 2 ml kloroform og 2 ml metanol, hvilket ga en kloroform: metanol: 0,1 M HCl (2:2:1.8, v / v) blanding. Etter en sur Bligh-Dyer-ekstraksjonsprosedyren, kan pyridin tilsettes til de samlede nedre faser for å nøytralisere syren (1 dråpe pyridin / 2 ml av sluttprøvevolum). Dette ytterligere trinn bør utføres før tørking av prøven, i et avtrekksskap. Vær forsiktig med å bruke overflødig pyridin, noe som kan føre til fjerning av esterbundet fettsyrer. I tillegg, hvis lipid sample er vanskelig å tørke under nitrogen, tilsett noen få milliliter av kloroform: metanol (4:1, v / v) til kolben og fortsette å tørke prøven til fullførelse.

Den komplekse kjemiske heterogenitet av lipid A arter observert i enkelte organismer (f.eks V. cholerae, Yersinia pseudotuberculosis) kan noen ganger gjøre TLC-eller MS-basert analyse vanskelig. Kolonne-kromatografi kan anvendes oppstrøms for disse analytiske teknikker for å pre-fraksjonerer isolerte lipid A-arter inn i mer enkle blandinger. Anionbytte med dietylaminoetyl (DEAE)-cellulose er mest brukt 40. Som en generell retningslinje lipid A modifisert ved enten fosfat-stilling, med ikke-sure grupper så som aminoarabinose eller phosphoethanolamine, eluerer før umodifiserte lipid A-arter 40. Tilsvar tris-fosforylert lipid A elutes godt etter umodifiserte bisphosphorylated arter 36,40. Revers fase-kromatografi kan anvendes for å fraksjonere lipid A species av varierende grader av hydrofobitet 41. Kolonne-kromatografi er også nyttig i fjerning av gjenværende SDS etter mild syrehydrolyse og påfølgende Bligh-Dyer lipid A uttrekningstrinn. Høye nivåer av gjenværende SDS kan bidra til å signalisere undertrykkelse i spektra oppnådd ved våre følsomme ESI-MS protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd AI064184 og AI76322 fra National Institutes of Health (NIH), og ved Grant 61789-MA-MUR fra Army Research Office til MST Forskning ble også støttet av Welch Foundation Grant F1155 og NIH gi R01GM103655 til JSB

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
  2. Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
  3. Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
  4. Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
  5. Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
  7. Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
  8. Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
  9. Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
  10. Westphal, O. aJ., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
  11. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
  12. Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
  13. Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
  14. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
  15. Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
  16. Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).
  17. Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
  18. Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
  19. Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
  20. Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
  21. Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
  22. Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
  23. Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
  24. Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
  25. El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
  26. Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
  27. Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
  28. Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
  29. Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
  30. Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
  31. Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
  32. Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
  33. Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
  34. Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
  35. Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
  36. Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
  37. Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
  38. Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
  39. Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
  40. Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
  41. Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).

Tags

Chemistry membranlipider Toll-lignende reseptorer endotoksiner glykolipider lipopolysakkarider Lipid A Microbiology Lipids lipid A Bligh-Dyer tynnsjiktskromatografi (TLC) lipopolysakkarid massespektrometri Collision Induced Dissosiasjon (CID ) Photodissociation (PD)
Isolation and Chemical Characterization of Lipid A fra Gram-negative bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Henderson, J. C., O'Brien, J. P.,… More

Henderson, J. C., O'Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter