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Immunology and Infection

एफडीए को मंजूरी दी वेरो कोशिकाओं में टीके के विकास के लिए संयोजक arenavirus की पीढ़ी

Published: August 1, 2013 doi: 10.3791/50662
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 2Departments of Immunology and Microbial Sciences, The Scripps Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

क्लोन cDNAs, के रूप में आनुवंशिकी को उल्टा करने के लिए भेजा, एक दृष्टिकोण से पुनः संयोजक arenaviruses का बचाव शोधकर्ताओं arenavirus के जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं को, विशिष्ट वायरल जीन उत्पादों की भूमिका, साथ ही उनके विभिन्न विशिष्ट डोमेन और अवशेषों के योगदान की जांच करने के लिए अनुमति देता है . इसी तरह, मानव रोगजनक arenaviruses से निपटने के लिए प्रभावी और सुरक्षित टीकों की पीढ़ी के लिए उपन्यास संभावनाएं प्रदान टीके के विकास के लिए एफडीए को मंजूरी दी सेल लाइनों (वेरो) में आनुवांशिकी तकनीक रिवर्स.

Abstract

arenavirus रिवर्स आनुवंशिकी के विकास और कार्यान्वयन arenavirus क्षेत्र 4 में एक महत्वपूर्ण सफलता का प्रतिनिधित्व करता है. उनके जीनोम में पूर्व निर्धारित परिवर्तन के साथ पुनः संयोजक संक्रामक arenaviruses उत्पन्न करने की क्षमता के साथ एक साथ सेल आधारित arenavirus minigenome सिस्टम के उपयोग arenavirus जीवन चक्र के विभिन्न चरणों को वायरल निर्धारकों के योगदान की जांच, साथ ही वायरस मेजबान की है बातचीत और arenavirus रोगजनन 1, 3, 11 के तंत्र. इसके अलावा, trisegmented arenaviruses का विकास इस प्रकार arenavirus आधारित टीका वेक्टर अनुप्रयोगों 5 की संभावना खोलने के हित के अतिरिक्त विदेशी जीन व्यक्त करने arenavirus जीनोम के उपयोग की अनुमति दी है. इसी तरह, व्यक्त रिपोर्टर जीन में सक्षम एकल चक्र संक्रामक arenaviruses के विकास highl शामिल अनुसंधान की सुरक्षा में सुधार करने के लिए एक नया प्रयोगात्मक उपकरण प्रदान करता हैवाई रोगजनक मानव arenaviruses 16. प्लाज्मिड आधारित रिवर्स आनुवंशिकी तकनीक का उपयोग कर पुनः संयोजक arenaviruses की पीढ़ी अब तक खाद्य एवं औषधि प्रशासन के विकास (एफडीए) से लाइसेंस टीका या टीका वैक्टर के लिए कुछ बाधाओं बन गया है जो 7,19 कृंतक सेल लाइनों का उपयोग करते हैं, पर भरोसा है. इस बाधा को दूर करने के लिए, हम एफडीए को मंजूरी दी वेरो कोशिकाओं में पुनः संयोजक arenaviruses के कुशल पीढ़ी यहाँ का वर्णन.

Introduction

Arenaviruses Arenaviridae परिवार के हैं कि एक bisegmented, नकारात्मक असहाय आरएनए जीनोम 3 के साथ छा वायरस हैं. arenavirus जीनोम दो अलग वायरल खंडों 3 से एक ambisense फैशन में चार प्रोटीन encodes. बड़े (एल) खंड शाही सेना पर निर्भर शाही सेना पोलीमरेज़ (एल) और वायरस नवोदित की मुख्य प्रेरणा शक्ति के रूप में कार्य करता है कि छोटे रिंग (वास्तव में दिलचस्प नई जीन) उंगली प्रोटीन (जेड) encodes. छोटी सी (एस) खंड वायरल nucleoprotein (एनपी) और सतह ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी) (चित्रा 1) encodes.

Arenaviridae परिवार के कई सदस्यों को मनुष्यों 3 में घातक रक्तस्रावी बुखार (एचएफ) के लिए जिम्मेदार हैं. सिद्धांत चिंताओं के अस्पताल में भर्ती मरीजों 8, 9 में उच्च मृत्यु दर के कारण जाना जाता है जो Lassa वायरस (LASV) और जुनिन वायरस (JUNV), कर रहे हैं. इन वायरस क्रमशः पश्चिम अफ्रीका और ग्रामीण अर्जेंटीना, में पाई जाती हैं, हालांकि,यात्रा वृद्धि 10 के कारण गैर स्थानिक क्षेत्रों को LASV और JUNV के आयात की बढ़ती चिंता कर रहे हैं. सामान्य रूप से मानव में गंभीर बीमारी के साथ जुड़ा नहीं है, हालांकि इसके साथ ही, prototypic arenavirus लिम्फोसाईटिक choriomeningitis वायरस (LCMV) immunocompromised रोगियों 6, 15 में घातक संक्रमण के मामलों की गई है के रूप में एक उपेक्षित रोगज़नक़ माना जाता है और जन्मजात जन्म दोष और सहज गर्भपात के लिए जिम्मेदार है गर्भवती महिलाओं को 2, 13 में. वहाँ वर्तमान में कोई अमेरिका arenaviruses और उपचार के खिलाफ टीके केवल आंशिक रूप से प्रभावी है और अक्सर महत्वपूर्ण पक्ष प्रभाव के साथ जुड़े जो न्यूक्लीओसाइड अनुरूप ribavirin तक सीमित है, एफडीए को मंजूरी दे दी.

प्लाज्मिड आधारित रिवर्स आनुवंशिकी 4 और पुनः संयोजक arenaviruses 7, 19 की पीढ़ी की शुरूआत बहुत arenavirus अनुसंधान के क्षेत्र उन्नत है. वर्तमान में, कृंतक कोशिकाओं (जैसे बीएचके-21) के रूप में gener के लिए उपयोग किया जाता हैएस और एल खंडों की प्रारंभिक प्रतिलेखन निर्देशन प्रजाति विशेष murine शाही सेना पोलीमरेज़ मैं (पीओएल-मैं) प्रमोटर के कारण पुनः संयोजक arenaviruses से समझना. बीएचके -21 कोशिकाओं में हालांकि वायरस बचाव संभावित टीका बीज उम्मीदवार के रूप में पुनः संयोजक arenaviruses की पीढ़ी के लिए एक अनुमोदित विधि नहीं हैं. यहाँ हम prototypic पुरानी दुनिया (ओ) LCMV और नई दुनिया (पश्चिम) वेरो कोशिकाओं में JUNV खरा # 1 तनाव के कुशल बचाव के लिए मानव नीति मैं प्रमोटर के दस्तावेज़ का उपयोग. एक समान पद्धति का उपयोग करना, हम पुनः संयोजक trisegmented LCMV (r3LCMV) और खरा # 1 (r3Candid # 1) दो अलग एस आरएनए क्षेत्रों 5 में इनकोड दो अतिरिक्त विदेशी जीन होते हैं कि arenaviruses उत्पन्न. इस नई प्रणाली एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सरल प्रोटोकॉल के बाद लेकिन तुरंत संभावित टीका या टीका वेक्टर बीज के रूप में पुनः संयोजक arenaviruses की पीढ़ी में लागू किया जा सकता है न केवल.

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Protocol

1. Arenavirus बचाव अभिकर्मक

हमारे बचाव प्रणाली nucleoprotein (एनपी) और शाही सेना पर निर्भर शाही सेना पोलीमरेज़ (एल), शाही सेना प्रतिकृति और arenavirus जीनोम के जीन की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक वायरल पार अभिनय कारकों एन्कोडिंग पोलीमरेज़ द्वितीय प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids दोनों के उपयोग पर आधारित था 7, 19, और सेलुलर एस की शाही सेना पोलीमरेज़ मैं (पीओएल-मैं), और एल antigenome आरएनए प्रजातियों 7 के माध्यम से इंट्रासेल्युलर संश्लेषण, निर्देशित करने के लिए सक्षम प्लास्मिडों. हमारे अध्ययन में हम मैं प्रमोटर और murine टर्मिनेटर दृश्यों (चित्रा 2) मानव पोलीमर्स का उपयोग करता है जो pCAGGS प्रोटीन चिकन β-actin के प्रमोटर और polyadenylanation (पीए) संकेत दृश्यों का उपयोग करता है जो प्लाज्मिड अभिव्यक्ति,, और मानव नीति मैं प्लाज्मिड, उपयोग . एस और एल आरएनए क्षेत्रों hpol-मैं द्वारा प्रतिलेखन पर जीनोमिक आरएनए क्षेत्रों की पीढ़ी के लिए अनुमति देने के लिए एक antigenomic अभिविन्यास में hpol-मैं प्लाज्मिड में क्लोन कर रहे हैं. जंगली ty के बचाव के लिएपे पुनः संयोजक LCMV (rLCMV) और खरा # 1 (rCandid # 1) pCAGGS एनपी और प्रत्येक वायरस से एल उनके संबंधित मानव नीति मैं एस और एल आरएनए क्षेत्रों (चित्रा 3) के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट थे. पुनः संयोजक trisegmented LCMV (r3LCMV) और # 1 (# 1 r3Candid) खरा की पीढ़ी में एक समान प्रोटोकॉल का पालन किया लेकिन एस खंड दो अलग नीति मैं एस प्लास्मिड, प्रत्येक एन्कोडिंग एक विशिष्ट पत्रकार जीन में विभाजित किया गया था: एक में, एनपी खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रिपोर्टर जीन (hpol-मैं एस GFP / जीपी) और दूसरे में, वायरल ग्लाइकोप्रोटीन अग्रदूत (जीपीसी) ओआरएफ Gaussia luciferase (gluc) रिपोर्टर जीन के साथ बदल जाता है के साथ बदल दिया गया था (hpol-मैं एस एन पी / gluc). प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 4 में सचित्र है. निम्नलिखित अभिकर्मक और संक्रमण प्रोटोकॉल 6 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए स्थापित किया गया है.

  1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) मिश्रण: OptiMEM मीडिया के 250 μl तैयार है और, निर्भर करता हैपर वायरस बचाव, 10 - अभिकर्मक प्रति LPF2000 की 12 ग्राम (1 ग्राम / μl) (1 टेबल). डीएनए के ग्राम प्रति 2.5 ग्राम LPF2000 का एक अनुपात की सिफारिश की है. आरटी पर 10 मिनट - 5 के लिए सेते हैं. इस बीच, एक अलग microcentrifuge ट्यूब (1.2 चरण) में प्लाज्मिड अभिकर्मक मिश्रण तैयार करते हैं.
  2. प्लास्मिड डीएनए अभिकर्मक मिश्रण: प्रत्येक वायरस बचाव के लिए सिफारिश की मात्रा (1 टेबल देखें) का उपयोग कर एक microcentrifuge ट्यूब में प्लाज्मिड अभिकर्मक कॉकटेल तैयार. OptiMEM के साथ 50 μl के अंतिम मात्रा लाओ.
  3. OptiMEM-LPF2000 डीएनए प्लाज्मिड मिश्रण: प्लास्मिड डीएनए अभिकर्मक मिश्रण (1.2 चरण) में OptiMEM-LPF2000 मिश्रण (1.1 कदम) के 250 μl जोड़ें. आरटी पर 30 मिनट - 20 के लिए इस मिश्रण को सेते हैं. इस बीच तैयार करने और अभिकर्मक प्रतिक्रिया प्रति 1 एक्स 10 6 वेरो कोशिकाओं गिनती. वेरो कोशिकाओं निलंबन में ट्रांसफ़ेक्ट किया जाएगा.
  4. वेरो कोशिकाओं की तैयारी: वेरो सेलरास 100 मिमी व्यंजन में संवर्धित कर रहे हैं. शुरू करने से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 1x पीबीएस, DMEM 10% FBS के 1% पुनश्च मीडिया, और trypsin-EDTA के मिश्रण लाने
    1. 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार, कोशिकाओं को धो लें.
    2. Trypsin-EDTA के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं Trypsinize और कोशिकाओं को अलग (लगभग 5 मिनट) तक इंतजार. कोमल शायद पूरी तरह से बर्तन से कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक दोहन.
    3. ध्यान से, एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में DMEM 10% FBS के 1% पी एस के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend.
    4. एक अपकेंद्रित्र में 1000 rpm पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
    5. DMEM 10% FBS के 1% पी एस के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती और 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल एकाग्रता समायोजित. 1 एक्स 10 अभिकर्मक प्रति 6 वेरो कोशिकाओं सबसे अच्छा परिणाम का उत्पादन - यह 0.5 कि मनाया गया.
  5. LPF2000/DNA और कोशिकाओं मिक्स: 20 के बाद - 30 मिनट के कमरे के तापमान ऊष्मायन (1.3 चरण) के लिए वेरो कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर (1 एक्स 10 6) (1.4 कदम) जोड़ेंकमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए OptiMEM-LPF2000 डीएनए प्लाज्मिड मिश्रण और सेते हैं.
  6. 6 अच्छी तरह प्लेटें में बीज LPF2000/DNA-cell मिश्रण: 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं में डीएनए LPF2000-वेरो मिश्रण (1.5 कदम) जोड़ें. धीरे 6 अच्छी तरह से थाली हिला और 37 में इनक्यूबेटर में अभिकर्मक सेते रातोंरात जाने डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  7. अभिकर्मक मध्यम बदलें: लगभग 16-24 घंटे बाद अभिकर्मक, अभिकर्मक मीडिया को दूर संक्रमण मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ने और एक अतिरिक्त 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
  8. सेल मार्ग: संक्रमण मीडिया में ऊष्मायन के 48 घंटे के बाद, टिशू कल्चर तैरनेवाला (टीसीएस) को हटाने और एक 100 मिमी डिश में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से गुजरती हैं. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को वायरस कणों को उत्पन्न करने के लिए अतिरिक्त ऊष्मायन की जरूरत है क्योंकि टीसीएस शायद ही संक्रामक वायरस होता है. सेल पारित होने के लिए:
    1. 1x पीबीएस के 2 मिलीग्राम से, दो बार, कोशिकाओं को धो लें.
    2. कोशिकाओं डब्ल्यू Trypsinize रबर 0.5 trypsin-EDTA के मिलीग्राम और कोशिकाओं को अलग जब तक प्रतीक्षा करें.
    3. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में DMEM 10% FBS के 1% पी एस के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend.
    4. 5000 rpm पर 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस एक microcentrifuge में लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
    5. ध्यान से संक्रमण मीडिया के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और एक 100 मिमी पकवान कोशिकाओं हस्तांतरण. 8 मिलीग्राम, वायरस के लिए ध्यान केंद्रित कोशिकाओं के सूखने के साथ ही रोकने के लिए पर्याप्त मात्रा के लिए, संक्रामक मीडिया के साथ थाली में कुल मात्रा को लाओ.
  9. धीरे 37 में 100 मिमी पकवान हिला और इनक्यूबेटर में वेरो कोशिकाओं के ऊष्मायन जारी डिग्री सेल्सियस और 5% 72 घंटे के लिए सीओ 2.
  10. टीसीएस का संग्रह: 72 घंटा ऊष्मायन के बाद, एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में टीसीएस इकट्ठा. एक अपकेंद्रित्र में 2500 rpm पर 5 मिनट के लिए centrifuging द्वारा सेल मलबे को हटा दें. संक्रामक arenavirus टीसीएस में पाया जाता है, तो सेल मलबे गोली से हटाने और -80 में टीसीएस दुकान डिग्री सेल्सियस
संयोजक arenavirus बचाव के ले "> 2. पुष्टि

RLCMV और rCandid # 1 का सफल बचाव की जांच एक ध्यान गठन इकाई (FFU) immunofluorescence परख (आईएफए) के माध्यम से हासिल की है. जंगली प्रकार के वायरस बचाव के लिए हम वायरल एनपी के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करें. r3LCMV और r3Candid # 1 इस प्रकार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (GFP) और / या luminescence (gluc) द्वारा एंटीबॉडी की आवश्यकता के बिना वायरल का पता लगाने और अनुमापन की अनुमति, दो रिपोर्टर जीन (GFP और gluc) सांकेतिक शब्दों में बदलना.

  1. जंगली प्रकार पुनः संयोजक arenavirus बचाव की पुष्टि करें: अनुमापन पहले दिन, पीबीएस के साथ दो बार वेरो कोशिकाओं धो trypsinize और 80 तक पहुंचने के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें तैयार - 90% संगम अगले दिन (4 x 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से). धीरे कोशिकाओं का एक वर्दीधारी वितरण पाने के लिए हाथ से प्लेट हिला. संस्कृति कोशिकाओं, रात में, 37 में डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ. संक्रमण के साथ आगे बढ़ने से पहले, एक monolayer पुष्टि करने के लिए खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जाँच करें:
    1. क्रमानुसार पतला (10 गुना dilutions) वायरस युक्त टीसीएस OptiMEM में 100 मिमी पकवान (कदम 1.10) में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से बरामद किया.
    2. वरीय वेरो कोशिकाओं से मीडिया निकालें, 1x पीबीएस के 50 μl के साथ दो बार धोने, और क्रमानुसार पतला वायरस (2.1 कदम) के 50 μl के साथ कोशिकाओं को संक्रमित. 37 में 1.5 घंटे के लिए कोशिकाओं को संक्रमित डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
    3. संक्रमण के बाद, वायरस inoculum हटाने 100 संक्रमण मीडिया की μl / अच्छी तरह से जोड़ने के लिए और 16 के लिए कोशिकाओं को सेते हैं - 18 घंटे. वायरल फिर से संक्रमण वायरल titers के ऊपर के आकलन में हो सकता है, जो 18 घंटे ऊष्मायन के बाद हो सकता है.
    4. 16 से कम - 18 घंटे के बाद संक्रमण, प्रत्येक अच्छी तरह से टीसीएस को हटाने और आरटी पर 15 मिनट के लिए, 1x पीबीएस में पतला 4% formaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक.
    5. अगला, निर्धारण समाधान निकालने और कोशिकाओं permeabilize के साथ 0.1% ट्राइटन X-100 कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए, 1x पीबीएस में पतला.
    6. Permeabilization के समाधान महाप्राण, तो कोशिकाओं 3 बार वाई धोनावें 1x पीबीएस.
    7. आरटी पर 1 घंटे के लिए 1x पीबीएस (अवरुद्ध समाधान) में 2.5% एल्बुमिन गोजातीय सीरम (बीएसए) के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात अवरुद्ध और एंटीबॉडी ऊष्मायन अगले दिन के साथ जारी रखा जा सकता है.
    8. इस बीच प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करते हैं. अवरुद्ध समाधान में LCMV और खरा # 1 विशेष प्राथमिक एंटीबॉडी पतला, और फिर 3500 rpm पर 15 मिनट के लिए / अवरुद्ध समाधान एंटीबॉडी अपकेंद्रित्र. बी संसाधन (1:500 कमजोर पड़ने) से मोनोक्लोनल विरोधी LCMV एनपी एंटीबॉडी क्लोन 1.1.3 (1:30 कमजोर पड़ने) 16 और मोनोक्लोनल विरोधी JUNV एनपी एंटीबॉडी SA02-BG12 rLCMV का पता लगाने और rCandid # 1 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है , क्रमशः.
    9. एक 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, अवरुद्ध समाधान aspirate और कोशिकाओं को प्राथमिक एंटीबॉडी के 50 μl जोड़ने के लिए और 37 पर 1 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
    10. इस समय, अवरुद्ध समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला, और फिर 3500 rpm पर 15 मिनट के लिए एंटीबॉडी / अवरुद्ध समाधान अपकेंद्रित्र. पालीप्राथमिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए क्लोनल खरगोश विरोधी माउस आईजीजी FITC माध्यमिक एंटीबॉडी चित्रा 5 में मनाया छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
    11. 1 घंटा ऊष्मायन के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी महाप्राण 1x पीबीएस के साथ 3 बार धो, और 37 पर 30 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ने डिग्री सेल्सियस
    12. 30 मिनट ऊष्मायन के बाद, माध्यमिक एंटीबॉडी महाप्राण और 1x पीबीएस के साथ 3 बार धो लो. कोशिकाओं दोनों मिलीलीटर (FFU / एमएल) के प्रति इकाइयों के गठन फोकस गिनती द्वारा वायरल बचाव और अनुमापन की सफलता का निर्धारण करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग अब देखा जा करने के लिए तैयार हैं.
  2. r3LCMV और # 1 r3Candid वायरल बचाव: इन वायरस के दो रिपोर्टर जीन व्यक्त चूंकि, उनके GFP अभिव्यक्ति या टीसीएस में gluc अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी जा सकती बचाता है. बचाव भी टीसीएस में gluc की अभिव्यक्ति से इसकी पुष्टि की जा सकती है. Trisegmented वायरस टाइट्रेट करने के लिए, हम 2.1.4 के लिए कदम 2.1 का पालन करें, लेकिन कोशिकाओं ख की जरूरत नहीं हैई क्योंकि GFP अभिव्यक्ति का एक सफल वायरल बचाव निर्धारित करने के लिए तय की. वायरस का अनुमापन FFU / एमएल की गणना के द्वारा निर्धारित किया जाएगा. Gluc अभिव्यक्ति, टीसीएस से gluc अभिव्यक्ति द्वारा सफल वायरल बचाव निर्धारित करने के लिए एक gluc परख किट (Biolux Gaussia luciferase परख किट, न्यू इंग्लैंड Biolabs) का उपयोग करके मापा जा सकता है. कि अंत करने के लिए:
    1. एक 96 अच्छी तरह से सफेद प्लेट (फ्लैट नीचे microtiter प्लेट, फिशर साइंटिफिक) में pipet टीसीएस के 100 μl.
    2. Luminometer (LumiCount, पैकार्ड बायोसाइंसेज) की स्थापना की.
    3. प्रत्येक नमूने के 100 μl gluc परख समाधान (के रूप में निर्माता से सिफारिश की) और luminometer के साथ gluc रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति उपाय - 50 जोड़ें. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, जंगली प्रकार के वायरस से संक्रमित कोशिकाओं से टीसीएस के gluc अभिव्यक्ति मापा गया था.

3. ऊतक संस्कृति supernatants के बीतने

वायरल बचाव अभिकर्मक क्षमता पर निर्भर करता है. वेरो कोशिकाओं को दिखाया गया हैअन्य सेल लाइनों के 14 से भी कम अभिकर्मक क्षमता है. टीसीएस में वायरस titers कम कर रहे हैं, वायरस बढ़ाना करने के लिए 72 घंटे के लिए 0.01 (LCMV) या 0.1 (# 1 खरा) के संक्रमण की बहुलता (MOI) पर ताजा वेरो कोशिकाओं को संक्रमित.

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Representative Results

एक पुनः संयोजक जंगली प्रकार arenavirus का सफल बचाव आइएफए (चित्रा 5) का उपयोग वायरल एंटीजन की उपस्थिति द्वारा की पुष्टि की जाएगी. पुनः संयोजक trisegmented वायरस के मामले में सफल वायरल बचाव प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 6A) द्वारा GFP अभिव्यक्ति देख द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. सफल बचाव आगे gluc अभिव्यक्ति (चित्रा 6B) का आकलन द्वारा की पुष्टि की जाएगी. जंगली प्रकार और trisegmented arenavirus का सफल बचाव illustrating प्रतिनिधि परिणाम उपर्युक्त प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया गया.

चित्रा 1
चित्रा 1. Arenavirus जीनोम संगठन और विरिअन संरचना. Arenaviruses bisegmented जीनोम 3 के साथ छा, नकारात्मक भावना आरएनए वायरस हैं. प्रत्येक खंड एक ambisense कोडिंग रणनीति दो वायरल protei के संश्लेषण को निर्देशित करने के लिए उपयोग करता हैविपरीत अभिविन्यास 3 में एनएस. बड़ा (एल) के खंड (7.2 एमबी) शाही सेना पर निर्भर शाही सेना पोलीमरेज़ (एल) और नवोदित प्रक्रिया 3 निर्देशन सहित मैट्रिक्स की तरह काम करता है, यह है कि छोटे अनामिका प्रोटीन (जेड) encodes. लघु (एस) के खंड (3.5 एमबी) ग्लाइकोप्रोटीन अग्रदूत (जीपीसी) और nucleoprotein (एनपी) encodes. जीपीसी के बाद translationally रिसेप्टर मान्यता और सेल प्रविष्टि 17, 18 के लिए जिम्मेदार विरिअन संरचना की सतह पर spikes है कि गठन ग्लाइकोप्रोटीन जटिल (जीपी) के रूप में सहयोगी है, जो जीपी -1 और जीपी -2, निर्माण करने के लिए संसाधित है. एनपी विषाणु आरएनए (vRNA) जीनोम encapsidates और एक साथ एल प्रोटीन फार्म के साथ वायरल प्रतिकृति और प्रतिलेखन 12 के लिए कम से कम घटक हैं कि वायरल ribonucleoproteins (vRNPs). IGR: intergenic क्षेत्र.

चित्रा 2
चित्रा 2. Arenavirus Rescuई प्लास्मिडों. वेरो कोशिकाओं में पुनः संयोजक arenavirus की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया plasmids के आरेख. प्लाज्मिड प्रोटीन अभिव्यक्ति pCAGGS वायरल एल और एन पी 4, 7 के संश्लेषण निर्देशित करने के लिए चिकन β-actin के प्रमोटर और खरगोश β-ग्लोबिन polyadenylation (पीए) संकेत दृश्यों का उपयोग करता है. सीएमवी आईई बढ़ाने: cytomegalovirus तत्काल जल्दी बढ़ाने. Intron: चिकन β-actin के intron अनुक्रम. hpol-मैं plasmids के विषाणु आरएनए क्षेत्रों के संश्लेषण को निर्देशित करने के लिए मानव पोलीमर्स मैं प्रमोटर और murine पोलीमर्स टर्मिनेटर दृश्यों का उपयोग करता है. PCAGGS और hpol-मैं प्लास्मिडों दोनों एम्पीसिलीन प्रतिरोधी (Ampr) हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. . PCAGGS एनपी और एल, और hpol-मैं एस और एल एन पी और एल की आवश्यकता होती है: जंगली प्रकार और trisegmented arenavirus बचाव काले अंडाकार में पुनः संयोजक जंगली प्रकार arenavirus की पीढ़ी के लिए आवश्यक प्लास्मिडों हैंवायरल प्रतिलेखन और प्रतिकृति आरंभ करने के लिए घ. hpol-मैं एस एंड एस और एल antigenomic आरएनए प्रजातियों की नीति मैं के माध्यम से एल प्रत्यक्ष इंट्रासेल्युलर संश्लेषण,,. PCAGGS एनपी और एल, साथ ही hpol-मैं जंगली प्रकार arenavirus बचाव के लिए वर्णित उन लोगों के रूप में वही कर रहे हैं जो, प्लाज्मिड एल:. लाल अंडाकार में trisegmented arenaviruses की पीढ़ी के लिए आवश्यक प्लास्मिडों हैं hpol-मैं एस दो प्लास्मिड में विभाजित है: प्लाज्मिड में, एनपी GFP (hpol-मैं एस GFP / जीपी) के साथ बदल रहा है और अन्य प्लाज्मिड में, जीपी gluc जीन (hpol-मैं एस एन पी / gluc द्वारा बदल दिया है ).

चित्रा 4
4 चित्रा. Arenavirus बचाव प्रोटोकॉल. Arenavirus बचाव 6 अच्छी तरह से थाली प्रारूप का उपयोग वेरो कोशिकाओं में किया जाता है. संक्षेप में, वेरो कोशिकाओं 2000 Lipofectamine का उपयोग दिवस 1 पर निलंबन में ट्रांसफ़ेक्ट हैं. 24 घंटे बाद अभिकर्मक पर, मीडिया ताजा संक्रामक मीडिया के साथ बदल रहा है. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए incubated हैं एक अतिरिक्त 48 घंटे के लिए और फिर स्केल अप एक 100 मिमी व्यंजन (4 दिन) में. 100 मिमी व्यंजन में वेरो कोशिकाओं एक अतिरिक्त 72 घंटे के लिए incubated हैं. 7 दिन बाद अभिकर्मक टीसीएस में आइएफए (rLCMV और rCandid # 1) या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (r3LCMV और r3Candid # 1) ताजा वेरो कोशिकाओं में निम्नलिखित संक्रमण या तो द्वारा वायरल का पता लगाने के लिए एकत्र होते हैं. वायरल titers अपेक्षा से कम हैं, टीसीएस वायरस बढ़ाना ताजा वेरो कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 5
चित्रा 5. सेल मार्ग (100 मिमी व्यंजन) से एक सफल जंगली प्रकार के वायरल बचाव. टीसीएस की पुष्टि 96 अच्छी तरह प्लेटें में ताजा वेरो कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. 24 घंटे के बाद संक्रमण पर, कक्षों, तय permeabilized, और LCMV या खरा # 1 विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ धुंधला पहले अवरुद्ध कर रहे हैं. वायरल एंटीजन की उपस्थिति प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग मनाया जाता है. स्केल सलाखों, 100 माइक्रोन.

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6 चित्रा. Trisegmented वायरस का सफल बचाव. संयोजक trisegmented LCMV (r3LCMV) और # 1 खरा (r3Candid # 1) GFP और gluc दोनों सांकेतिक शब्दों में बदलना. सफल वायरल बचाव जल्दी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (ए) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. Gluc रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति वायरल बचाव का एक माध्यमिक पुष्टि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. गुना प्रेरण जंगली प्रकार के वायरस के संक्रमण (बी) को gluc luminescence के मूल्यों को सामान्य बनाने के द्वारा निर्धारित किया गया था. स्केल सलाखों, 100 माइक्रोन.

तालिका 1
तालिका 1. Arenavirus बचाव के लिए प्लाज्मिड / Lipofectamine डीएनए एकाग्रता. पुनः संयोजक हरि की पीढ़ी के लिए अनुशंसित डीएनए और LPF2000 सांद्रतावेरो कोशिकाओं में D-प्रकार और trisegmented arenaviruses संकेत कर रहे हैं.

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Discussion

प्लाज्मिड आधारित रिवर्स आनुवंशिकी तकनीक का उपयोग कर पुनः संयोजक arenaviruses की पीढ़ी arenavirus जीव विज्ञान के कई विभिन्न पहलुओं की जांच के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण बन गया है. यहाँ हम arenavirus प्रदर्शन से मौजूदा प्रणाली के लिए एक महत्वपूर्ण सुधार दस्तावेज़ अन्य संक्रामक रोगों के खिलाफ arenaviruses और टीका वैक्टर के खिलाफ एफडीए को मंजूरी दी वैक्सीन उम्मीदवारों की संभावित पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, वेरो कोशिकाओं में बचाता है.

शामिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं अच्छी तरह से स्थापित सामान्य रूप से कर रहे हैं और महत्वपूर्ण बाधाएं उत्पन्न नहीं होना चाहिए. ध्यान से एक लगातार सफलता सुनिश्चित करने के लिए निगरानी की जानी चाहिए कि कई कारकों, तथापि, वहाँ रहे हैं. वेरो कोशिकाओं का उचित रखरखाव एक सफल वायरल बचाव के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अतिरिक्त, यह पुनः संयोजक arenavirus (उचित सेल रखरखाव और प्लाज्मिड तैयारी के लिए प्रोटोकॉल देखें) उत्पन्न करने के लिए अच्छा प्लाज्मिड तैयारी है अनिवार्य है. RLCMV और rCandi के बचाव के लिएघ # 1 जंगली प्रकार या वेरो कोशिकाओं को आसानी से 14 ट्रांसफ़ेक्ट नहीं कर रहे हैं, क्योंकि यह एक सफल बचाव की संभावना बढ़ाने के लिए प्रत्येक पुनः संयोजक वायरस के लिए तीन स्वतंत्र transfections सिफारिश की है उनके trisegmented संस्करणों. एक से अधिक पुनः संयोजक वायरस बचाव का प्रयास किया जाता है, तो बचाया जा वायरस की संख्या के हिसाब से निम्नलिखित कदम पैमाने. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हम pCAGGS एनपी (pCAGGS एनपी) के अभाव में एक अभिकर्मक शामिल हैं.

LCMV और खरा # 1 से संक्रमित कोशिकाओं क्लासिक कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव (सीपीई), जंगली प्रकार rLCMV के सफल वायरल बचाव और rCandid प्रदर्शित नहीं है # 1 वायरस एक क्लासिक का उपयोग किया जा सकता है, जो संक्रामक संतान, का पता लगाने के माध्यम से मूल्यांकन किया जाना चाहिए पट्टिका परख या आइएफए के माध्यम से. पूर्व बजाय 5 से 24 घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है क्योंकि हम क्लासिक पट्टिका परख अधिक आइएफए के इस्तेमाल की सिफारिश - 6 दिनों सजीले टुकड़े के विकास के लिए आवश्यक है. r3LCMV या r3Candid # 1 (जी दो रिपोर्टर जीन सांकेतिक शब्दों में बचाया जा रहा हैएफपी और gluc), इस प्रकार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (GFP) और / या luminescence (gluc) द्वारा एंटीबॉडी की आवश्यकता के बिना वायरल का पता लगाने और अनुमापन की इजाजत दी. पुनः संयोजक LCMV और खरा # 1 जंगली प्रकार के बचाव के बचाव में के रूप में, एक असफल trisegmented वायरस बचाव ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से टीसीएस के साथ टीका पर फ्लोरोसेंट वेरो कोशिकाओं की कमी का परिणाम देगा.

एस और एल खंडों मानव polyermase मैं प्रमोटर द्वारा संचालित कर रहे हैं, यह देखते हुए कि इस बचाव प्रणाली के अन्य मानव कोशिकाओं में लागू किया जा सकता है. दरअसल हम भी सफलतापूर्वक पुनः संयोजक जंगली प्रकार और trisegmented rLCMV और उच्च दक्षता पर 293T मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं में rCandid # 1 वायरस के दोनों उत्पन्न किया है. इसके अतिरिक्त, सेल monolayers में अभिकर्मक भी निलंबन में वेरो और 293T कोशिकाओं transfecting जब के रूप में कुशल नहीं यद्यपि, वायरस बचाव में हुई. जंगली प्रकार LCMV और # 1 खरा वायरल बचाव का पता लगाने के संबंध में, अन्य वायरल प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी भी इस्तेमाल किया जा सकता है. मेंR3 वायरस के मामले में, हम luminescence के बजाय GFP अभिव्यक्ति द्वारा gluc पता लगा सकता है. वैकल्पिक रूप से, अन्य रिपोर्टर जीन gluc और GFP 5 के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है.

हमारे वायरस बचाव प्रणाली हमारे हाथ में अत्यधिक कुशल साबित हो गया है, और यहाँ हम सबसे अच्छा अभिकर्मक शर्तों प्रदान करते हैं. यह अत्यधिक plasmids के संकेत मात्रा में उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. वायरस बचाव अन्य मानव कोशिका लाइनों, कोशिकाओं की राशि, डीएनए, और / या LPF2000 में किया जाता है, तो परीक्षण किया जाना चाहिए.

वेरो कोशिकाओं में प्लाज्मिड आधारित रिवर्स आनुवंशिकी का उपयोग कर जंगली प्रकार और trisegmented arenavirus की पीढ़ी arenavirus के जीव विज्ञान के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए और साथ ही एफडीए को मंजूरी दी टीके और टीका वैक्टर के भविष्य के विकास के लिए अनुमति देगा.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Materials

Material and methods
Cell lines
Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586).

Plasmids
All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis.

Viruses
The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed.

Tissue culture media and solutions
DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells.

Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections.

10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.

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References

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Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells. J. Vis. Exp. (78), e50662, doi:10.3791/50662 (2013).

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