El tejido adiposo (AT) es un sitio de activación de células inmunes y la interacción intensa. Casi todas las células del sistema inmune están presentes en AT y sus proporciones se alteran por la obesidad. Aislamiento adecuado, cuantificación y caracterización de las poblaciones de células inmunes son fundamentales para la comprensión de su papel en la enfermedad immunometabolic.
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Artículo de método
Aislamiento de tejido adiposo células inmunes
En este artículo
Resumen
Resumen
El descubrimiento de aumento de la infiltración de macrófagos en el tejido adiposo (AT) de los roedores y los seres humanos obesos ha dado lugar a una intensificación de interés en la contribución de células inmunes a la resistencia a la insulina local y sistémica. Aislamiento y cuantificación de diferentes poblaciones de células inmunes en magra y obesos AT es ahora una técnica comúnmente utilizada en los laboratorios immunometabolism; todavía extrema se debe tener cuidado tanto en el aislamiento de células del estroma vascular y en el análisis de citometría de flujo, de modo que los datos obtenidos es fiable e interpretables . En este video se demuestra cómo pica, digerir, y aislar la fracción vascular estromal enriquecida con células inmunes. A continuación, mostramos cómo los macrófagos etiqueta de anticuerpos y los linfocitos T y la forma de la puerta correctamente en los experimentos de citometría de flujo. Se proporcionan flujo representativos parcelas citometría de bajos magras y grasa de alto ratones obesos alimentados con grasa alimentados. Un elemento crítico de este análisis es el uso de anticuerpos que hacenno fluorescencia en los canales donde AT macrófagos son naturalmente autofluorescente, así como el uso de los controles de compensación adecuados.
Introducción
Históricamente, el tejido adiposo (AT) ha sido considerada como un órgano inerte de almacenamiento de lípidos, que se expande y contrae en respuesta al balance energético. Ahora entendemos que AT representa un órgano endocrino que segrega dinámica activamente una serie de hormonas, que influyen directamente en el comportamiento de alimentación y sistémicos homeostasis de la glucosa. Además, durante la última década ha habido un reconocimiento creciente de los numerosos poblaciones de células inmunes residentes en el AT fracción del estroma vascular (SVF), así como su contribución a la homeostasis de AT.
La capacidad de separar la AT adipocitos y SVF usando una colagenasa digestión seguido de centrifugación diferencial fue descrito por primera vez por Rodbell en 1964 1. Colagenasa II es la más utilizada para la separación de los adipocitos y SVF debido al mantenimiento de los receptores de insulina adipocitos 1. Desde el principio, el fraccionamiento enzimático de AT fue empleado principalmente para estudiar AdipoCYTE metabolismo y aislar preadipocitos. Más recientemente, esta técnica, combinada con la disponibilidad generalizada de citómetros de flujo y el cada vez mayor número de anticuerpos conjugados con fluoróforo disponibles comercialmente, ha facilitado la caracterización de AT células inmunes.
Aunque la presencia de células inmunes en inflamado AT había sido descrito previamente 2, los papeles seminales por Weisberg et al. y Xu et al. publicado en 2003 fueron los primeros en documentar la acumulación de macrófagos AT (cajeros automáticos) de la obesidad, que secretan citoquinas inflamatorias y se correlaciona con AT-específica y la resistencia a la insulina sistémica 3,4. Estas observaciones sirven como la base de un nuevo campo de investigación acuñado recientemente, "immunometabolism," 5 y han sido objeto de seguimiento por estudios que implican diversas poblaciones de células inmunes, incluyendo células dendríticas 6, mastocitos, células T 7 8 -10, 11 las células B, células NKT 12, 13, eosinófilos y neutrófilos 14,15 en el desarrollo de la obesidad resistencia a la insulina asociada.
El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción detallada de la técnica de digestión de colagenasa utilizado para aislar las células de la AT SVF y para caracterizar los cajeros automáticos y AT células T a través de citometría de flujo. Este protocolo ha sido optimizado para ratón AT, sin embargo, los espectadores pueden beneficiarse de la lectura de un artículo excelente que proporciona una descripción más detallada en la optimización de esta técnica para el consumo humano a los 16 años. El público objetivo de este artículo incluye investigadores con poca experiencia de trabajo con el ratón AT y la realización de citometría de flujo. Varias consideraciones prácticas para equilibrar el rendimiento y la viabilidad celular con el tiempo y los recursos se presentan, así como controles de citometría de flujo óptimas para la caracterización de las poblaciones de células inmunes. Además de nuestro protocolo, los lectores son referred a un reciente artículo de Jove por Basu et al. para una excelente discusión sobre algunos de los aspectos técnicos de la citometría de flujo para incluir controles adecuados y compensaciones 17.
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Protocolo
1. Reactivos y suministros
Antes de iniciar este protocolo experimental, se preparan los siguientes reactivos:
- Etanol al 70%
- 1X PBS
- 1X DPBS (sin Ca y Mg) suplementado con 0,5% de BSA
- Tampón FACS: 1X DPBS (sin Ca y Mg), 2 mM de EDTA, y 1% de FCS
- Tampón ACK: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, y 0,1 mM Na 2 EDTA en agua
2. Recolección y Preparación de tejido adiposo
- La eutanasia a los ratones de acuerdo con los procedimientos aprobados IACUC específicos de cada institución.
- Mojar bien la piel con etanol al 70%.
- Hacer una incisión a nivel de la apófisis xifoides (parte inferior del esternón) y abrir la cavidad torácica para exponer el corazón, con cuidado de no romper los vasos sanguíneos principales.
Nota: En este punto, también es útil para salir de la membrana intacta tanto comoposible y para cortar una muesca de la parte derecha de la caja torácica para permitir que la sangre y el líquido de perfusión a fluir fuera de la cavidad torácica.
- Clip de la aurícula derecha para permitir que la sangre y el líquido de perfusión para escapar del sistema circulatorio.
Nota: Cuando se trata de ratones obesos, el exceso de pericardio AT puede necesitar ser retirado para permitir el acceso al corazón.
- Sujete el corazón con pinzas e inserte suavemente una aguja en el ventrículo izquierdo a través del ápice. Lentamente perfundir el ratón con 15 ml de PBS estéril.
Nota: Reducir la tasa de perfusión si los pulmones comienzan a llenarse y ampliar.
- Abra la cavidad peritoneal y eliminar las bolsas de grasa perigonadal con cuidado para evitar cualquier tejido gonadal.
- Colocar almohadillas de grasa en un barco pesan en hielo que contiene 2 ml de 1X DPBS (sin Mg o Ca) suplementado con 0,5% de BSA, y pelos en el AT en trozos finos.
Nota: Limite la cantidad de AT por barco pesa 1,2 g. Si la cantidad de AT supera 1,2 g, se divide en partes iguales entre dos barcos pesan.
- Mantenga AT muestras en hielo y preparar 3 ml de solución de digestión colagenasa por AT muestra formada por 1X DPBS complementado con 0,5% de BSA, 10 mM CaCl 2 y 4 mg / ml de colagenasa tipo II.
3. Digestión con colagenasa
- Transferencia de AT a tubos cónicos de 50 ml mediante el vertido de la homogeneizado y enjuagar el barco sopesar con 1 ml de DPBS (0,5% de BSA) y 3 ml de solución de digestión de colagenasa II.
- Incubar a homogeneizado en un agitador rotatorio (200 rpm) a 37 ° C durante 20 min.
- Añadir 10 ml de DPBS (0,5% BSA) para tubos cónicos y colocar en hielo.
- Se tritura homogeneizado numerosas veces usando una pipeta de 10 ml serológica, y pasar las suspensiones celulares a través de filtro de 100 micras para un nuevo tubo cónico de 50 ml.
- Centrifugar la suspensión de células a 500 xg durante 10 min a 4 y dpor ejemplo, C.
- Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células SVF en 3 ml de tampón de lisis ACK de eritrocitos contaminantes.
- Añadir 12 ml de tampón FACS y la suspensión de células se centrifuga a 500 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células SVF en tampón FACS.
Nota: Utilice el tamaño del sedimento celular como una guía para la cantidad de tampón FACS para volver a suspender pulg Si el sedimento celular cubre la parte inferior del tubo de 50 ml cónico, utilizar 0,5-1 ml de tampón FACS, de lo contrario, volver a suspender en 0.25-0.5 ml.
- Colocar las muestras en hielo y se preparan partes alícuotas de la dilución 1:10 de cada muestra para recuento de células mediante la mezcla de 40 l de tampón FACS, 50 l solución de azul de tripano (0,2%), y 10 l de suspensión celular.
- Contar las células viables basándose en la exclusión de azul de tripano y se diluye suspensiones de células a una concentración final de 5-10 x 10 6 células / ml.
4. La tinción de antígenos de superficie celular
- Añadir anti-ratón CD16/CD32 anticuerpo (Fc bloque) a una concentración final de 0,5-1 μg/10 6 células, y se incuba en hielo durante 10 min.
- Muestras de Transferencia (≥ 10 6 células) a 12 tubos de fondo redondo de 75 mm de poliestireno. Preparar tubos separados que si el análisis de las células T y cajeros automáticos, y combinar células adicionales para preparar un número suficiente de tubos para acomodar la compensación requerida y la fluorescencia modificado menos uno (FMO) controles.
Nota: Como un ejemplo, cuando la cuantificación de la proporción de cajeros automáticos basado en F4/80 y CD11b, la siguiente compensación y controles FMO tendrá que ser preparado:
- Unstained (células)
- DAPI o yoduro de propidio (PI) de manchas individuales (células; no agregan tintes viabilidad hasta el paso 5.1)
- F4/80 APC (células o perlas de compensación) individuales mancha
- FITC células individuales o mancha (CD11bcuentas de compensación)
- FMO 1 (células): rata IgG2a κ isotipo de control APC + CD11b FITC + tinte viabilidad (añadido en el paso 5.1)
- FMO 2 (células): F4/80 APC + rata IgG2b κ isotipo de control FITC + tinte de viabilidad (añadido en el paso 5.1)
- Añadir anticuerpos primarios conjugados con fluoróforo y / o controles de isotipo a la concentración apropiada (véase la Tabla de reactivos y materiales).
- Proteger muestras de la luz y se incuba a 4 ° C durante 30 min.
- Añadir 2 ml de tampón FACS y la suspensión de células se centrifuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Se decanta el sobrenadante y resuspender el pellet de células SVF en 2 ml de tampón FACS.
- Centrifugar la suspensión celular 500 xg durante 5 min a 4 ° C, y resuspender el sedimento celular en SVF ≥ 400 l de tampón FACS.
- Transferir las muestras a 12 mm de poliestireno x 75 tubos de fondo redondo equipado con un 35 blusas de tubo colador de células m.
- Proteger de la luz, y las muestras se almacenan a 4 ° C hasta el análisis FACS.
Nota: Para obtener resultados óptimos, las células deben ser analizados Golden Retriever, sin embargo, el análisis FACS con este protocolo se ha realizado con éxito en células marcadas almacenadas en tampón FACS durante 1-2 horas a 4 ° C. Si las células necesitan para ser fijado a aumentar el tiempo de almacenamiento, las células marcadas pueden ser fijadas con paraformaldehído al 2% a 4 ° C durante 24 horas antes del análisis FACS. Empresas anticuerpos sugieren que las células marcadas se pueden almacenar durante hasta una semana, sin embargo, esto no ha sido probado en el marco de este procedimiento.
5. Análisis FACS
- Antes del análisis FACS, añadir colorante viabilidad de las muestras y los controles adecuados para permitir la discriminación de células vivas / muertas.
Nota: Numerosos colorantes de viabilidad están disponibles comercialmente, pero DAPI y PI se recomiendan en función de la prof excitación / emisiónIles de los anticuerpos conjugados con fluoróforo se utilizan. DAPI y yoduro de propidio se añadieron a cada muestra a una concentración final de 0,2 mg / ml.
- Utilice una muestra de control negativo sin teñir, preferiblemente células aisladas a partir del mismo tejido que las muestras experimentales, para ajustar la dispersión lateral (SSC) y la dispersión hacia adelante (FSC) de modo que la población de células (s) de interés están en escala.
Nota: Para el análisis de AT células SVF, se recomienda que la CSS se muestra en una escala logarítmica frente a FSC en una escala lineal. El uso de una escala logarítmica para SSC es especialmente importante en el análisis de los cajeros automáticos, que a menudo son muy grandes y granulares.
- Dibuja una puerta de dispersión de la luz inicial basada en el tipo de célula (s) que se analiza, y ajustar el tubo fotomultiplicador (PMT) de ganancia para que las células no teñidas se encuentran en el extremo izquierdo de un histograma de un solo parámetro (aproximadamente centrado en 10 2) por los cauces adecuados.
Nota: Se recomienda que los linfocitos y los macrófagos (u otras células mieloides) se analizaron por separado debido a las diferencias en la autofluorescencia.
- Utilice los controles de manchas individuales o anticuerpos cuentas de compensación de captura para realizar la compensación de varios colores.
Nota: Se recomienda el uso de cuentas de compensación, sin embargo, se debe garantizar la compatibilidad de cada anticuerpo. Por ejemplo, los granos de compensación pueden no reaccionar de forma cruzada con anticuerpos de conejo, en cuyo caso se requieren células aisladas para obtener un control de mancha única apropiada.
- Establezca puertas experimentales basados en controles FMO modificados.
- Ajuste el citómetro de flujo para recoger la cantidad apropiada de eventos en función de la prevalencia de la población de interés y registrar los datos experimentales.
- Exportar archivos de datos FCS para el análisis fuera de línea. Existen numerosos programas disponibles para cytometr flujoy análisis de datos. Recomendamos Cytobank, una plataforma basada en la web que permite a los investigatores para almacenar y analizar datos y generar datos desde cualquier computadora con acceso a Internet 18. Además, Cytobank ofrece la posibilidad de poner a disposición pública los datos o restringir el acceso a los colaboradores.
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Resultados
Digestión con colagenasa de AT seguido de centrifugación diferencial se utilizó para aislar el SVF de almohadillas de grasa del epidídimo de ratones macho C57BL/6J alimentados con una baja en grasas (10% kcal de la grasa) o alta en grasas (60% kcal de la grasa) dieta (LFD y HFD , respectivamente) durante 16 semanas. Las células de la SVF fueron etiquetados con anticuerpos primarios conjugados con fluoróforo para cuantificar la proporción de cajeros automáticos viables (Figura 1) y AT células T (...
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Discusión
El creciente interés en el papel del sistema inmune en las consecuencias metabólicas de la obesidad ha llevado al uso generalizado de citometría de flujo para caracterizar las células inmunes de la AT. Aunque el protocolo exacto varía entre los laboratorios en base a su propia experiencia y los equipos disponibles, los pasos críticos incluyen la digestión colagenasa, centrifugación diferencial, y la superficie de la célula etiquetado antígeno. El objetivo del presente artículo es proporcionar un protocolo detallado y gu...
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
JSO se apoya en un NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), Alaska con el apoyo de una beca posdoctoral de la Asociación Americana de Diabetes (7-10-MI-05), y AHH se apoya en un American Heart Association Fundada Investigator Award (12EIA8270000). Experimentos de citometría de flujo se realizaron en el Flujo VMC Citometría de recursos compartidos. El VMC Citometría de flujo de recursos compartidos con el apoyo del Centro de Investigación de Enfermedades Digestivas Vanderbilt (DK058404).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DPBS (sin Ca o Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| colagenasa | Sigma | C6885-5G | |
| solución de yoduro de propidio | Sigma | P4864-10 ml | |
| pila estable 20 microlitros | Rainin | SS-L10 | |
| Puntas de filtro de 20 microlitros | Rainin | SRL10F | |
| pila estable Puntas de 250 microlitros | Rainin | SS-L250 | |
| Puntas de 1000 microlitros | Rainin | GPS-L1000 | |
| Puntas de filtro de 1000 microlitros | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 puntas de filtro de microlitros | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn coladores | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| plato de peso mediano | Fisherbrand | 02-202B | |
| papel de aluminio | Fisherbrand | 1213100 | |
| tijeras de picar | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| Tubos cónicos de 50 ml | BD Falcon | 14-959-49A | |
| tapa filtrante Tubos FACS | BD FALCON | 352235 | |
| 10 ml estuche de pipetas 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| tubos de fondo redondo | BD Falcon | 352058 | |
| Jeringa de 5 ml | BD Falcon | 309646 | |
| V Placas Inferiores | Costar | 07-200-107 | |
| pipeta de bulbo de transferencia | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Agitador | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Estera adhesiva | Thermo Scientific | 1368750 | |
| centrífuga de cultivo celular | Sorvall | 75253839 | |
| Adaptadores Sorvall | 75003723 | ||
| Rata antiratón CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentración: 0,5 - 1 μ g/ 106 células |
| Rata anti-ratón F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Conjugado con fluoróforo: APC Concentración: 0,2 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: 17-4321 |
| Rata anti-ratón CD11b | eBioscience | 11-0112 | Conjugado fluoróforo: FITC Concentración: 0,5 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: 1/11/4031 |
| Hámster Armenio anti-ratón CD11c | eBioscience | 12-0114 | Conjugado de fluoróforo: PE Concentración: 0,8 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: Dic-88 |
| Cabra anti-ratón MGL1/2 | R& D Systems | FAB4297P | Conjugado de fluoróforo: PE Concentración: 0,1 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: IC108P |
| Cabra anti-ratón CD206 | R& D Systems | FAB2535P | Conjugado de fluoróforo: PE Concentración: 0,1 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: IC108P |
| Rata anti-ratón CCR2 | R& D Systems | FAB5538P | Conjugado de fluoróforo: PE Concentración: 0,1 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: IC013P |
| Hámster Armenio anti-ratón TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Conjugado de fluoróforo: APC Concentración: 0,2 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: |
| 553956 Rata anti-ratón CD8a BD | Biosciences | 552877 | Conjugado de fluoróforo: PE-Cy7 Concentración: 0,8 μ g/ 106 células Número de catálogo de control de isotipo: 552784 |
| Rata anti-ratón CD4 | BD Biosciences | 557956 | Conjugado con fluoróforo: Alexa Fluor 700 Concentración: 0,2 μ g/ 106 celdas Número de catálogo de control de isotipo: 557963 |
Tabla 1. Lista de Materiales y Reactivos. |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
