Yağ dokusu (AT) yoğun bağışıklık hücre aktivasyonu ve etkileşim bir sitedir. Bağışıklık sisteminin hemen hemen tüm hücreleri AT mevcut olan oranını obezite etkilenir. Bağışıklık hücre popülasyonlarının AT uygun izolasyon, miktar ve karakterizasyonu immunometabolic hastalık rolleri anlamak için önemlidir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yağ Doku Bağışıklık Hücre İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Obez kemirgenler ve insanların yağ dokusunda artış makrofaj infiltrasyonu (AT) keşfinden lokal ve sistemik insülin direnci ile bağışıklık hücre katkı ilgi yoğunlaşmasına yol açmıştır. Yalın ve obez AT farklı bağışıklık hücre popülasyonlarının izolasyonu ve miktar şimdi immunometabolism laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir tekniktir; henüz çok dikkatli elde edilen verilerin güvenilir ve yorumlanabilir bir şekilde stromal vasküler hücre izolasyonu ve akım sitometri analizi hem alınmalıdır . Bu videoda, kıyma sindirmek ve bağışıklık hücre ile zenginleştirilmiş stromal vasküler kısmını izole nasıl gösterilmektedir. Daha sonra, biz antikor etiket makrofajlar ve T lenfositler ve nasıl akım sitometri deneylerde onlara doğru kapı için nasıl gösterir. Az yağlı beslenen yalın ve yüksek yağ ile beslenen obez fareler Temsilcisi akım sitometri araziler sağlanmaktadır. Bu analizin önemli bir unsuru, mutlaka antikorların kullanımımakrofajlar AT doğal autofluorescent kanallar, hem de uygun tazminat kontrollerin kullanımı floresan değil.
Giriş
Tarihsel olarak, yağ dokusu (AT) enerji dengesi yanıt olarak genişler ve sözleşmeleri lipid depo, bir asal organı olarak incelendi. Şimdi AT aktif doğrudan beslenme davranışları ve sistemik glikoz dengesini etkileyen hormonlar, bir dizi salgılar dinamik bir endokrin organı temsil anlıyorum. Buna ek olarak, son on yıl içinde stromal vasküler fraksiyonu (SVF) yanı sıra, homeostasis katkıları için AT ikamet eden bağışıklık hücrelerinin çok sayıda nüfus için artan bir takdir olmuştur.
Ilk olarak 1964 1'de Rodbell tarafından tanımlanmıştır adiposit ve SVF bir kollajenaz sindirimi kullanma yeteneği ayrı ve ardından diferansiyel s....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Reaktifler ve Malzemeleri
Bundan önce deneysel protokol başlamadan, aşağıdaki reaktifler hazırlamak:
- % 70 etanol
- 1X PBS
- 1X DPBS (Ca ve Mg olmadan),% 0.5 BSA ile takviye edilmiş
- FACS tamponu: 1X DPBS (Ca ve Mg), 2 mM EDTA,% 1 FCS
- ACK tamponu: 150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3 ve su içinde 0.1 mM EDTA Na2
2. Yağ Doku Hasat ve Hazırlık
- Her kurumun özel IACUC onaylı prosedürlere göre fareler Euthanize.
- Iyice% 70 etanol ile kürk ıslak.
- Kılıç şeklinde sürecinin seviyesinde (sternum alt kısmında) bir k....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Diferansiyel santrifüj takip AT kollajenaz sindirim az yağlı (yağ% 10 kcal) veya yüksek yağ (yağ% 60 kcal) diyet (LFD ve YYD beslenen erkek C57BL/6J farelerin epididim yağ yastıkları gelen SVF izole etmek için kullanıldı sırasıyla) 16 hafta boyunca. SVF hücreleri, daha sonra FACS analizi ile uygun bir ATM (Şekil 1) ve T-hücreleri (Şekil 2) oranını ölçmek için bir fluorofor konjuge primer antikorlar ile işaretlenmiştir. Işık yayılımı, çift ayrımcılık ve canlılığı kapıları da dahil olmak .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Obezite metabolik sonuçlara bağışıklık sisteminin rolü artan ilgi AT bağışıklık hücreleri karakterize etmek için flow sitometri yaygın kullanımı yol açmıştır. Tam protokolü kendi deneyim ve ekipmanları mevcut dayalı laboratuarlar arasında farklılık olsa da, kritik adımlar kollajenaz sindirim, diferansiyel santrifüj, ve hücre yüzey antijeni etiketleme içerir. Bu makalenin amacı AT ve / veya akım sitometri performans ile çalışan sınırlı deneyimi ile araştırmacılara SVF AT ve izolasyonu için ayrıntılı bir protokol ve prati.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
JSO bir NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040) tarafından desteklenen, AK Amerikan Diyabet Derneği (7-10-MI-05) bir Doktora Sonrası Araştırma Bursu tarafından desteklenen ve AHH bir Amerikan Kalp Derneği Kurulmuş Araştırmacı Ödülü tarafından desteklenmektedir (12EIA8270000). Akış sistometri deneyleri VMC Sitometrisi paylaşılan kaynak yapılmıştır. VMC Sitometrisi Paylaşılan Kaynak Vanderbilt Sindirim Hastalıkları Araştırma Merkezi (DK058404) tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DPBS (Ca veya Mg yok) 10 x 500 ml | Yaşam Teknolojileri | 14190-250 | |
| DAPI | Yaşam Teknolojileri | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| kollajenaz | Sigma | C6885-5G | |
| propidyum iyodür çözeltisi | Sigma | P4864-10 ml | |
| kararlı yığın 20 mikrolitre | Rainin | SS-L10 | |
| 20 mikrolitre filtre uçları | Rainin | SRL10F | |
| sabit yığın 250 mikrolitre uçlar | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 mikrolitre uçlar | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 mikrolitre filtre uçları | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 mikrolitre filtre uçları | Rainin | SR-L200F | |
| FC Bloğu | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn süzgeçler | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| orta ağırlıkta tabak | Fisherbrand | 02-202B | |
| alüminyum folyo | Fisherbrand | 1213100 | |
| kıyma makası | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml konik tüpler | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filtre üstü FACS tüpleri | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipet kutusu 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| yuvarlak tabanlı tüpler | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml şırınga | BD Falcon | 309646 | |
| V Alt Plakalar | Costar | 07-200-107 | |
| transfer ampul pipeti | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Çalkalayıcı | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Yapışkan mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Hücre Kültürü Santrifüjü | Sorvall | 75253839 | |
| Adaptörleri | Sorvall | 75003723 | |
| Sıçan anti-fare CD16 / CD32 | BD Biosciences | 553142 | Konsantrasyonu: 0.5 - 1 μ g / 106< / sup> hücreleri |
| Sıçan anti-fare F4 / 80 | eBioscience | 17-4801 | Florofor konjugat: APC Konsantrasyon: 0.2 & mu; g / 106< / sup> hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: 17-4321 |
| Sıçan anti-fare CD11b | eBioscience | 11-0112 | Florofor konjugat: FITC Konsantrasyon: 0.5 & mu; g / 106< / sup> hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: 11/1/4031 |
| Ermeni Hamster anti-fare CD11c | eBioscience | 12-0114 | Florofor konjugat: PE Konsantrasyon: 0.8 μ g / 106< / sup> hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: Dec-88 |
| Keçi anti-fare MGL1/2 | R& D Sistemleri | FAB4297P | Florofor konjugat: PE Konsantrasyon: 0.1 & mu; g / 106< / sup> hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: IC108P |
| Keçi anti-fare CD206 | R& D Sistemleri | FAB2535P | Florofor konjugat: PE Konsantrasyon: 0.1 & mu; g / 106< / sup> hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: IC108P |
| Sıçan anti-fare CCR2 | R& D Sistemleri | FAB5538P | Florofor konjugat: PE Konsantrasyon: 0.1 & mu; g/ 106 hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: IC013P |
| Ermeni Hamster anti-fare TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Florofor konjugat: APC Konsantrasyon: 0.2 μ g / 106< / sup> hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: 553956 |
| Sıçan anti-fare CD8a | BD Biosciences | 552877 | Florofor konjugat: PE-Cy7 Konsantrasyon: 0.8 & mu; g / 106< / sup> hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: 552784 |
| Sıçan anti-fare CD4 | BD Biosciences | 557956 | Florofor konjugat: Alexa Fluor 700 Konsantrasyon: 0.2 & mu; g/ 106 hücreleri İzotip kontrol katalog numarası: 557963 |
Tablo 1. Malzemelerin ve Reaktiflerin Listesi. |
Kaynaklar
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-ind....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
