Summary
Se describe un método analítico para estimar la vida útil de glutamato en las membranas de los astrocitos a partir de grabaciones electrofisiológicas de las corrientes de transportador de glutamato en astrocitos.
Abstract
La mayor densidad de transportadores de glutamato en el cerebro se encuentra en astrocitos. Transportadores de glutamato par el movimiento de glutamato a través de la membrana con el co-transporte de Na + y 3 1 H + y el contador-transporte de K + 1. La corriente estequiométrica generada por el proceso de transporte se puede controlar con su conjunto de células patch-clamp grabaciones de astrocitos. El curso temporal de la corriente registrada está conformado por el transcurso de tiempo del perfil de glutamato concentración a la que están expuestos los astrocitos, la cinética de los transportadores de glutamato, y las propiedades electrotonic pasivos de membranas astrocíticos. Aquí se describen los métodos experimentales y analíticos que se pueden utilizar para registrar las corrientes transportador de glutamato en los astrocitos y aislar el curso del tiempo de aclaramiento de glutamato de todos los otros factores que dan forma a la forma de onda de las corrientes transportador astrocíticos. Los métodos descritos aquí pueden ser utilizados para estimar la vida útil of flash uncaged y glutamato liberado sinápticamente en membranas astrocíticos en cualquier región del sistema nervioso central durante la salud y la enfermedad.
Introduction
Los astrocitos son uno de los tipos de células más abundantes en el cerebro con morfología en forma de estrella y salientes de membrana fina que se extienden a lo largo de la neuropilo y llegan a la vecina contactos sináptica 1,2. Membrana celular Los astrocitos está densamente llena de moléculas transportadoras de glutamato 3. En condiciones fisiológicas, los transportadores de glutamato se unen rápidamente glutamato en el lado extracelular de la membrana y lo transfieren al citoplasma de la célula. Al hacerlo, los transportadores mantienen baja la concentración basal de glutamato en el espacio extracelular 4. Transportadores de glutamato en los procesos astrocíticos finas adyacentes a las sinapsis excitatoria están en una posición ideal para unirse glutamato liberado durante los eventos sinápticas como se difunde lejos de la hendidura sináptica. Al hacer esto, los transportadores de glutamato también limitan desbordamiento hacia peri-y extra-regiones sinápticas y en las sinapsis vecinas, la reducción de la propagación espacial de la señal excitadoras en el cerebro 5-7.
Transporte de glutamato es un proceso de electrogénico estequiométricamente acoplado al movimiento de 3 Na + y 1 + H a lo largo de su gradiente electroquímico y para la lucha contra el transporte de K + 8 1. Transporte de glutamato se asocia con (pero no junto estequiométricamente a) la conductancia aniónico permeable a SCN - (tiocianato)> NO 3 - (nitrato) ≈ ClO 4 - (perclorato)> I -> Br -> Cl -> F -, no a CH 3 SO 3 - (metano sulfonato) y C 6 H 11 O 7 - (gluconato) 9-11. Ambas corrientes (estequiométricas y no estequiométricas) se pueden grabar mediante la obtención de patch-clamp grabaciones de células enteras a partir de astrocitos, que se identifican visualmente bajo Dodt iluminación o diferencial de infrarrojos contraste de interferencia (IR-DIC) en acute rodajas de cerebro 12. El componente estequiométrica de la corriente asociada con el transporte de glutamato a través de la membrana se puede aislar mediante el uso de CH 3 SO 3 -, o C 6 H 11 O 7 - intracelulares basados en soluciones y puede ser evocada por el glutamato flash uncaging en astrocitos 13,14, o mediante la activación de la liberación de glutamato de las sinapsis vecinas, ya sea eléctricamente 12 o con un control optogenético específica.
El curso temporal de la componente de la corriente estequiométrica de transportador está formada por el curso de la vida del perfil de la concentración de glutamato en las membranas astrocíticos (por ejemplo, aclaramiento glutamato), la cinética de los transportadores de glutamato, las propiedades de la membrana pasivos de los astrocitos, y durante estimulaciones sinápticas, por la sincronía de la liberación de glutamato en las sinapsis activadas 13. A continuación se describe con todo detalle: (1) una ca experimentaloach para aislar el componente estequiométrica de corrientes de transportador de glutamato de su conjunto de células patch-clamp grabaciones de astrocitos utilizando rodajas de hipocampo de ratón agudos como una preparación experimental ejemplo; (2) un enfoque analítico para derivar el curso del tiempo de aclaramiento de glutamato de estas grabaciones 13, 14. Estos métodos se pueden utilizar para registrar y analizar las corrientes de transportador de glutamato a partir de astrocitos en cualquier región del sistema nervioso central.
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Protocol
1. Preparación Slice
- Preparar 500 ml de solución de corte / de almacenamiento que contiene (en mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 de CaCl 2, 1,3 MgSO4 · 7 H2O, 4 de MgCl 2, 26,2 NaHCO3, 1 NaH 2 PO 4, y 22 de glucosa, 320 mOsm, pH 7,4
- Use un vaso de 250 ml para preparar una cámara de inmersión de los cortes, llénelo con 200 ml de solución de rebanar / almacenamiento, caliente en un baño de agua a 34 ° C y la burbuja con 95% O 2, 5% de CO 2.
- Mantenga la solución restante rebanar / almacenamiento en una botella de vidrio a 4 ° C.
- Utilice un adhesivo de cianoacrilato para fijar un pequeño bloque de agar (6%, preparado en ACSF) en el soporte de la muestra vibratome y almacenar a 4 ° C.
- 30 min antes de comenzar corte, coloque la botella de cristal que contiene la solución de almacenamiento / corte en un cubo lleno de hielo y de la burbuja con 95% O 2, 5% de CO 2.
2. Identificación y grabaciones Astrocyte 3. PharmacAislamiento gico del K + sostenida corriente 4. Yosolation de la parte Facilitado de Corrientes Transporter sinápticamente Activadas (fSTCs) 5. La resta de la K zdustained Residual + corriente de fSTCs 6. Aislamiento de Corrientes Transporter Flash activados (FTC) 7. Análisis de deconvolución
Nota: para obtener las rodajas de la más alta calidad, es importante que las dos partes del cerebro están firmemente pegados a la placa de base vibratomo. Para ello, utilice un adhesivo de cianoacrilato que no es demasiado líquido y que no se seque demasiado rápido.
Nota: si todo está orientado correctamente, el vibratome debería estar cortando rebanadas parasagital de la dorsal hacia la parte ventral y medial de la hacia el lado lateral del cerebro.
Nota: Los astrocitos típicamente tienen una baja resistanc entradae (~ 10 mW), el potencial de membrana en reposo hiperpolarizado (~ -90 mV), y ninguna actividad de tiro. Los astrocitos son mantenidos en su potencial de membrana en reposo durante los experimentos en el modo de fijación de voltaje (es decir, la corriente de mantenimiento debe leer 0 pA). Antes de cada estimulación, una hiperpolarización de 10 ms escalón de tensión (-3 mV) se utiliza para monitorizar la serie y la resistencia de entrada del astrocito. 
Nota: el componente TBOA insensible (es decir, la que se registra en la presencia de TBOA (50 - 100 micras)) representa el K +-sostenida actual. Su evolución en el tiempo es aproximado por la función mono-exponencial descrito anteriormente.
Nota: En las condiciones de grabación se describe aquí (es decir intracelular CH 3 SO 3 - o C 6 H 11 O 7 -), estimulaciones sinápticas de los axones excitatorios generan corrientes de los astrocitos con formas de onda complejas que consisten en un aumento rápido de corriente estequiométrica interna transitoria y una lenta -aumento, sostenido K + hacia el interior de corriente que refleja K + re-equilibrio en el espacio extracelular después de la acción potencial de propagación a lo largo de los axones vecinos. Es crítico para eliminar este K +-sostenida actual, como cualquier corriente residual conduciría a unasobreestimación de vida glutamato.
Nota: recuerde que el análisis descrito en 04.07 a 04.10 se debe realizar en las huellas medios obtenidos en las condiciones de control y en TBOA (10 M).
Nota: en las condiciones de grabación se describe aquí (es decir intracelular CH 3 SO 3 - o C 6 H 11 O 7 -), los estímulos de flash generan corrientes astrocytic consistentes únicamente en el rápido aumento transitorio estequiométrica corriente de entrada.
Nota: el análisis descrito en 6.7 se debe realizar en las huellas medios obtenidos en las condiciones de control y en TBOA (10 mM). 
yque describe mejor la fase de descomposición de la corriente registrada en TBOA transportador (10 M) (Figura 3b).
Nota: la función descrita en 7.2 (es decir, H (t)) representa la evolución en el tiempo del despacho de glutamato a partir de astrocitos en la presencia de TBOA (10 mM).
Nota: deconvolución es una operación matemática incluido en muchos paquetes de software de análisis como (por ejemplo, Matlab, Python). En IgorPro, el código de programación que usamos normalmente para llevar a cabo este tipo de análisis, la operación de deconvolución se puede calcular eficientemente como se describe a continuación, mediante el uso de rápida de Fourier discreto transforma. En primer lugar, utilice la operación FFT para calcular el discrete transformada rápida de Fourier de la función de mono-exponencial obtenido en 7.2 y del ajuste de la corriente transportador registrada en TBOA obtenido en 7.1. A continuación, utilizar la operación de IFFT para calcular la inversa discreta transformada rápida de Fourier de la relación de las dos funciones de FFT. La función I resultante (t) puede ser descrito de la siguiente manera: 
El paso se describe en 7.3 permite derivar el filtro de la corriente en el transportador de TBOA (10 M) (Figura 3c derecha). El filtro representa los factores de distorsión que convierten la vida útil de glutamato en las membranas astrocíticos en la corriente transportador aislado en secciones de 4 - 6 (es decir, el FSTC o FTC).
Nota: este paso permite derivar la evolución en el tiempo del despacho de glutamato a partir de astrocitos en condiciones de control (Figura 3d derecha). La suposición subyacente en este paso deconvolución es que el perfil temporal del filtro se mantiene inalterada en condiciones de control y en TBOA (10 mM).
donde G (t) es la forma de onda obtenida en la etapa 7.1. En la ecuación se ha descrito anteriormente, el término t corresponde a la ventana de tiempo durante el cual se calcula la integral.
Nota: cuando se estableció por primera vez el método,<t> se calculó sobre ventanas de tiempo que se quedaron sin restricciones 13. Este enfoque puede ser utilizado siempre y cuando la ventana de integración se establece para ser mayor que la duración de despacho de glutamato y el aclaramiento se desintegra de forma de onda completamente a la línea base. Si este no es el caso, sin embargo, este método de estimación de <t> se encuentra con algunas limitaciones. Por ejemplo, si la forma de onda aclaramiento no decae exactamente a la línea base, a continuación, <t> aumenta con la anchura de la ventana de integración. Para evitar cualquier posible fuente de inexactitud para la estimación de <t>, que ahora calculamos sobre una ventana de tiempo correspondiente al 10% del pico de la corriente transportador, antes y después de su inicio 14. El último enfoque mejora la consistencia con la que <t> se mide a través de las células. Esto es muy útil sobre todo en el análisis de pequeños efectos de los tratamientos farmacológicos en el curso del tiempo de despacho.
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Representative Results
El éxito del enfoque analítico descrito aquí depende de manera crítica en la obtención de los registros electrofisiológicos de alta calidad de las corrientes de transportador a partir de astrocitos en cualquier región del sistema nervioso central. En cortes de hipocampo agudos ratón, los astrocitos pueden ser fácilmente identificados bajo Dodt iluminación o IR-DIC debido a su cuerpo de células pequeñas (Ø = 10 micras) y núcleo prominente (Figura 1). Su morfología distintiva en forma de estrella se puede apreciar con epifluorescencia, confocal, o de dos fotones microscopía de escaneo láser, cuando la adición de un fluoróforo como Alexa 594 (50 M) a la solución intracelular, (Figura 1). A nivel de electrofisiología, los astrocitos se caracterizan por una baja resistencia de entrada, el potencial de membrana hiperpolarizado (~ -90 mV) y la incapacidad de generar potenciales de acción. Los astrocitos generan corrientes en respuesta a la estimulación eléctrica o optogenético de las neuronas vecinas y fotolisis UV de cacompuestos ged como MNI-L-glutamato.
Corrientes transportadoras astrocíticos se pueden grabar utilizando Cs + o K + soluciones internas basadas. Tenga en cuenta que Cs +, un K + populares sustituto, soporta el transporte de glutamato, pero reduce la velocidad en bicicleta transportador de glutamato 16,17 (por transportadores de glutamato bind y / o trasladar Cs + a través de la membrana más lentamente que K +). Si Cs + reduce significativamente el número de transportadores disponibles para la unión a glutamato, que también conduce a corrientes más pequeñas transportador / más lento que los registrados con K + soluciones internas basadas en 16,17.
Cuando se utiliza CH 3 SO 3 - o C 6 H 11 O 7 - como el principal anión intracelular, la corriente generada por los transportadores de glutamato en los astrocitos es debido al movimiento estequiométricamente-junto de glutamato 1, 3 Na
El actual registrada en astrocitos al evocar liberación sináptica de glutamato tiene una forma de onda más compleja. Se compone de un rápido aumento, componente hacia el interior transitorio debido a la corriente de transportador de glutamato estequiométricamente-acoplado se ha descrito anteriormente. Además, comprende un lento con levadura, K + hacia el interior sostenida de corriente debido a la afluencia de K + acumulado en el espacio extracelular después de potencial de acciónla propagación a lo largo de los axones vecinos. Un enfoque farmacológico se puede utilizar para aislar la corriente de la K +-sostenida actual transportador y requiere el uso de altas concentraciones de la de amplio espectro transportador de glutamato antagonista TBOA (100 mM) al final del experimento 12. El método descrito aquí utiliza un enfoque puramente analítico para aislar la corriente de la K +-sostenida actual y por lo tanto permite más cortos para los experimentos (Figura 2) transportador de glutamato.
Como primer paso, se intercalará estímulos individuales y pares de impulsos sinápticos (100 milisegundos de diferencia), cada 10 a 20 segundos y medio de un número igual de los barridos obtenidos con estímulos individuales y dos a dos pulsos. La amplitud de la primera corriente provocada por los estímulos emparejados debe coincidir con la amplitud de la corriente evocada por el único estímulo. Comenzamos este análisis restando la corriente provocada por el único estímulo de la evocada porlos estímulos emparejados. Esta resta permite el aislamiento de la respuesta al segundo estímulo, que también se compone de un rápido aumento, transitorio de corriente transportador de glutamato y un lento con levadura, K +-corriente sostenida (Figura 2a derecha). A continuación, cambiamos la respuesta al estímulo único por un intervalo de tiempo correspondiente al intervalo entre pulsos de los pares de estímulos, de manera que el tiempo de aparición de la respuesta individual coincide con la hora de inicio de la segunda respuesta aislado anteriormente (Figura 2b ). Restando estas dos corrientes, aislamos la parte facilitado de la corriente transportadora, lo que aquí llamamos FSTC (Figura 2c). La cinética de la FSTC son similares a la cinética de la corriente transportador sinápticamente-activado (STC) aislado farmacológicamente con altas concentraciones del transportador de glutamato antagonista TBOA (100 M) 13. Por esta razón y por la sencillez, en la obra anterior, nos referimos a la FSTCcomo STC 13,14. A pesar de ser corrientes con propiedades similares, fSTCs y STC no son la misma corriente. Por esta razón y por la precisión, en este trabajo, nos referiremos a ellos de forma explícita como fSTCs y STC. El método de sustracción descrito aquí permite el aislamiento exacta de fSTCs en la mayoría de las grabaciones. Sin embargo, en algunos casos, una K +-sostenida residual actual aún está presente. En este caso, es necesario aislar el K +-sostenida actual en experimentos separados utilizando altas concentraciones de TBOA (50 - 100 mM). El curso temporal de la farmacológicamente-aislado K +-sostenida actual puede ser descrita por una función mono-exponencial de la forma:
Mediante el registro de corrientes astrocíticos en diferentes células, se estima el valor medio de Τ aumento. A continuación createa función mono-exponencial como el descrito anteriormente, en el que Τ aumento corresponde al valor promedio de Τ aumento medido experimentalmente en diferentes astrocitos y A corresponde a la amplitud de la K +-residual sostenida corriente que queremos eliminar (Figura 2d ).
El método que acabamos de describir para aislar fSTCs funciona muy bien al evocar la liberación de glutamato de facilitar las sinapsis y también puede ser utilizado para estudiar la liberación de glutamato de las sinapsis que se someten a la depresión dos a dos pulsos. Sin embargo, es de poca utilidad cuando las sinapsis glutamatérgicas en estudio no muestran ninguna forma clara de la facilitación o la depresión a corto plazo. En este caso, el aislamiento de las corrientes farmacológica transportador con altas concentraciones de TBOA (100 mM) sigue siendo la solución más factible para aislar la corriente del transportador de glutamato estequiométricamente-acoplado, sinápticamente-evocado.
(es decir, sin bloquear por completo). El objetivo aquí es reducir la velocidad de manera significativa el curso temporal de la corriente transportadora sin perder la capacidad para distinguirlo del ruido de las grabaciones. La suposición subyacente es que en presencia de una pequeña concentración de TBOA, cuando se disminuye la capacidad de absorción de los astrocitos, el factor principal de la configuración de la decadencia de la corriente transportador es la disminución gradual de la concentración de glutamato en la membrana de los astrocitos 12,18. Nos ajustamos la corriente transportista en las condiciones de control y en TBOA (10 M) con la función multi-exponencial:
(Figura 3a). Nos aproximada la distancia glutamato en TBOA (10 M) con una función de forma instantánea-levantándose con la decadencia mono-exponencial (Figura 3b) y deconvoluir desde la función multi-exponencial que describe el transportador actual en TBOA (10 micras; Figura 3c). La forma de onda resultante es el "filtro", y representa la combinación de factores que distorsionan (es decir, filtro) el perfil de la concentración de glutamato en el transportador actual (Figura 3c). Deconvolving el filtro a partir del ajuste de múltiples exponencial de la corriente en condiciones de control de transportador permite la estimación de la evolución en el tiempo del perfil de la concentración de glutamato en el astrocito registrada en condiciones de control (Figura 3d). Para este análisis de desconvolución, se supone que la cinéticade los filtro permanecen inalteradas en ausencia y en presencia de TBOA (10 mM). Esta es una suposición razonable porque todos los factores que contribuyen a que el filtro (es decir, la cinética de transportador, filtrado de electrotonic, y durante estimulaciones sinápticas, la liberación de glutamato asíncrono través de las sinapsis) son poco probable que sea influenciado por la presencia de TBOA, un compuesto que reduce el número de los transportadores de glutamato disponibles para la unión.
Utilizamos el centroide (<t>) como una medida de la vida útil de glutamato en las membranas astrocíticos en diferentes células. <t> Representa el "centro de masa" de la forma de onda de aclaramiento, y es sensible a los cambios, tanto en el tiempo de subida y la decadencia de la forma de onda de despacho de glutamato. El centroide se expresa como:
e 1 "fo: content-width =" 3 pulgadas "fo: src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50708/50708fig1.jpg "/>
Figura 1. Identificación de los astrocitos en rodajas de hipocampo agudas. (Ab) Imágenes Dodt de astrocitos del hipocampo en CA1 estrato radiado. Bajo Dodt iluminación e IR-DIC, los astrocitos pueden ser identificados por su cuerpo de células pequeñas y núcleo prominente. Las flechas rojas señalan múltiples astrocitos que se pueden identificar en la preparación rebanadas. La flecha amarilla muestra el astrocito que se remienda y se llena con un colorante fluorescente (véase más adelante). (Cd) imagen Dodt sobrepuesto de las rodajas de hipocampo y de dos fotones de los astrocitos remendados, resaltado con una flecha amarilla en el (ab). Para este experimento, los astrocitos fueron parcheados y llenados de un KCH 3 SO 3 - solución interna basada añadido con Alexa 594 (50 M). Los procesos astrocíticos extienden unas pocas decenas de micras de distancia de tque cuerpo celular. Las anotaciones de la izquierda identifican las tres principales capas celulares de la formación CA1 del hipocampo que se puede reconocer en los cortes.
Figura 2. Aislamiento de fSTCs de corrientes transportadoras sinápticamente activados registrados en los astrocitos. (Ac) Esquema de los pasos analíticos necesarios para aislar las fSTCs de las corrientes transportadoras sinápticamente activados registrados en los astrocitos. (D) Enfoque analítico utilizado para eliminar el K + residual sostenida corriente de las fSTCs (ver sección 5). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
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Figura 3. Análisis de deconvolución utilizado para deducir la evolución en el tiempo del despacho de glutamato a partir de astrocitos (a) ajuste mono-exponencial de la FSTC / FTC aislado en condiciones de control (izquierda) y en presencia de TBOA (10 M; derecha).. (B) El curso de tiempo del despacho de glutamato en TBOA (10 mM) es aproximada por una función instantáneamente-el aumento de la caries con mono-exponencial. (C) Deconvolving el curso del tiempo de aclaramiento de glutamato en TBOA (10 M) a partir del ajuste de múltiples exponencial de la corriente en el transportador de TBOA (10 mM) permite estimar el filtro. (D) Deconvolving el filtro a partir del ajuste de múltiples exponencial de la corriente en condiciones de control de transportador permite la estimación de la evolución en el tiempo del despacho de glutamato a partir de astrocitos en condiciones de control.files/ftp_upload/50708/50708fig3large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande la figura.
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Discussion
Aquí se describe un enfoque experimental para obtener los registros electrofisiológicos a partir de astrocitos, un protocolo de análisis para aislar corrientes transportador de glutamato en los astrocitos y un método matemático para derivar el curso del tiempo de aclaramiento de glutamato de las corrientes transportador astrocíticos.
El éxito del análisis se basa en la capacidad de obtener alta calidad patch clamp grabaciones a partir de astrocitos y en la exactitud de los algoritmos de ajuste utilizados para describir las corrientes transportador. El análisis de deconvolución se basa en los siguientes dos supuestos. (1) Los múltiples procesos que distorsionan el curso temporal del despacho de glutamato en la corriente transportador experimental-grabado se puede representar como un sistema lineal. Aunque en términos absolutos, muchos de los factores que las corrientes transportadoras forma son sistemas no lineales (en la unión de glutamato principio y el transporte puede sufrir tanto saturación), la evidencia experimental indicadorestes que su régimen lineal es amplia. En consecuencia, el curso temporal de las corrientes de transportador de glutamato y de aclaramiento sigue siendo el mismo en un amplio rango de la fuerza de estímulo, la probabilidad de liberación, y las concentraciones de glutamato 13,14,18. Aunque esta aproximación parece ser legítimo que nuestras condiciones experimentales, que debe ser validado antes de repetir este análisis en diferentes preparaciones experimentales. (2) Las características del filtro no se ven afectadas por la presencia de TBOA (10 mM). Esta suposición parece razonable debido a todos los factores que contribuyen a que el filtro (es decir, la cinética de transportador, filtrado de electrotonic, y durante estimulaciones sinápticas, la liberación de glutamato asíncrono través de las sinapsis) son poco probable que sea influenciado por la presencia de TBOA.
Mediante la derivación de la forma de onda aclaramiento de glutamato de fSTCs y FTCS, se obtienen dos tipos diferentes de información. Mediante el análisis de fSTCs, medimos el tiempo que astrocymembranas de tics están expuestos a glutamato liberado de las sinapsis. Al evocar FTCs con el campo completo iluminación UV (es decir, por uncaging glutamato sobre toda la superficie de los astrocitos), se mide el tiempo que las membranas astrocíticos están expuestas a glutamato uncaged. En estos experimentos uncaging se liberan todas las moléculas de glutamato (es decir, uncaged) al mismo tiempo y todos los transportadores se activan al mismo tiempo, por la misma concentración de glutamato. Por lo tanto, mediante el análisis de FTC, podemos obtener una lectura indirecta de la capacidad de captación de glutamato astrocitos.
Es importante tener en cuenta que los métodos descritos aquí permiten la estimación de la evolución en el tiempo del despacho de glutamato, no el valor real de la concentración de glutamato que evoca las corrientes transportador. La evolución en el tiempo estimado es de una medida promedio de la evolución en el tiempo del despacho de glutamato en todas las áreas de la membrana de los astrocitos a la que tenemos acceso electrofisiológico: no est sensible a heterogeneidades en la captación de glutamato en diferentes sitios dentro de la membrana de los astrocitos 19. Esta información es más probable que se obtenga con la microscopía de alta resolución de reporteros fluorescentes sensibles al glutamato-20. Sin embargo, los reporteros glutamato sensibles actualmente disponibles presentan rangos dinámicos relativamente estrechos. Esto puede introducir distorsiones no lineales entre el perfil de la concentración de glutamato y la señal fluorescente, lo que limita el uso de estas sondas para extraer la información temporal en la concentración de glutamato transitoria. Por lo tanto, es probable que sea mediante la combinación de todos estos diferentes enfoques que se puede obtener la comprensión más completa de la dinámica de las señales de glutamatérgicas en membranas astrocíticos.
En resumen, los métodos presentados aquí pueden ser utilizados para estimar el curso de tiempo de eliminación de glutamato liberado sinápticamente-o el flash-uncaged en membranas astrocíticos. Proporcionan herramientas valiosas que can ser utilizado para estimar la vida útil de glutamato en el espacio extracelular en diferentes etapas de desarrollo 13 en una variedad de especies de animales 14 y las regiones del cerebro en condiciones fisiológicas y patológicas 21.
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Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Programa de Investigación Intramural Stroke (NS002986). Como escribió el manuscrito y aplicado el análisis de deconvolución. JSD desarrolló la primera versión del análisis de deconvolución y comentarios sobre el texto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
- Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
- Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
- Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
- Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
- Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
- Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
- Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
- Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
- Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
- Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
- Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
- Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
- Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
- Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
- Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).
