Мы описывают получение штрих библиотек ДНК и последующей гибридизации на основе захвата экзона для обнаружения ключевых связанных с раком мутаций в клинических образцах опухолей по массовым параллелизмом секвенирования "следующего поколения". Целевые экзон последовательности предлагает преимущества высокой пропускной способности, низкой стоимости и глубокой покрытия последовательности, что позволит обеспечить высокую чувствительность для обнаружения низкие мутации частот.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение соматических генетических изменений в опухолевых образцов экзоном улавливания и Massively Parallel Секвенирование
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Усилия по выявлению и расследованию ключевые онкогенные мутации оказались ценными для облегчения соответствующее лечение для больных раком. Установление высокой пропускной, массовым параллелизмом последовательности "следующего поколения" помог открытие многих таких мутаций. Для повышения клинической и поступательное полезность этой технологии, платформы должны быть высокой пропускной, экономически эффективной, и совместимо с формалином фиксированной парафин (FFPE) образцы тканей, которые могут дать малое количество деградированных или поврежденной ДНК. Здесь мы описываем подготовку штрих и мультиплексированных библиотек ДНК с последующей гибридизацией на основе захвата целевых экзонов для обнаружения связанных с раком мутаций в свежезамороженных и FFPE опухолей по массовым параллелизмом секвенирования. Этот метод позволяет выявить мутации последовательности, скопируйте номер изменения, и выберите структурные перестройки с участием всех целевых генов. Целевые экзон последовательности предлагает тон приносит пользу высокой пропускной способности, низкой стоимости и глубокой покрытия последовательности, таким образом, присвоении высокой чувствительностью для обнаружения низкие мутации частот.
Введение
Идентификация "водитель" опухолевых генетических событий в ключевых онкогенов и генов-супрессоров опухолей играет существенную роль в диагностике и лечении многих видов рака 1. Крупномасштабные научно-исследовательских работ, использующие массовым параллелизмом последовательности "следующего поколения", позволили выявить многих таких раковых генов, ассоциированных в последние годы 2. Тем не менее, эти платформы секвенирования как правило, требуют больших количеств ДНК, выделенные из свежезамороженных тканей, что создает серьезную проблему, при характеристике и анализа мутаций ДНК из сохранившихся тканей, таких как фиксированные формалином и зали....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. ДНК и подготовке реагентов
Примечание: Этот протокол описывает одновременную обработку и анализ 24 образцов (например, 12 опухолевые / нормальные пары), но могут быть адаптированы для малых и больших партий. Образцы ДНК может происходить от FFPE или свежезамороженной ткани, цитологических образцов, или крови. Как правило, оба опухолевых и нормальных тканей от того же самого пациента будет профилированного вместе, чтобы отличить от соматических мутаций, унаследованных полиморфизмов. Протокол начинается сразу же после извлечения ДНК.
- Аликвоты 50-250 нг (250 нг рекомендуется) из экстрагированной ДНК в пробе, разбавленн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Один бассейн из 24 библиотек штрих последовательности (12 опухолевые-нормальный пар) был взят в плен, используя зонды, соответствующие всем белок-кодирующих экзонов 279 генов рака и секвенировали, как 2 х 75 б.п. читает на одной полосе в проточной ячейке HiSeq 2000 года. Опухолевых и нормальных библиотеки были объединены в соотношении 2:1. Показатели эффективности Образец для бассейна замороженных образцов ДНК опухолевых показаны на рисунке 1, в том числе скорости выравнивания, распределения по размерам.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наша ВЛИЯНИЕ анализ производит высокую скорость выравнивания, высокую ставку по-цели, высокую целевую охват и высокую чувствительность для обнаружения мутаций, вставкам и скопировать номер изменения. Мы продемонстрировали способность нашего IMPACT анализе для последовательности ДНК из обоих свежемороженая и архивируются образцы FFPE низкого входа ДНК. Выполняя целевой экзона последовательности ключевых раковых генов, ассоциированных с, можно добиться очень глубокий охват последовательности для экзонов этих наиболее важн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Доктор Бергер получил консультационные услуги и финансирование научных исследований из Фонда медицины, диагностики рака компании.
Благодарности
Мы благодарим доктора Агнес Виале и центральной лаборатории MSKCC геномики для технической помощи. Этот протокол был разработан при поддержке Бин онкологический научный центр Джеффри и Фермер Семейства.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| NEBNext Модуль для ремонта торцевых систем | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-хвостовой модуль | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Модуль быстрой лигации | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex Штрих-коды без ПЦР – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| Комплект для усиления HiFi-библиотеки | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| ДНК человека COT, флуориметрический сорт | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Набор для гибридизации и стирки | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| Библиотечные приманки SeqCap EZ | Roche NimbleGen | ||
| Набор для очистки ПЦР QIAquick | Qiagen | 28104 | |
| Набор для анализа дцДНК Qubit dsDNA Broad Range (BR) | Life Technologies | Q32850 | |
| Набор для высокочувствительного анализа дцДНК Qubit Life | Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Биоанализатор Agilent 2100 | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Магнитная подставка-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
Ссылки
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
