Экзонуклеазы играют важнейшую роль в обеспечении стабильности генома. Потеря функции экзонуклеазы WRN приводит к преждевременному старению. Изучение субстратов и других требований нуклеазы in vitro может помочь выяснить ее роль in vivo. Здесь мы демонстрируем быстрый и воспроизводимый флуоресцентный анализ для измерения его нуклеазной активности.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Флуоресцентный экзонуклеазный анализ для характеристики dmWRNexo, ортолога прогероида человеческого WRN экзонуклеазы, и его применения к другим нуклеазам
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
WRN экзонуклеаза участвует в устранении повреждений ДНК, которые происходят либо во время репликации ДНК, либо после воздействия эндогенных или экзогенных генотоксинов. Вероятно, он играет роль в предотвращении накопления рекомбиногенных промежуточных продуктов, которые в противном случае накапливались бы на временно остановленных репликационных вилках, что согласуется с гиперрекомбинантным фенотипом клеток, лишенных WRN. У человека экзонуклеазный домен содержит N-концевую часть гораздо более крупного белка, который также обладает геликазной активностью, вместе с дополнительными сайтами, важными для взаимодействия ДНК и белка. Напротив, у дрозофил экзонуклеазная активность WRN (DmWRNexo) кодируется отличным генетическим локусом от предполагаемой геликазы, что позволяет биохимически (и генетически) анализировать роль экзонуклеазной активности в механизмах стабильности генома. В данной работе мы демонстрируем флуоресцентный метод определения активности экзонуклеазы WRN с использованием очищенного рекомбинантного DmWRNexo и флуоресцентных олигонуклеотидов, меченных на концах. Эта система обеспечивает большую воспроизводимость по сравнению с радиоактивными анализами, поскольку олигонуклеотиды субстрата остаются стабильными в течение нескольких месяцев, и обеспечивает более безопасный и относительно быстрый метод для детального анализа активности нуклеазы, позволяя определить полярность нуклеазы, процессивность и предпочтения субстрата.
Введение
Нуклеазы играют жизненно важную роль в клетках в удалении поврежденной ДНК, разрешении недуплексных структур, таких как соединения Холлидея, и обеспечении способности к корректуре во время репликации ДНК, как присущих ДНК-полимеразам, так и внешних по отношению к ним1. Нуклеазы могут действовать либо путем последовательного разложения ДНК со свободных концов (экзонуклеазы), либо путем расщепления внутренних фосфодиэфирных связей в более длинной молекуле ДНК (эндонуклеазы). Потеря нуклеазной активности может привести к высокоспецифичным фенотипам нестабильности генома. В то время как мутация члена семейства хеликаз RecQ BLM приводит к чрезмерно высокой скоро....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Получение субстратных олигонуклеотидов
- Синтезируйте пользовательские олигонуклеотиды.
- Спроектируйте один одноцепочечный олигонуклеотид с 5'-конъюгированной молекулой флуоресцеина; это будет основой для каждого субстрата. (Обратите внимание, что это относится к 3'-5' экзонуклеазе; для экзонуклеазы 5'-3' полярности используйте 3'-конъюгированную основную цепь). Если полярность неизвестна, следует проверить как 3', так и 5'.
- Сконструируйте комплементарные цепи таким образом, чтобы при отжиге до флуоресцентно меченного олигонуклеотида образовывались дуплексные субстраты по выбору. Обратите внимание, что комплементарная цепь н....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Проведение анализа экзонуклеазной активности in vitro требует ряда подготовительных этапов в дополнение к самому анализу. Обзор процедур представлен на Рисунке 1.
Перед проведением анализов экзонуклеазной активности на основе флуоресценции крайне важно оптимизировать детектирование флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного субстрата после разделения на мочевин-акриламидных гелях с использованием подходящей системы флуоресцентной визуализации. Выбор фильтра имеет решаю.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Определение экзонуклеазной активности очищенных белков требует анализа продуктов расщепления ДНК. Последовательное расщепление ДНК экзонуклеазами может быть визуализировано путем разделения меченых продуктов расщепления на акриламидных гелях. Исторически сложилось так, что это включало в себя мечение субстрата ДНК радиоактивной меткой (например, 32P или 35S), но с недостатками, присущими использованию радиоактивной метки (стоимость, проблемы с безопасностью и нестабильность с течением време.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим межсоветскую программу "Новая динамика старения" за финансирование этой работы [ES/G037086/1] и профессора Дэйва Шерратта (факультет биохимии, Оксфордский университет) за доступ к Fuji FLA-3000.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Reagent/Material | |||
| Custom oligonucleotides | Eurogentec | Необходимо получить их высокой чистоты например с очисткой PAGE. | |
| 5'FLO | флуоресцеин-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble | ||
| 5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40 | |||
| % 19:1 Раствор акриламида | Severn Biotech | 20-2400-05 | ВНИМАНИЕ: сильнодействующий нейротоксин, поэтому перчатки следует носить постоянно. |
| His-Trap колонки (1 мл) | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| Все остальные реактивы | любого уважаемого поставщика | Необходим класс молекулярной биологии (без ДНКазы); микрофуговые пробирки также должны быть без ДНКазы и РНКазы | |
| EquipmentHoefer SE400 гелевый аппарат Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (люминофор и флуоресценция | |||
| imager) | Fuji | ||
| Image Reader V2.02 | FujiFilm | ||
| Image Gauge V3.3 | FujiFilm | ||
Ссылки
- Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).
- Payne, M., Hickson, I. D. Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndro....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
