Live-Cell-Imaging von alphaherpes Virusinfektionen ermöglicht die Analyse der dynamischen Ereignisse gerichteten Transport und interzelluläre Ausbreitung. Hier präsentieren wir Methoden, die rekombinanten viralen Stämmen, fluoreszierende Fusionsproteine Visualisierung der viralen Baugruppen während der Infektion von primären Neuronen erleichtern nutzen.
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Methodenartikel
Live Cell Imaging von Alphaherpes Virus Anterograde Transport und Aufstrich
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Advances in lebenden Zellen Fluoreszenzmikroskopie Techniken, sowie die Konstruktion von rekombinanten Virusstämme, die fluoreszierende Fusionsproteine exprimieren haben Echtzeit-Visualisierung von Transport und die Ausbreitung von alphaherpes Virusinfektion von Neuronen aktiviert. Der Nutzen der neuen fluoreszierenden Fusionsproteine Virusmembran, Spelzen und Kapside in Verbindung mit Live Cell Imaging, identifiziert Viruspartikel Baugruppen unterziehen Transport innerhalb Axone. Ähnliche Instrumente wurden erfolgreich für die Analyse von Zell-Zell von Viruspartikeln verbreitet, um die Anzahl und die Vielfalt der Virionen zwischen Zellen übertragen quantifizieren beschäftigt. Wichtig ist, produzieren die Techniken des Live Cell Imaging der anterograde Transport und Ausbreitung eine Fülle von Informationen, einschließlich Partikeltransport Geschwindigkeiten, Verteilungen von Partikeln und zeitliche Analysen von Protein-Lokalisierung. Neben den klassischen viralen genetischen Techniken haben diese Methoden kritische Einblicke bereitgestelltin wichtige mechanistische Fragen. In diesem Artikel beschreiben wir im Detail die bildgebenden Verfahren, die entwickelt, um grundlegende Fragen der alphaherpes Virus Transport und Ausbreitung zu beantworten waren.
Einleitung
Infektion des peripheren Nervensystems (PNS) durch alphaherpes Viren wie Herpes-simplex-Virus (HSV) -1, -2 und Pseudorabies-Virus (PRV) umfasst mehrere komplizierte und stark regulierten Schritte gesamten Lebenszyklus des Virus. Transport innerhalb der Neuronen des PNS ist kritisch während der Ereignisse der beiden primären Virusinfektion und anschließende inter-Host Verbreitung. Die molekularen Mechanismen, die beiden Komponenten des viralen Lebenszyklus modulieren; gerichteten Transport von viralen Baugruppen vom Zellkörper in Axonen (anterograde Transport) und die anschließende Übertragung der Virionen auf empfängliche Zellen (anterograde Spread) sind wichtig, um ....
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Protokoll
Abschnitt 1 - Environmental Control Bedingungen für die Live-Zelle Fluoreszenzmikroskopie
- 30 min vor jeder Imaging Experiment anschließen und beginnen Erwärmung des Mikroskops top Inkubator.
- Schalten Sie Mikroskop, Durchlicht und epifluoreszenten Lichtquellen und automatisierte Hardware-Bedienelemente. Öffnen Sie die Mikroskop-Software, NIS Elements, um das Mikroskop anschließen und beginnen Abkühlen der EM-CCD-Kamera.
- Bringen Objektiv wärmer entsprechende Ziel (entweder 60X oder 100X Öl-Immersion). Hinweis: Wählen Sie Objektivlinse auf Experiment Typ. Die 100X Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) ist am besten für di....
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Ergebnisse
Anterograde Transport
Anwendung dieses Protokolls, um Infektionen von dissoziierten SCG Kulturen mit PRV 348 hat ein rekombinantes PRV-Stamm, die GFP-US9 und GM-mCherry Membranfusionsproteine, die Visualisierung der anterograde Transport von Virionen (Abbildung 3 und Supplemental Movie 4) erleichtert. Incorporation dieser Fusionsproteine in virale Partikel zu deren Erkennung auf den Transport puncta und den genannten bildgebenden Bedingungen minimieren die je.......
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Diskussion
Das Ziel des Live Cell Imaging beobachtet biologische Prozesse, wie sie ohne signifikante Veränderung durch den Akt der Beobachtung auftreten. Umwelt-Kontrolle, die Geschwindigkeit der Bildgebung und Fluoreszenz-Beleuchtung: Dieses Ziel wird durch die Optimierung der drei Variablen erreicht. Diese inter-abhängigen Variablen müssen ausgeglichen werden, um tragfähige Abbildungsbedingungen erreichen. Die Protokolle vorgestellt nutzen spezifischen Bedingungen, die repräsentative Ergebnisse zu produzieren. Wir werden kurz au.......
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
LWE und RK werden von der US National Institutes of Health Zuschüsse R37 NS033506-16 und R01-03 NS060699 unterstützt. MPT wurde von einem American Cancer Society Postdoctoral Research Fellowship (PF-10-057-01-MPC) unterstützt. Die Beratung und das Wissen von Dr. Matthew Lyman und Dr. Oren Kobiler waren maßgeblich an der Gestaltung des Mikroskops Konfiguration und Live Cell Imaging Verfahren. Wir verlängern auch dank Neal Barlow und Brian T. Kain von Nikon Instruments für ihre technische Unterstützung bei der Anschaffung, Installation und Performance des Mikroskops.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 35 mm Kulturschale mit Glasboden, | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C | |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 | |
| Mikroskopgehäuse | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti | |
| Motorisiertes Mikroskop X-Y-Tisch | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top | |
| Motorisierte Filterräder | Prior Scientific | HF110 10-Positionen-Filterrad | |
| Leuchtstoffröhrenbeleuchtung | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario, Kanada | X-Cite 120Q | |
| Multiband-Fluoreszenzfilter-Sets | , Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET | |
| EM-CCD Kamera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 | |
| Chamlide Stage Top Umwelt-Inkubator | Live Cell Instruments; Seoul, Südkorea | TC-L-10 | |
| Objektivheizung | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 | |
| Software zur Heizungsanalyse | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
Referenzen
- Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
- Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology.
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Nachdrucke und Genehmigungen
