Summary
Se presenta el procedimiento para montar un ensayo de la ropa de cama cubierta de la semilla (SCBA) a partir de semillas de Arabidopsis thaliana. El SCBA ha demostrado ser una herramienta poderosa para explorar genéticamente in vitro y la forma en la germinación de los controles del endospermo de semillas de semillas latentes y en respuesta a las señales de luz. El SCBA es, en principio, aplicable en virtud de cualquier situación en la que se sospecha que el endospermo de influir en el crecimiento embrionario.
Abstract
El endospermo de Arabidopsis consta de una sola capa de células que rodea el embrión maduro y que juega un papel esencial para prevenir la germinación de semillas latentes o que de semillas nondormant irradiados por un pulso de luz roja lejana (FR). Con el fin de obtener una mayor comprensión de los mecanismos genéticos moleculares que subyacen a la actividad represiva de germinación ejercida por el endospermo, se ideó un ensayo de "ropa de cama cubierta de la semilla" (SCBA). El SCBA es un procedimiento de disección separar físicamente las cubiertas seminales y embriones de las semillas, que permite monitorizar el crecimiento de los embriones sobre una capa subyacente de cubiertas de las semillas. Sorprendentemente, el ERA reconstituye las actividades de represión de germinación de la cubierta de la semilla en el contexto de la latencia de las semillas y el control FR-dependiente de la germinación de la semilla. Desde la SCBA permite el uso combinatorio de cubierta de la semilla latente, nondormant y modificada genéticamente y los materiales embrionarias, las vías genéticas que controlan la germinación y específicamente operating en el endospermo y el embrión puede ser diseccionado. Aquí detallamos el procedimiento para ensamblar un SCBA.
Introduction
En semillas maduras de Arabidopsis, la cubierta de la semilla se compone de la testa, una capa externa de tejido muerto de origen materno, y el endospermo, una sola capa de células de tejido vivo que rodea directamente el embrión 1. El endospermo y el embrión se derivan de acontecimientos de fertilización separados: el endospermo es un tejido triploide con dos materna y uno genoma paterno mientras que el embrión es un tejido diploide con uno materna y uno genoma paterno 2.
La función principal tradicionalmente asignado al endospermo es la de un tejido nutritivo. Sin embargo, cada vez es más evidente que el endospermo también juega un papel central para el control de la germinación de semillas. Esta idea se convirtió en la primera patente en el caso de inactividad, un rasgo exhibido por semillas de nueva producción. Las semillas en dormancia no germinan a pesar de la presencia de condiciones de germinación favorables. Las semillas pierden su letargo después de un período de maduración y se convierten en nondormant, es decir que van a germinar cuando se expone a condiciones de germinación favorables. En muchas especies de plantas, incluyendo la planta modelo Arabidopsis, la cubierta de la semilla es absolutamente necesaria para evitar la germinación de las semillas latentes desde la extracción cubierta de la semilla desencadena el crecimiento embrionario y la ecologización de 3,4. En Arabidopsis, Bethke et al. Observó que la germinación se mantuvo reprimida después de la eliminación de la testa, manteniendo el endospermo que rodea el endospermo 5. Estas observaciones indican fuertemente que el endospermo es el tejido dentro de la cubierta de la semilla ejerciendo una actividad represiva en el embrión. Sin embargo, los experimentos de remoción de semillas capa no necesariamente ayudan a aclarar la naturaleza de la actividad represiva de germinación proporcionada por la cubierta de la semilla, ni la identificación de los genes que lo implementan.
Recientemente hemos introducido un ensayo de la ropa de cama cubierta de la semilla (SCBA) en caso de cubiertas de las semillas y embriones están físicamente separados pero mantienen en estrecha proximidad de modo que la actividad represiva de germinación proporcionado por el endospermo se mantiene 6. El SCBA permite el uso combinatorio de cubierta de la semilla latente, nondormant y modificada genéticamente y los materiales embrionarias. Como resultado, las vías genéticas que controlan la germinación y operar específicamente en el endospermo y el embrión pueden ser diseccionados. El SCBA se utiliza en el contexto de la latencia para mostrar que el endospermo libera la fitohormona ácido abscísico (ABA) hacia el embrión a reprimir su crecimiento 6. Además podemos usar el SCBA para identificar las vías de señalización que actúan en el endospermo y tejidos embrionarios para promover la latencia.
El papel del endospermo para controlar la germinación se fortaleció aún más al considerar el caso de las semillas nondormant expuestas a un pulso de rojo lejano (FR) de luz. Temprano en imbibición de la semilla se conoce un pulso de luz FR para inhibir la germinación de 7,8. Cuando cubiertas de las semillas se extrajeron a partir de semillas de un pulso de luz FRfue incapaz de inhibir la germinación, lo que sugiere fuertemente que el endosperma también puede reprimir la germinación de semillas nondormant 9. Sorprendentemente, el ERA también se podría utilizar para recapitular la inhibición FR-dependiente de la germinación. Esto permitió demostrar que la inhibición que FR-dependiente de la germinación de la semilla es también un proceso que implica la liberación de ABA del endospermo 9. Además, el SCBA permitió identificar las diferentes vías de señalización luminosa que funciona en el endospermo y el embrión para controlar la germinación de semillas nondormant en respuesta a señales de luz de 9,10.
Por consiguiente, el SCBA parece ser una técnica fiable para explorar la función del endospermo en el contexto del control de la germinación de la semilla. También es una herramienta poderosa para evaluar in vitro si los genes sospechosos para controlar la germinación operan en el endospermo, el embrión o ambos tejidos. A continuación te detallamos los distintos pasos necesarios para montar un SCBA.
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Protocol
Una vez que el SCBA se ensambla, el crecimiento de los embriones se monitoriza durante varios días. Por lo tanto, antes de que el procedimiento de disección de semillas y el montaje de la SCBA, hay que esterilizar las semillas para evitar contaminaciones futuras que podrían impedir la correcta valoración del efecto del material de cubierta de la semilla en el crecimiento embrionario.
1. Esterilización de semillas
- Vierta 50-60 l de semillas de Arabidopsis maduras y secas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y preparar una solución de etanol al 70%.
- Añadir 1 ml de solución de etanol al 70% al tubo de microcentrífuga que contiene las semillas y agitar a temperatura ambiente durante 10 min a 1200 rpm en un agitador de vórtice.
- Tubo de microcentrífuga Centrifugar durante 3 segundos a 4000 xg para concentrarse semillas en la parte inferior del tubo.
- Aspirar la solución de etanol al 70% utilizando una punta de succión de vacío dejando cuidadosamente las semillas en la parte inferior del tubo de microcentrífuga.
- Añadir 1 ml de agua destilada estéril para t él tubo de microcentrífuga que contiene todavía las semillas.
- Agitar a temperatura ambiente durante 10 min a 1200 rpm.
- Tubo de microcentrífuga Centrifugar durante 3 segundos a 4000 xg para concentrarse semillas en la parte inferior del tubo. Aspirar el sobrenadante de agua usando una punta de succión de vacío dejando cuidadosamente las semillas en la parte inferior del tubo.
- Añadir 1 ml de agua estéril agua destilada al tubo de microcentrífuga que contiene todavía las semillas. Asegúrese de que el flujo de agua suspende homogéneamente las semillas en el interior del tubo. El objetivo aquí es evitar una mayor agitación a fin de preservar la integridad de las semillas.
- Deje que las semillas se depositan por gravedad en la parte inferior del tubo por el que sale del tubo inmóvil durante 30 seg. Aspirar el sobrenadante de agua usando una punta de succión de vacío dejando cuidadosamente las semillas en la parte inferior del tubo.
- Repita cuatro veces los pasos 1.8 a 1.9. En general, el procedimiento de esterilización dura alrededor de 30 min.
2. Semilla Plating
ontenido "> Todas las etapas subsiguientes se llevan a cabo dentro de una cabina de flujo laminar para preservar condiciones estériles.- Preparar una placa de placa de Petri (100 mm de diámetro, 20 mm de altura) que contiene 30 ml de medio de germinación preparado por tratamiento en autoclave de una solución que contiene 4,3 g / l de Murashige y Skoog en 2,5 mM de 2 - (N-morfolino) etanosulfónico (MES-KOH , pH 5,7) y 0,8 g / l de agar. Deje que la solución se enfríe en un baño de agua a 50 ° C antes de verterla en la placa de placa de Petri.
- Añadir 200 l de agua destilada estéril al tubo que contiene las semillas. Resuspender las semillas y transferirlos sobre la superficie del medio de germinación utilizando una pipeta estándar con una punta de 1 ml.
- Eliminar el agua que rodea las semillas en la superficie del medio de germinación utilizando una punta de succión de vacío.
- Deje la placa de Petri que contiene las semillas sin su tapa interior de la cabina de flujo laminar durante 2 horas para su posterior secado. Cierre la caja de Petri con la tapa y se deja reposar bajo el laminarCabina de flujo durante unos 90 min de manera que han pasado cerca de 4 horas desde el inicio del procedimiento de esterilización de semillas (paso 1.2).
3. Disección de Semillas
Los siguientes pasos requieren trabajar con un estereomicroscopio colocado en el interior del gabinete de la campana de flujo laminar. Un fórceps Dumont # 5 con truncadas (es decir, romo) consejos facilita en gran medida el manejo de las semillas (Figura 1A).
- Prepare una nueva placa de placa de Petri que contiene 30 ml de medio de germinación. Coloque sobre la superficie de las dos medianas papeles rectangulares yuxtapuestas estériles Whatman 3MM (1,5 cm x 1,0 cm; Figura 1B, paso 1). Whatman 3MM de papel se esteriliza en un autoclave.
- Traslado semillas en los papeles Whatman 3MM utilizando pinzas estériles (Figura 1B, paso 2).
- Celebrar una semilla individual contra el papel Whatman 3MM presionando suavemente la semilla utilizando las puntas romas yuxtapuestas de las pinzas truncadas (
- Cortar la cubierta de la semilla (testa y el endospermo) de la semilla usando una aguja de jeringa (por ejemplo, insulina U100 + jeringa jeringa de 1 ml, 0,33 mm (29 G) x 12,7 mm) (Figura 1B, etapa 4). La forma de las semillas de Arabidopsis es elipsoidal y se recomienda cortar la cubierta de la semilla a lo largo de los semi-eje principal más largas lo más cerca posible del lugar donde los cotiledones se unen a la radícula (es decir, lejos de la punta radical). Esto ayuda a la liberación segura del embrión en el siguiente paso del procedimiento de disección.
- Empuje la semilla contra el papel Whatman 3MM usando las puntas romas yuxtapuestas de las pinzas truncado (Figura 1B, paso 5). Este paso libera el embrión a cabo la cubierta de la semilla a través de la abertura creada en el paso 3.4 (Figura 1B, paso 6). Se recomienda aplicar el empuje sobre la semilla donde la punta de los cotiledones son en más cercana a la punta de la radícula (es decir, alejado FRom la apertura).
4. Asamblea de la cubierta de la semilla de cama Assay (SCBA)
Véase el análisis de la adecuada elección de la cantidad de cubiertas de las semillas y embriones.
- Prepare una nueva placa de placa de Petri que contiene 30 ml de medio de germinación. Lugar en la superficie del medio de una pieza rectangular estéril (3,5 cm x 5,0 cm) de malla de nylon (Figura 2, paso 1).
- Para evitar daños, embriones y cubiertas de las semillas se pueden mover a la superficie de los bordes metálicos de la pinza empujando suavemente usando la aguja de la jeringa (figura 2, paso 2). Embriones de transferencia y las cubiertas de las semillas en la malla de nylon (figura 2, paso 3).
- Montar una capa circular y única de cubiertas de las semillas utilizando las pinzas romas y la aguja asegurándose de que revestimientos de semillas están en la proximidad como mucho más cerca posible (figura 2, paso 4). Trate de exponer tanto como sea posible la apertura cubierta de la semilla generada por elaguja hacia arriba. Este paso no fue probado sistemáticamente. Sin embargo, se podría aumentar la eficiencia de la SCBA ya que se espera sustancias difusibles que inhiben el crecimiento del embrión para difundir directamente hacia el embrión en lugar de fuera de ella.
- Coloque los embriones como una capa única circular en el centro de la cama cubierta de la semilla montado en el paso 4.3 (Figura 2, paso 5). Asegúrese de que los embriones se encuentran en la proximidad como mucho más cerca posible.
- Incubar los SCBAs bajo luz continua (40 mmol / m 2 s ec) a 20-21 ° C. En el caso en que se utiliza un pulso de FR para detener la germinación, ensamble el SCBA con la luz normal, aplique el pulso FR como se describe 9 y dejar placa de Petri en la oscuridad.
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Representative Results
El trabajo previo mostró que las semillas mutantes incapaces de sintetizar GA fueron incapaces de germinar como resultado de la acumulación de ABA alta en las semillas 11,12. Sin embargo, la incapacidad para germinar requiere la cubierta de la semilla desde su extracción provoca embrionario 13 crecimiento. Esto indica claramente que el endospermo de semillas que no pueden sintetizar GA es la liberación de ABA para bloquear el crecimiento embrionario. Por tanto, esperamos revestimientos de semillas incapaces de sintetizar GA para bloquear el crecimiento de los embriones en un SCBA a diferencia de cubiertas de las semillas incapaces de sintetizar GA y ABA. Aquí usamos ga1-21 (línea de inserción Salk Salk_109115) semillas mutantes que llevan una inserción de T-ADN disrupción del gen GA1 (adhesión AT4G02780) que codifica ent-copalyl difosfato sintasa que es esencial para la biosíntesis de GA 14 (SALK_109115 línea de inserción en GA1 (Col ecotipo) se posiciona en la base de datos SALK señal de 15 ( http://signal.salk. Edu /).
En consonancia con los resultados previos 13, ga1-21 semillas mutantes no podían germinar 80 horas después de la imbibición de la semilla (Figura 3, panel 1). En contraste y más coherente con los resultados previos 13, la eliminación cubierta de la semilla activa GA1-21 el crecimiento del embrión (Figura 3, panel 2) a menos de ABA estaba presente en el medio (Figura 3, panel 3).
Grupo 4 en la figura 3 fue tomada 80 horas después de la imbibición de la semilla y le muestra SCBA con ga1-21 embriones en una cama de 80 ga1-21 cubiertas de las semillas. De acuerdo con nuestra hipótesis, ga1-21 cubiertas de las semillas mutantes bloquearon el crecimiento de ga1-21 embriones.
El trabajo previo mostró que en semillas latentes la cubierta de la semilla sintetiza y libera ABA hacia el embrión como un resultado de la expresión constitutiva del factor de DELLA RGL2 GA-respuesta, que promueve la acumulación de ABA en embebidasemillas 6,11. En las condiciones que se bloquea la síntesis de GA el factor RGL2 DELLA constitutivamente acumula y promueve la acumulación de ABA 11. Por lo tanto, se espera que la ausencia de RGL2 y síntesis de ABA en ga1-21 cubiertas de las semillas para permitir el crecimiento de ga1-21 embriones en un SCBA. Para probar esta hipótesis se utilizó el aba2-1 alelo mutante (Col ecotipo), deficiente en la síntesis de ABA como resultado de una mutación puntual en el gen que codifica Xanthosin deshidrogenasa (AT1G52340) y la línea de inserción rgl2-14 T-ADN (Salk_027654, ecotipo Col) 16.
Figura 1. Procedimiento para la disección de semillas. A) Diagrama que describe cómo hacer fórceps truncados para la disección de la semilla. Pinzas pueden truncarse con unas tijeras o pinzas. Cuando la pinza se cierra las puntas truncadas yuxtapuesto shou. Cubierta ld una superficie aproximadamente del tamaño de una semilla B) Paso 1: dos de lado a lado rectangulares papeles Whatman 3MM estériles se puso en un plato plato de Petri que contiene un medio sólido MS. Paso 2: semillas se transfieren sobre la superficie de los papeles Whatman 4 horas después de la imbibición. Paso 3: el procedimiento de disección requiere que sostiene la semilla contra el papel Whatman utilizando los fórceps truncadas. Paso 4: Una aguja de la jeringa se utiliza para cortar la cubierta de la semilla como se muestra. Pasos 5 y 6: Las puntas yuxtapuestas de las pinzas cerradas se utilizan para empujar suavemente el embrión de la cubierta de la semilla a través del sitio del corte.
Figura 2. . Procedimiento para el montaje de la prueba de la ropa de cama cubierta de la semilla Paso 1: Una pieza rectangular de malla de nylon se coloca sobre una placa de placa de Petri que contiene un medio sólido MS. Paso 2 y 3: disecado embriones y cubiertas de las semillas son suavementemovido a los bordes de los fórceps usando la aguja de la jeringa antes de transferirlos a la malla de nylon. Paso 4 y 5: Montar una capa circular y única de cubiertas de las semillas y desechar los embriones como una sola capa circular en el centro de la cama cubierta de la semilla montado.
Figura 3. Los resultados representativos con material de semilla incapaz de sintetizar GA. Capa ensayos del lecho de siembra usando abrigos y embriones de las semillas disecados de ga1 semillas (ga1-21) mutantes, incapaces de sintetizar GA. Los paneles muestran material de la planta como se describe en la figura 80 horas después de la imbibición de la semilla.
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Discussion
Procedimiento El ensayo de cama cubierta de la semilla (SCBA) descrito aquí es en principio aplicable a cualquier circunstancia en la que se bloquea la germinación de semillas de Arabidopsis (o atrasados) y donde el endospermo se sospecha de implementar este arresto. Este último puede ser evidenciado por la eliminación de la cubierta de la semilla (testa y el endospermo) y observando que avanza el crecimiento de embriones más rápidas respecto a la observada cuando los embriones están rodeadas por la cubierta de la semilla. La germinación puede ser bloqueado en respuesta a determinados parámetros físicos ambientales (por ejemplo, agua o potenciales de calidad de luz) o en los antecedentes genéticos específicos (por ejemplo, ausencia de síntesis de GA como en mutantes ga1, ver Figura 3).
No hay reglas generales relativas a la cantidad de cubiertas de las semillas y embriones que se utilizarán para un SCBA. Esto depende del lote de semillas (y, en particular, su frescura) y el tipo de experimento a realizar. Por tanto, es fundamental para adjust la cantidad de material diseccionado para cada caso particular por el control del crecimiento de los embriones en la cama de cubiertas de las semillas sobre una base diaria. Sin embargo, por lo general pocas cubiertas de las semillas son necesarias cuando se utilizan ecotipos de Arabidopsis muy latentes. A continuación se muestran las cantidades típicas de las cubiertas seminales y embriones que se utilizaron con éxito al montar SCBAs:
ERA con material de semilla latente 6:
* Recién cosechada (es decir, en estado latente) ecotipo Cabo Verde Isla (CVI): Utilice 10 embriones y 20 cubiertas de las semillas.
* Recién cosechada Landsberg (Ler) Semillas: Usar 10 embriones y 80 cubiertas de las semillas.
SCBA en ausencia de giberelina (GA) biosíntesis (Figura 3):
* Semillas mutantes ga1 (Columbia - Col - ecotipo): Usar 10 embriones y 80 sacos de semillas.
* De tipo salvaje semillas Col con 10 mM paclobutrazol (un inhibidor de la biosíntesis de GA) en el medio de germinación: 10 Uso de embrioness y 100 cubiertas de las semillas. Añadir paclobutrazol cuando el medio se enfría a 50 ° C antes de verter en la placa de Petri.
SCBA después de un pulso de rojo lejano (FR) de luz 9:
* Use 12 embriones y 100 cubiertas de las semillas.
La única limitación de la técnica SCBA es que requiere paciencia y habilidad con el fin de ensamblar rápidamente los materiales de semillas disecados mientras no matar a los embriones. Un investigador experimentado puede diseccionar 100 semillas dentro de 20 a 30 min. Sin embargo, los usuarios menos experimentados pueden necesitar 1 hr y esperan daños embrionario. Hasta donde sabemos que hay hasta el momento no hay técnicas alternativas para explorar el papel del endospermo para el control de la germinación de la semilla.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza y por el Estado de Ginebra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
References
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