Summary
Här beskriver vi en in vivo-mutagenes-analys för mindre antal renade hematopoetiska celler med Lacl transgen musmodell. Lacl-genen kan isoleras för att bestämma frekvens, plats och typ av DNA-mutanter som spontant uppstått eller efter exponering för genotoxins.
Abstract
Under senare år har det blivit uppenbart att genomisk instabilitet är tätt relaterad till många störningar i utvecklingen, cancer och åldrande. Med tanke på att stamceller ansvarar för att vävnad homeostas och reparation under hela livet, är det rimligt att antaga att stamceller befolkningen är avgörande för att bevara genomisk integritet vävnader. Därför har stort intresse uppstått för att bedöma effekterna av endogena och miljöfaktorer på genomisk integritet i stamceller och deras avkomma, i syfte att förstå etiologin av stamcellsbaserade sjukdomar.
LACI-transgena möss bär en återhämtningsbar λ fagvektor kodande lacl-reportersystem, i vilket lacl-genen tjänar som mutationen reporter. Resultatet av en muterade lacl-genen är framställningen av β-galaktosidas som klyver ett kromogent substrat, vrida den blå. Den Lacl reportersystem är genom jagn alla celler, inklusive stamceller / progenitorceller och kan lätt återvinnas och användas för att därefter infektera E. coli. Efter inkubation infekterade E. coli på agaros som innehåller rätt substrat, kan plack görs, blå plack indikerar en mutant Lacl gen, medan tydliga plack hamn vildtyp. Frekvensen av blå (bland töm) plack indikerar mutantfrekvens i den ursprungliga cellpopulationen DNA extraherades från. Sekvensering av den mutanta lacl-genen kommer att visa placeringen av mutationerna i genen och typen av mutation.
Den LacI transgen musmodell är väl etablerad som en in vivo-mutagenes-analys. Dessutom är de möss och reagensen för analysen är kommersiellt tillgängliga. Här beskriver vi i detalj hur denna modell kan anpassas för att mäta frekvensen av spontant förekommande DNA-mutanter i stamcellsberikade Lin - IL7R - Sca-1 + ckit + + (LSK)-celler och andra subpopulationer av det hematopoietiska systemet.
Introduction
I de flesta vävnader, differentierade celler har en begränsad livslängd. För att bibehålla funktionell integritet, långlivade, vävnadsspecifika stamceller producerar kontinuerligt stamceller som i sin tur ger upphov till helt differentierade celler som krävs för funktionen av just den vävnad. Stamceller fylla även den egna fack genom en process som kallas självförnyelse. Sålunda stamceller är ansvariga för att upprätthålla den funktionella integriteten hos vävnaden de bor i. Därför är det absolut nödvändigt att de är utrustade med kraftfulla mekanismer för att känna av och eventuellt reparera skadad DNA. Om inte, kan de få flera iska (potentiellt skadliga) störningar, som kan ärvas av deras avkomma. Att förstå hur stamceller värna sin arvsmassa under livslängden för en organism är en viktig fråga och kan hjälpa oss att förstå varför genomisk instabilitet är kopplat till cancer och andra åldersrelaterade sjukdomar (recenserade i 1,2).
3-6. Man har funnit att, till exempel i det hematopoietiska systemet, dubbel-sträng DNA-avbrott kan repareras genom homolog rekombination (HR) eller icke-homologa slut gå (NHEJ), den sistnämnda är en reparationsprocess av lägre trohet och därmed ökad risk för att göra fel. Båda är utnyttjas i hematopoetiska stamceller (HSCs) 4,5, men i möss verkar det främst NHEJ i HSCs medan tidiga progenitorceller utnyttjar HR 4. En liknande observation gjordes för stamceller i huden 6. Intressant i mänskliga HSCs HR, inte NHEJ,verkar vara den mekanism för val reparation av dubbelsträngsbrott 3. Huruvida detta funktionella skillnaden mellan de två arterna är verklig eller bara representerar en teknisk eller experimentell skillnad återstår att se.
En stamcell repertoar för att reparera skadat DNA kommer troligen att omfatta andra mekanismer för DNA-reparation, som bas excision reparation (BER), nukleotid excision reparation (NER) och mismatch reparation (MMR). BER och NER ansvarar för reparation av enstaka eller flera baspars lesioner i enkelsträngat DNA, medan MMR fixar bas-bas-felparningar och insättning / borttagning loopar; dessa typer av DNA-skador kan inte repareras genom NHEJ eller HR. Stöd detta begrepp finns flera studier från det hematopoetiska systemet visar ett samband mellan förändringar i en av dessa vägar och avvikelser i HSC facket 7-9, samt en ökad risk att utveckla myelodysplastiskt syndrom 10-16, en sjukdom som har sitt ursprung iHSC och som har samband med ökad genomisk instabilitet som sjukdomen fortskrider 17. Än så länge har mätningar av BER, NER, och MMR direkt i HSCs inte rapporterats.
Förutom att belysa de olika processer som styr vävnadsintegritet vid en mekanistisk nivå, är det viktigt att kunna mäta omfattningen av muterat DNA, så att konsekvenserna av avvikelser i en av dessa processer kan testas, till exempel i normala kontra genetiskt iscensatte stamceller eller i gamla kontra unga. Det är emellertid svårt att utveckla en relevant analys på grund av bristen på vävnadsspecifika stamceller och avsaknaden av odlingsbetingelser som bevarar "stemness". Dessutom bör en sådan analys vara möjligt att ändra till miljömässiga och genetiska manipulationer. En möjlig lösning på dessa begränsningar och krav är användningen av musmodeller som är speciellt konstruerade för att detektera DNA-mutationer.
Multiple transgena musmodeller för mutationsdetektion har utvecklats. Exempelvis Lacl transgena möss 18 bära en återhämtningsbar λ fagvektor kodande lacl-reportersystem, i vilket lacl-genen kodar för en suppressor av lac-operatorn och tjänar såsom mutationen reporter. Efter mutation av lacl-genen, är Lac operatören aktiverad och β-galaktosidas produceras. β-galaktosidas spjälkar det kromogena substratet X-gal (5-brom-4-klor-e-indolyl-β-D-galaktopyranosid), som visar det blå. De cos sajter flankerar Lacl vektorn medger enkel återvinning av lambda fag proteiner och efterföljande infektion av E. coli. Efter inkubation infekterade E. coli på agaros, som innehåller X-gal-substrat, kan plack görs. Blå plack innehåller en förmodad mutant Lac-Jag bär fag, medan tydliga plack hamn icke-mutanter. Frekvensen av blå plack (bland the tydliga ettor) indikerar mutantfrekvens i den ursprungliga cellpopulationen DNA extraherades från. Vidare kan λ-fag som är värd för Lacl målet lätt sekvenseras genom att använda PCR-tekniker för relativt hög genomströmning analys. Sekvense flera muterade Laci gener kommer att avslöja viktig information om mutationen spektrum, vilket i sin tur kan peka på eventuella brister i specifika DNA-reparationsvägar eller till specifika genotoxiska händelser. Den LacI transgena system har standardiserats över flera laboratorier 19 och reagenser finns i handeln. En stor nackdel med lacl-system är den begränsade förmågan att detektera stora deletioner eller omlagringar, varför andra metoder, t ex multi-color FISH på metafas-spreads behöver användas för att komplettera denna brist.
Inom λ fagvektor av lacl-musmodell, finns det en mycket mindre genen CII, Tillgängliga för mutationsanalys. Dess storlek och det faktum att mutanter kan väljas gör detta till en mindre arbetskrävande och billigare analys 20 än genanalys LacI. Emellertid är lacl-genen mer omfattande studerat för mutagenes 21 och känsligheten hos den gen som mutationer har karakteriserats väl, så att det finns en tydlig förståelse av de aminosyrarester som genererar ett fenotypiskt respons på ett kromogent substrat 22-25.
Andra musmodeller för mutationsdetektion innefattar användningen av X174 eller LacZ-transgener. Den X174 transgen musmodell, med den ursprungliga A: T → G: C återgång mutationsanalys 26 eller framåtmutationstest 27 som medger detektering av ett spektrum av basparsubstitutioner, utgör ett billigare system än Lacl modellen. Emellertid är inte trivialt och mutationen spec mutations skärmen i den främre assaytrum av X174 transgenen inte lika väldefinierad som den hos Lacl. I musmodeller bär LacZ transgener, är LacZ mutations reportern återvinnas utnyttja E. coli-värdceller som är känsliga för galaktos och medium innehållande galaktos 28. En nackdel med detta system är att återvinning av LacZ mål innebär också restriktionsendonukleasspjälkning följt av ligering och elektroporering av E. coli-värd, vilket gör det svårt att anpassa systemet till ett litet antal celler. Även om det inte är ett absolut krav för att arbeta med stam / progenitor-cellpopulationer (en kan alltid börja med mer möss), om ett stort antal celler erfordras (t ex miljoner eller mer) kommer det snabbt att bli opraktiskt och kostsamt. Även den relativt stora storleken på LacZ, samtidigt som en känslig mutations reporter, är besvärlig och dyrare för DNA-sekvensanalys och determnering av mutationsspektra. En stor fördel med denna modell är dock dess förmåga att upptäcka stora deletioner och insertioner, såväl som chromosomal rearrangements.
Eftersom alla celler i transgena modeller lacl, X174 och LacZ mus bär reportersystem, kan någon av dessa musmodeller användas för mätning av mutagenes i vilken celltyp som helst av intresse, inklusive stam-och stamfaderceller, så länge som de säkert kan skördas och i tillräckligt antal. Eftersom vi hade lång erfarenhet med Lacl musmodell och Lacl mutationstest, beslutade vi att driva detta system vidare för mutagenes analys i hematopoetiska stam-och progenitorceller populationer.
Den hematopoetisk vävnad är väl karaktäriseras i termer av cellytan fenotyp av dess enskilda delar, inklusive långsiktiga återinplantering stamceller, som kan identifieras som den extremt sällsynt population av Lin - IL7R
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Leukocyter från LacI transgena möss på en C57BL / 6 bakgrund uttrycker inte Sca-1 (Figur 1). Därför, om Sca-1 är en markör som används för cellrening, dessa möss måste korsas med en lämplig stam för att få Sca-1 uttryck, i detta protokoll F1 av en korsning mellan vanliga C57BL / 6 (B6) möss och LacI (C57BL / 6) transgena möss (LacI) användes (Figur 1). Av cellpopulationer som används i detta protokoll, LSKs och sådana planer utgör de minsta befolkningarna i benmärgen. För att rena minst 2 x 10 5 av varje / sortera, kombinera märgen från cirka tio möss vid skörd märgen från endast bakbenen eller från minst fyra möss när även höft-, framben-, kotpelare ben, och sternum används.
Gör enkelcellsuspensioner från benmärg och mjälte. En liten del av benmärgen används som de är, är de flesta för att PURcera LSKs och differentierade myeloida ursprungsceller, dvs sådana planer och granulocytiska / monocytiska progenitorer (GMPs) genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Isoleringen av benmärgsceller och FACS-rening av dessa populationer beskrivs på annat håll 30-32. Ungefär sex oberoende sorterar krävs för att identifiera viktiga skillnader i mutationsfrekvenser mellan populationer.
Följande protokoll för mätning av spontana in vivo-mutationsfrekvens i renade hematopoetiska subpopulationer är anpassad från flera Stratagene instruktionsmanualer 33-35, baserat på originalverk från Kohler et al. 18 De mest kritiska skillnaderna mellan de befintliga protokollen 33-35 och detta protokoll , krävs vid användning av ett relativt litet antal celler, finns det skillnader i volymer av reagens och de tider och temperaturer som används för proteinas K inkubation.
Efter uppsamling av de önskade cellpopulationer, alikvot celler i 1 ml-centrifugrör (för cellantalet per alikvot, se Tabell 1). Centrifugera vid 266 x g under 7 min, vid 4 ° C. Aspirera supernatanten försiktigt. Placera rören i flytande kväve under 5 min och sedan överföra dem till en -80 ° C frys för ytterligare användning. Proverna kan förvaras under minst 6 månader.
2. Isolering av genomiskt DNA
- Ta proverna från -80 ° C frys. Tillsätt 500 | il iskall DNA-lysbuffert (tabell 3) till provröret. Vortex rören för 3-5 sek på medellång hastighet och placera rören på is i 10 min.
- Centrifugera rören i 12 min, 4000 x g, 4 ° C. Försiktigt kassera ~ 450 | il av supernatanten. Centrifugera ner röret i 3-5 sek. Använd ett glaskapillärrör att försiktigt ta bort återstoden av supernatanten. Lufttorka innerväggar than rör tills inga droppar syns längre (~ 2 min).
- Lägg 2 pl av RNace-It ribonukleas cocktail och 10 | il av 1 M DTT till 100 | il av DNA-digereringsbuffert (tabell 3). Justera volymer beroende på antalet prover som skall behandlas, 20 | il av detta DNA digere lösning krävs per prov. Efter tillsats av 20 pl av detta till cellpelleten, försöka göra pellets frigöra sig från botten, genom att försiktigt knacka på röret med fingret eller en penna.
Observera: det kan vara svårt att se den pellet på grund av låga cellantal. - Lägg 20 pl proteinas K-lösning * (tabell 3) till varje prov, mycket försiktigt knacka röret igen.
* Anmärkning: proteinas K-lösning skall värmas upp i en 50 ° C vattenbad, 2 min före användning för att aktivera enzymet. - Placera omedelbart röret i 50 ° C vattenbad. Smälta provet enligt riktlinjerna i
- Förbered DNA dialyssystem i kylrummet (Figur 2). Häll 600 ml TE-buffert (tabell 3) i en 600 ml glasbägare, tillsätt en liten magnetisk omrörarstav, så att bufferten kan omröras under dialys och låta (0,025 mM porstorlek)-membran flyta på ytan av bufferten. Ett membran per prov; 1-4 membran kan användas i en enda dialys bägare. Gör en markering på marginalen av membranet med en sax för identifiering av varje prov.
- Efter att den lämpliga digere tid lägger nu mycket viskös iskt DNA * noggrant till centrum i den flytande membran (Figur 2). Täck bägaren omedelbart med aluminiumfolie. Dialysera den genomiska DNA vid 4 ° C i ~ 16-20hr, rör bufferten försiktigt.
* Obs: När du arbetar med viskösa DNA-lösningar, använd pipettspetsar med en bred öppning. - Nästa dag häll 600 ml nyberedd TE-buffert (tabell 3) till en ren glasbägare och överföra membranen till den nya bägaren med en sked mycket noga, och täck över bägaren med folie. Dialysera mot en annan 2 timmar.
- Avlägsna dialysmembranet från bägaren med TE-buffert med användning av en sked och överför endast den mest viskösa "klump" av DNA-lösningen till en ny, steril 1 ml rör. Förvara provet vid 4 ° C. Fortsätt mutagenesen assay nästa dag eller upp till 1,5 månader senare. För de renade populationer, vänta minst 1 vecka.
3. Beredning av fack för E. coli / Fag kultur (Dag 1)
Varje bricka innehåller två olika skikt, en agar skikt vid bottnen och en agaros-skiktet på toppen som innehåller X-gal. Den E.coli / fag-lösning kommer att läggas till senare. Antalet och typen av celler som isolerats kommer att avgöra hur många brickor kommer att krävas. Se Tabell 1 för att beräkna antalet brickor som behövs och efterföljande mängder av lösningar för denna del av protokollet. Följande kommer att generera ~ 60 brickor, som en erfaren person kan bearbeta lätt.
- Förbered följande medier:
- för bottenlagret, förbereda 6 x 2 L flaskor med vardera innehållande 1.600 ml DDH 2 O. Lägg NZY pulver (21 g / L) och agar (15 g / L), blanda väl.
- för det översta lagret, förbereda 4 x 1 L-kolvar med var och en innehållande 800 ml DDH 2 O. Lägg NZY pulver (21 g / L) och agaros (7,2 g / L), blanda väl.
- för odling av E. coli, tillsätt 2,5 g NZY pulver till var och en av 2 x 250 ml kolvar och justera volymen till 100 ml med DDH 2 O;
- för bekräftelse brickor som används i steg 8, tillsätt 8,4 g NZY pulver och 6 g agar till en 1 L flaska och ta volymen till 400 ml med DDH 2 O.
- Täck öppningen av kolvar med aluminiumfolie. Blanda väl och autoklavera dem vid 121 ° C, 15 psi under 30 min.
- Ta kolvarna (mycket varmt!) Från autoklaven. Försiktigt snurra kolvarna att blanda agar och agaros, sedan placera dem i ett 50 ° C vattenbad. När vattenbadet har uppnått 50 ° C igen, häll från de 2 L flaskor (steg 3.1.1) ~ 150 ml NZY agar i varje fack (bottenskikt).
- Tillåt ägarn stelna vid rumstemperatur under åtminstone 2 timmar, sedan vända och öppna facken. Placera botten av facken på locket, 45 ° från centrum (Figur 3) och låt torka i 30 minuter. Stäng facken och lämna O / N vid RT.
- Under tiden förbereder SCS-8 E. coli-kultur för nästa dag. Från en av de två 250 ml kolvar * (steg 3.1.3), ta 5 ml NZY buljong (tabell 3) och för över till en steril 14 ml röret. Tillägg med 62,5 l av maltos / MgSO 4-lösning och tillsätt 10 ìl av SCS-8 E. coli glycerol lager. Inkubera vid 37 ° C under 3-4 h under skakning vid 250-300 rpm. Använd 15 pl av denna kultur för att inokulera 95 ml NZY-buljong (i en 250 ml sidoarm kolv), kultur O / N vid 37 ° C i en skakningsinkubator (250 till 300 rpm).
* OBS: den andra 250-ml kolv kan senare användas för att justera OD av kulturen vid behov (steg 4,1) - Ta 1 L kolv med agar (steg 3.1.4), och häll ~ 6-7 ml NZY agar i 60 mm rätter (detta kommer att vara tillräckligt för ~ 50 rätter, som krävs för steg 8). Låt agar härda (~ 10 min), sedan vända och packa in i plast. Dessa rätter kan förvaras vid 4 ° C i upp till en månad.
4. Beredning av fack för E. coli / Fag kultur (Dag 2)
- Kontrollera OD av SCS-8 E. coli-kultur (steg 3,5) i spektrofotometer.Justera OD 600-0,6 med NZY buljong (Tabell 3) (steg 3.1.3), och placera kolven på isen för att stoppa tillväxten och hålla på is tills produkten ska användas. Detta kommer att användas för steg 6,3 och 8,2. Denna kultur kan förvaras under 5 dagar vid 4 ° C.
- Lufttorka alla analys fack (hällde dagen innan) för ~ 5 timmar (Figur 3).
5. Förpackning av genomiskt DNA (Dag 2; Fortsättning)
- Ta det nödvändiga antalet apelsin Transpack-rör ut den -80 ° C frys och placera dem på torris tills produkten ska användas, ta en apelsin Trans rör för varje förpacknings reaktion som skall utföras. Märk varje rör på lämpligt sätt. Har de genomiska DNA-prover (steg 2.9) redo på is.
- Detta steg bör utföras en slang vid den tidpunkten. Fullföljer steget innan vi går vidare till nästa DNA-prov. Tina orange tub * not 1 snabbt: använd fingrarna tills det mesta av den tinas, sedan läggapå is. Ta det motsvarande genomiska DNA-prov och omedelbart överföra 8-12 l prov * not 2,3 till apelsinröret. Blanda innehållet genom att försiktigt pipettera upp och ner 3 gånger, samt genom att försiktigt knacka på röret med fingret. Försök att inte införa bubblor vid blandning. Placera röret i ett 30 ° C vattenbad i 90 min.
* Not 1: en snabb körning i mikrocentrifug kan vara nödvändigt att samla in allt innehåll från innerväggarna och locket.
* Anm 2: volymen av tillsatt prov beror på antalet celler som används för att generera det provet: 11 till 12 | il av prov som framställts från 2,0 till 5,0 x 10 5 celler, 10 | il av 1,0 x 10 6 cellprover och 8 pl 1,5 x 10 6 cellprover.
* Not 3: DNA-fortfarande är mycket viskös, för att ta DNA uttryckt trycker pipettspetsen till botten av provröret och försiktigt vrida spetsen runt mot den inre väggen av röret. - Ta 1 eller 2 blå Trans tubes * ut i -80 ° C frys och placera dem på torr is tills vidare användning. Tina dem snabbt och överför 12 pl till var och en av de orange rören. Blanda lösningen genom att försiktigt pipettera upp och ner tre gånger. Snurra röret ner till 2-3 sekunder, sedan på slangen med fingret för ytterligare blandning och omedelbart tillbaka den till 30 ° C vattenbad i ytterligare 90 min.
* Obs: Använd 1 blå slang för 5-6 reaktioner och 2 blå rör för 10-12 reaktioner. - Efter 90 min, späd varje reaktion med 970 | il SM-buffert * (tabell 3) för att stoppa reaktionen och vortexa på medelhastighet under 5 sek. Placera rören på is tills vidare användning.
* OBS: Om antalet celler är ≤ 5 x 10 5, använder 500 l SM-buffert (tabell 3) för att stoppa reaktionen, 2 rör (av samma prov) kan sedan kombineras senare (steg 6,4).
6. Bordläggningen Förpackad Iskt DNA (Dag 2; Fortsättning)
- Stäng den inverterade agar tstrålar som öppnades för torkning på morgonen. Märk facken för varje prov.
- Lös upp 4,8 g av X-gal i 16,8 ml N, N-dimetylformamid (som behövs för steg 6,5). Rör om omedelbart och sätta på en shaker plattform. Skyddas mot ljus. Lösningen ska vara klar i 20-30 min.
- Alikvotera SCS-8 E. coli-celler. För varje uppsättning brickor * Använd en 50 ml koniska rör. Märk röret med namnet på det förpackade DNA-prov. Tillsätt 2 ml av E. coli upphängning för varje magasin.
* OBS: till exempel 3 x 10 5 genetiskt modifierade växter kräver en uppsättning av 8 fack (se tabell 1). Således två portioner, kräver 8 x 2 = 16 brickor. Behåll de alikvoter separerar och därmed förbereda två 50 ml rör, med vardera 8 x 2 = 16 ml E. coli fjädring. - Tillsätt 1 ml * av förpackad DNA-prov (från steg 5,4) till lämplig 50 ml rör som innehåller SCS-8 E. coli portion och blanda väl. Inkubera denna E. coli / fag-blandningen i ett skakande incubator (250-300 rpm), vid 37 ° C under 23 min.
* OBS: Om DNA extraherades från ≤ 5 x 10 5 celler, var 500 l av SM-buffert som används för att stoppa reaktionen (steg 5,4). Vid detta steg kan rören kombineras och tillsätts till ett 50 ml koniskt rör. - När E. coli / fag blandningen inkubation, börjar förberedelserna för toppagaros lagret. Tillsätt 5 ml X-gal / N, N-dimetylformamid-lösning (steg 6,2) till varje 800 ml kolv av ovanskiktet agaroslösningen (från steg 3.1.2, som hölls vid 50 ° C). Slutlig koncentration av X-gal kommer att vara 1,5 mg / ml. X-gal kan fälla ut en liten när den adderas till agaros. Swirl att upplösa X-gal och lägga flaskan tillbaka i 50 ° C vattenbad.
- Ta E. coli / fag blandning ur inkubatorn (steg 6,4). Varje prov kräver flera fack, varje fack, kräver 50 ml X-gal/agarose lösning (steg 6,5). Häll erforderlig volym X-gal/agarose för varje prov (dvs. 50 ml xantal brickor) i en större steril plastflaska och lägga till lämpliga E. coli / fag blandning. Snurra flaskan för att blanda. Dela blandningen i alikvoter om 45 till 50 ml i 50 ml koniska rör. Antalet rör bör vara samma som antalet brickor som krävs för att provet.
Anmärkning: överbliven X-gal/agarose lösning kommer att användas i steg 8,3. Lösningen kan lagras i ett 50 ° C vattenbad tills vidare användning. - Häll 50 ml toppagaros blandning över den nedre halvan av analysbrickan. Snabbt spred agarosen genom att luta analysbrickan något i en riktning.
Anm: agarosen svalnar mycket snabbt och kommer att bli omöjligt att spridas ut över facket. Därför måste detta steg utföras relativt snabbt och med agaros som har hållits vid 50 ° C. - Låt toppagaros att härda i minst 15 min. Sedan, invertera och öppna analys brickor för att låta dem lufttorka i 30 min (figur 3). Stäng facken, inkubera analys brickor inverterade (botten agarskikt sida på toppen) vid 37 ° C i 15-16 timmar. Stapla inte mer än 5 brickor.
7. Fastställande av en förmodad Mutant Frekvens (Dag 3)
- Ta bort brickorna från 37 ° C inkubator och låt dem svalna. Räkna genomskinliga plackbildande enheter (PFU) på varje bricka, slumpmässigt välja två platser på brickorna, rita en kvadrat * på 2,5 x 2,5 cm 2 eller 5 x 5 cm 2 och räkna alla PFU i varje ruta med en markering cellräknare (Figur 4A, B).
* OBS: För att rita torget används en anordning som visas i figur 5. Om antalet räknade PFU är ≥ 40, använder mindre torget, på annat sätt använda den större. - Ta medelvärdet av kvadraterna räknade och multiplicera med 96, om att räkna med en mindre kvadrat, eller multiplicera detta tal med 24, om att räkna med den stora. Lägg antalet PFU räknade för alla magasin från SAmig prov. Detta är det totala antalet PFU genereras för det provet.
- Därefter räknar de muterade plack i varje fack. Brickorna har nu svalnat, vilket kommer att bidra till att lokalisera de muterade plack. För att ytterligare underlätta observation blåa plack, flytta brickan över en röd och / eller vit yta, ark rött och vitt papper fungerar bra. Ringa någon blå plakett med en märkpenna. Spela formen och intensiteten i den blå färgen på varje mutant (t.ex. full, cirkel, sektor, Figur 4C) 36,37.
- Bestäm den förmodade mutantfrekvensen för varje prov genom att dividera antalet mutanta PFU (steg 7,3) genom att det totala antalet pfu (steg 7,2).
8. Kontroll av Förmodade Mutant Plaketter (Dag 3-5)
- Med hjälp av en pasteurpipett, kärna varje mutant (blå) PFU och föra in kontakten i 250 l steril SM-buffert (tabell 3). Tillsätt 25 l av kloroform, virvel i 5 sek end förvara vid 4 ° C för att fortsätta till nästa dag eller låt stå 2 timmar vid rumstemperatur innan du fortsätter med nästa steg, för att kontrollera att den muterade PFU är verkligen en mutant. Proverna kan förvaras vid 4 ° C under minst 1 år.
- Märk en 1 ml och en 4 ml sterilt rör för varje mutant som var ansluten. I den nya 1 ml rör späddes återsuspenderades fagen frigöres från agarpluggen (steg 8,1) 1:50 i steril SM-buffert (2 ^ il av provet i 100 | il SM-buffert (Tabell 3)), skaka snabbt, ställ åt sidan. Till 4 ml sterilt rör tillsätt 200 l SCS-8 E. coli-kultur (från steg 4,1) och 2 pl av den utspädda fagen från motsvarande 1 ml rör, inkubera vid 37 ° C under 5 till 10 min.
- Tillsätt 2,5 ml av topp agaros innehållande X-gal (vänster-over från steg 6,6) till varje 4 ml tub, snurra röret för att blanda och häll på en 60-mm NZY agarplatta tidigare hällde (steg 3,6). Låt stå i 10 minuter (för att låta than toppagaros stelna), invertera skålen och inkubera O / N vid 37 ° C.
- Nästa morgon, ta bort skålen från kuvösen och bestämma andelen blå PFU på varje skål (Figur 6). När 70% eller mer av PFU är blå, är en mutant anses bekräftad 38,39. Kärna mutanten plack från skålen och sätta i en 1,5 ml med skruvlock rör, innehållande 250 | il SM-buffert (Tabell 3) och 25 | il kloroform, det är nu redo för sekvensering.
- När 50% eller mindre av PFU är blå, är det inte som en riktig mutant 38,39. När frekvensen av blå PFU är mellan 60-70%, kom tillbaka med i noterna om formen av plack, om formen på PFU var "full", fortsätt med sekvensering.
9. Sekvense för Mutationer i Lacl G ene
- Ställ in PCR-reaktioner i en 25 pl reaktionsvolym, inklusive 1,5 μ; Ll plack supernatanten (mall, steg 8,4), den framåtriktade primern SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ') och den omvända primern SR2 (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). Använd PCR extender Taq-polymeras kit enligt tillverkarens instruktioner. Cykling villkor är som följer: 94 ° C under 2 minuter, därefter 35 cykler av 94 ° C under 20 sek, 60 ° C under 20 sek, 72 ° C under 2 min, följt av ett slutligt steg av 72 ° C under 5 min .
- Ta en 5 | il alikvot av varje reaktion och kördes på en 0,8% agarosgel för att bekräfta amplifiering.
- Torka upp PCR-reaktionerna med användning av Augencourt cleanup kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Kvantifiera mall-DNA.
- Använd ~ 100 ng av PCR-produkten som templat-DNA för sekvensering. Sekvens amplikoner i båda riktningarna med användning av samma PCR-primrar som sekvenseringsprimrar (se ovan).
- Montera sekvenser och anpassa sig till Lacl referenssekvensen 40 för att detektera Mutations.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo-mutagenes analys mäter en sällsynt händelse (mutant PFU) bland många händelser (alla PFU). Genom att utföra analysen med litet antal celler är det möjligt att resultatet är det väsentligt påverkas av falskt positiva och falskt negativa resultat. För att behandla denna fråga som vi utförde en serieutspädningsexperiment med ofraktionerat benmärgsceller, skördas från tre olika djur. Vi mätte mutantfrekvens i benmärgen av dessa djur med användning av 1,4 x 10 6, 7,0 x 10 5, 3,5 x 10 5 och 1,75 x 10 5 celler. Resultaten (Figur 7) uppvisar ett linjärt förhållande mellan ingångscellantalet och antalet PFU ter alstras. Huvudsakligen är mutanten frekvensen konsekvent, vare sig man mäter med låga eller höga mängder celler. Även om det inte direkt testat (på grund av bristen på celler), finns det ingen anledning att tro att detta inte är fallet för LSKs och GMP.
t "> Det viktigaste steget i denna mutagenes-analysen är isolering av genomiskt DNA (steg 2). Även om DNA-koncentration helst bör vara ≥ 500 ng / l, fungerar detta protokoll väl med 40-150 ng / ul. Viktigare är på 260/280-tal (detta bör vara> 1,8-2,0) och molekylvikten (bör ligga runt 300-500 kb). Det rekommenderas när man inte är bekant med analysen för att kontrollera kvaliteten och storleken på den isolerade DNA . Figur 8 visar ett exempel på en elektroforeskörning av högmolekylärt DNA.Markeringarna enskilda PFU på en bricka visas i figur 4B utgör en rimlig och genomförbar täthet av plack när man börjar med ett mindre antal renade celler, en bricka ska hålla mellan 40-150 PFU / litet torg. I detta speciella experiment, det lilla torget i figur 4B innehåller 103 plack. Den andra kvadraten på brickan, som visas i det övre hörnet i figur 4A 41, eftersom vi använder något mindre fack och 12.000 PFU på dessa brickor inte tillåta oss en bra skillnad mellan enskilda plack.
Figur 4C visar exempel på olika typer av blå plack som kan observeras. I Lacl mutagenes-analysen, är morfologin av plack (det vill säga fullt, sektor eller cirkel) en uppgift om ursprunget för mutationen, hela är en mutation från mus ursprung, medan de andra två är sannolikt produceras i E. coli 36,37. Vid nicasiling (se also Figur 6), nästan alla "full" plack reproducera> 70% blå placker igen, medan endast en mycket liten del av de plack sektor göra och praktiskt taget inget av de ofta mindre, cirkulära plattor.
Tabell 2 visar reproducerbarheten för plackbildning med ett relativt litet antal renade celler jämfört med den med ett stort antal benmärgsceller (samma pool av celler där cellerna sorteras från) och mjältceller.
Mutant PFU bekräftas, först genom omstryka (Figur 6 visar representativa exempel på rätter för bekräftelse av primär mutant (blå) PFU) och andra, genom sekvensering. Rätterna i figur 6 som innehåller> 70% blå PFU (två nedersta) bekräftar att mutanten har sitt ursprung i musen (och inte i E. coli). Dock visar det övre vänstra skålen inga blå PFU och därför bör den primära PFU inte räknas som mutant och sequencing är inte nödvändigt. Den högra skålen visar ~ 65% blå PFU. Beroende på formen hos den primära plack kommer detta prov att sändas ut för sekvensering (se steg 8.4). Endast om en DNA-mutation kan bekräftas genom sekvensering kommer detta PFU räknas som mutant. Om osäker på formen på PFU, sekvens!
Figur 1. Sca-1 färgning på benmärgsceller från vild typ C57BL6 möss (B6), transgena Laci möss (LacI) och avkomman av en korsning mellan dessa två (B6 x LacI). Benmärgsceller av B6-möss uttrycker Sca- 1 på sin cellyta och denna egenskap används för att rena stamceller-och stamfaderceller. Transgenic LACI möss på en B6 bakgrund emellertid inte uttrycker Sca-1; denna markör måste ha förlorats while upprättandet av kolonin. Att återinföra Sca-1 i transgena Laci möss var dessa möss korsas med vanliga B6 möss.
Figur 2. DNA dialyssystemet. Tre membran som håller en viskös DNA-lösning i mitten (färgad blå för bättre visualisering) är flytande på TE-buffert. De röda pilarna visar små hack i membranet, som används för providentifiering.
Figur 3. Effektivt sätt att torka 60 eller fler agar / agaros innehåller brickor.
gether.within-page = "alltid"> 
Figur 4. Detektion av plackbildande enheter (PFU). Avbildade är (delar av) stora agar fack (som visas i figur 3) med primära kolonier av fag-infekterad E. coli. (A) Visas är en hel platta med 2 små rutor som dras på den för att räkna plack. Den röda-insättning visas förstorad i (B). (B) Varje enskild svart markering prick indikerar en tydlig vildtyp PFU i agarplatta (103 totalt). (C) Olika former av potentiellt muterade PFU. Klicka här för att visa en större bild.
s/ftp_upload/50752/50752fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50752/50752fig5.jpg "/>
Figur 5. Plexiglas räkna rutor. Avbildade är en liten och stor räkning torg. De inre mätningar av stora fyrkantiga är 5 cm x 5 cm, den för den lilla fyrkant 2,5 cm x 2,5 cm.
Figur 6. Bekräftelse av mutanta plackbildande enheter (PFU). Visade är fyra små rätter inokulerade dagen innan med ett utspädningsmedel av en blå PFU. Den övre vänstra skålen visar några blå PFU. Den övre högra skålen visar ~ 65% blå PFU. De två nedre fack visar 80-90% blå PFU (till vänster) och 100% blå PFU (höger). De röda pilarna visar tydligt (vildtyp) PFU.
re 7 "fo: innehåll-width =" 4I "fo: src =" / files/ftp_upload/50752/50752fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50752/50752fig7.jpg "/>
Figur 7. Mutant frekvens i ofraktionerat benmärg. Avbildad är (A) antalet PFU, (B) antalet mutanter och (C) mutantfrekvensen mäts i tre olika djur (24-26 månader gamla), som är representerade med olika färger. För varje mus, de mätningar som gjorts på fyra olika provstorlekar: 1,4 x 10 6, 7,0 x 10 5, 3,5 x 10 5 och 1,75 x 10 5 celler. Data visar att inom detta intervall av celler, urvalsstorlek har ingen signifikant inverkan mutantfrekvensmätningar.
Fig.ure 8. Pulsed-field elektrofores av högmolekylära DNA-prover isolerade från renade celler. Iskt DNA isolerades enligt beskrivningen i steg 2 i protokollet och köra på en Bio-Rad (CHEF-DR III)-system. De olika proverna laddades på gelén är DNA-prov som isolerats från levern (Li, bana 1), benmärgsceller utarmade på mogen härstamning + celler (LB; banorna 2 och 14), CD34 + LSK celler (L; lane 6), CMP (spår 7-9), GMPs (banorna 11 och 12) och Sca-1 +-celler (s; lane 15). Lane 4 håller på stegen för högmolekylärt DNA. Bilden visar att huvuddelen av DNA: t är hög molekylvikt (> 600 kb).
Tabell 1. Diverse provparametrar för renade populationer, hel benmärg och mjälte. Använd denna tabell där det anges i protokollet. För varje population indikeras överst, av antalet celler (x 10 5) per alikvot, DNA digere tid, volym av DNA-provefter dialys, är antalet reaktioner som krävs för varje portion och antalet brickor som behövs per portion anges till vänster. Digere gånger vid 50 ° C är avgörande för framgången för experimentet.
LSK = Lin - Sca-1 + Kit + +-celler; CMP = engagerade myeloisk stamfader, GMP = granulocytisk / monocytisk stamfader, WBM = (osorterade) hela benmärgen. Mjältceller osorterade.
Tabell 2. Effektivitet av plackbildning är jämförbara mellan olika cellpopulationer. Tabellen visar plackbildning mellan de olika populationerna. Sex månader gamla C57BL / 6 möss användes för dessa experiment (lårben och skenben på 10-11 möss per experiment, 6 experiment totalt). Alla utom en av de populationer som användes i dessa experiment gave minst 1, upp till 24, (bekräftat) mutant PFU (Zhou et al., manuskript under utarbetande). PFU siffror kan variera per musstam.
LSK = Lin - Sca-1 + Kit + +-celler; CMP = engagerade myeloisk stamfader, GMP = granulocytisk / monocytisk stamfader, WBM = (osorterade) hel benmärg * Mjältceller är osorterade.. SD = standardavvikelse.
Tabell 3. Instruktioner för beredning av ytterligare reagenser.
§ Från Stratagene Bruksanvisning för RecoverEase DNA Isolation Kit
¶ Från Stratagene Bruksanvisning för Transaging Extract
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo-mutagenes-analysen beskriven häri baseras på Lacl transgen musmodell ursprungligen genererad av Kohler et al. 18 Denna modell använder en λ fagvektor som bär en lacl-reportergen. De två cos-ställen som flankerar vektorn möjliggör en relativt enkel återvinning och efterföljande förpackning i infektiösa fagpartiklar, användes för att infektera E. coli. En blå plack kommer att genereras av fag-infekterad E. coli som innehåller en muterad Lacl gen. Den blå plack ställs mot en färglös bakgrund, vilket avsevärt förenklar uppgiften att mutanten poäng. DNA-sekvenseringstekniker kan användas för att identifiera läget och typen av mutation, som har inträffat, som kan hjälpa till ytterligare undersökningar av de mekanismer som ligger bakom mutagenes.
De ändringar vi gjort i protokollet för denna mutagenes analys tillåter en att använda den med FACS-renade hematopoietic cellpopulationer. Dock fann vi att en reproducerbar analys kräver fortfarande minst 2 x 10 5 hematopoetiska celler för att säkerställa tillräckliga mängder av högkvalitativa DNA. Eftersom frekvensen för långsiktig repopulerande HSCs är extremt låg 29, utför en mutagenesanalys på dessa HSCs är på denna punkt inte uppnås. Den stamcellsberikade population vi använder i detta protokoll, LSK celler, innehåller förutom Flk-2 - långsiktiga återinplantering HSCs, även FLK-2 - kortfristiga återinplantering HSCs och Flk-2 +-celler, som utgör multipotentiell gångare celler (MPPs) 42. Trots denna begränsning anser vi att använda LSK celler som en avläsning för HSCs i denna mutagenes-analysen är rimligt eftersom det visade sig att LSK celler beter sig mer som LSK-Flk-2 - HSCs det gäller att utnyttja NHEJ än progenitorceller 5. Dessutom föreslår arbete från al. Rossi et 8 att MPPs är bättre i kopieringen med att skadaed DNA än HSCs, speciellt när de åldras, vilket leder oss att antaga att antalet mutanter som finns i LSK befolkningen speglar den hos HSCs snarare än MPPs.
Eftersom små mängder sorterade celler erhålls vid varje experiment, till en viktig fråga tänka på planeringsstadiet av detta in vivo-mutagenes-analys, är provstorleken (dvs. det totala antalet plack per prov) nödvändigt för att uppnå statistisk signifikans. Med andra ord, när målet är att till exempel jämföra mutationsfrekvens manipulerade LSK celler till vildtyp kontroll LSK celler, hur många plack totalt krävs för varje LSK befolkningen att upptäcka en två-eller tre-faldig skillnad i mutationsfrekvensen? Att notera, kan det totala antalet plack kombineras från alla experiment, eftersom vi fann ingen signifikant skillnad mellan sorteringsexperiment, åtminstone i vildtyp celler, som bygger på en negativ binomial regressionsanalys 43. Plack numlemmar är viktigt att veta, eftersom det kommer att avgöra hur många slag som måste utföras (~ 10.000 för WBM och allmänläkare och ~ 7000 för mjälte, LSKs och CMP). Eftersom mutationsfrekvenser är små i vildtyp vävnader 44, är inte exakt den normala approximation statistiskt jämföra dessa. Därför använder vi Poisson-fördelningen, eftersom den approximerar den sanna binomialfördelningen (av mutationsfrekvensen) när den frekvensen är liten och provstorleken är relativt stor, Huffman 45 ger en formel (ekvation 4) för att beräkna urvalsstorlek baserad på Poisson-fördelning. När den appliceras på hypotetiska mutationsfrekvenser av 2,5, 4 och 7 mutationer per 100000 celler i kontrollcellerna 44 kräver vi 456949 plågor, 285592 och 163196, respektive, för att detektera en betydande två-faldig skillnad (två testprovet med två tailed signifikans på 0,05 och kraft på 0,80). Färre placker krävs för att detektera en tre-faldigSkillnaden: 122.148, 76.342, och 43.624, respektive. Således antalet plack som krävs för varje population av intresse (och därmed antalet av slag som behövs för att erhålla tillräckligt med celler) beror på mutationsfrekvensen som kan förväntas i kontrollcellpopulationen och den förutsagda flerfaldsförändringen i jämförelsepopulationen.
Det viktigaste steget i denna mutagenes-analysen är isolering av genomiskt DNA (steg 2). Även om det är viktigt att börja detta protokoll med hög kvalitet DNA-prover (se "representativa resultat"), när man arbetar med sorterade celler, cell nummer är ofta begränsad och kan inte slösas bort på att bestämma DNA-koncentration eller storlek. Vi fann att en annan bra indikator för kvaliteten på DNA-provet är dess viskositet, vid steg 2.9 provet bör vara mycket trögflytande och svår att arbeta med. Det kräver lite övning för att få detta steg rätt. Därför rekommenderas det att räkna ut protokollet med stora cell nummer, t.ex. med hel benmärg eller sorterade Sca-1 + celler, och bli bekant med att isolera DNA från dessa prover och lära sig att bedöma kvaliteten på DNA genom sin viskositet.
Kvaliteten och storleken av DNA påverkar antalet PFU genereras. När DNA-isoleringssteg är fulländad, är nästa viktiga inslag i att optimera analysens tätheten av PFU per bricka. Tabell 1 visar det rekommenderade antalet brickor som ska användas för varje typ av prov som motsvarar till ett optimalt antal celler för det provet. Med hjälp av denna riktlinje bör resultera i fack där enskilda plack kan ändå urskiljas, men inte sprids för tunt. En bricka ska hålla mellan 40 till 120 PFU per litet torg, som visas i figur 4B exempel representerar en rimlig täthet. Med arbetade dessa optimerings aspekter ut, är mycket effektiv och reproducerbar antalet PFU som genereras per prov (tabell 2).
"> Den LacI transgen musmodell har använts med en mängd andra vävnader, men inte i kombination med ett relativt litet antal högrenade populationer. När den appliceras på andra (än hematopoetisk) vävnads begränsad stamcellsberikade populationer, rekommenderas att särskilt uppmärksamma DNA isoleringsproceduren,. kan variera från celltyp till celltyp och rekommendationen hematopoietiska celler nödvändigtvis inte fungera för andra typer vävnadscell De kritiska faktorer, såsom mängden reagens, den temperatur vid vilken det proteinas K matsmältningen måste ske och, viktigast av allt, kommer det proteinas K matsmältningen tid måste utarbetas för varje celltyp, detta protokoll kan tjäna som utgångspunkt.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka David R. Rodriguez, MA för grafisk design och fotografi i detta manuskript. Detta arbete stöddes av medel från GCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) och Cancer Center Support Grant (P30CA054174) till UTHSCSA flödescytometri Core-anläggningen och UTHSCSA Advanced nukleinsyror Core Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LacI transgenic mice | BioReliance Corporation | ||
| RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail | Agilent Technologies (Stratagene) | 720202 | |
| Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli | Agilent Technologies (Stratagene) | 200221 | |
| DNA size standards – lambda ladder | Bio Rad | 170-3635 | |
| 0.025 mM Pore size membranes | Fisher (Millipore) | VSWP 025 00 | |
| 245 mm2 Bioassay dishes (trays) | Fisher (Corning) | 07-200-600 | |
| NZY broth (powder) | Fisher (Teknova) | N1144 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher | E-3120-500 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fisher | AC34843-5000 | |
| X-gal | Research Products Intl Corp (RPI) | B71800-10.0 | |
| Proteinase K | Roche | 3-115-852 | |
| PCR Extender Taq Polimerase kit | 5 PRIME | 2200500 | |
| Agencourt AMPure XP cleanup kit | Beckman/Coulter | A63880 |
References
- Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (10), 963-969 (2009).
- Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat. Rev. Genet. 9 (3), 204-217 (2008).
- Milyavsky, M., et al. A distinctive DNA damage response in human hematopoietic stem cells reveals an apoptosis-independent role for p53 in self-renewal. Cell. Stem Cell. 7 (2), 186-197 (2010).
- Mohrin, M., et al. Hematopoietic stem cell quiescence promotes error-prone DNA repair and mutagenesis. Cell. Stem Cell. 7 (2), 174-185 (2010).
- Shao, L., Feng, W., Lee, K. J., Chen, B. P., Zhou, D. A sensitive and quantitative polymerase chain reaction-based cell free in vitro non-homologous end joining assay for hematopoietic stem cells. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
- Sotiropoulou, P. A., et al. Bcl-2 and accelerated DNA repair mediates resistance of hair follicle bulge stem cells to DNA-damage-induced cell death. Nat. Cell Biol. 12 (6), 572-582 (2010).
- Prasher, J. M., et al. Reduced hematopoietic reserves in DNA interstrand crosslink repair-deficient Ercc1-/- mice. EMBO J. 24 (4), 861-871 (2005).
- Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447 (7145), 725-729 (2007).
- Reese, J. S., Liu, L., Gerson, S. L. Repopulating defect of mismatch repair-deficient hematopoietic stem cells. Blood. 102 (5), 1626-1633 (2003).
- Carney, D. A., et al. Therapy-related myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia following fludarabine combination chemotherapy. Leukemia. 24 (12), 2056-2062 (2010).
- Jankowska, A. M., et al. Base excision repair dysfunction in a subgroup of patients with myelodysplastic syndrome. Leukemia. 22 (3), 551-558 (2008).
- Tam, C. S., et al. Treatment-related myelodysplasia following fludarabine combination chemotherapy. Haematologica. 91 (11), 1546-1550 (2006).
- Webb, S. Xeroderma pigmentosum. BMJ. 336 (7641), 444-446 (2008).
- Ben-Yehuda, D., et al. Microsatellite instability and p53 mutations in therapy-related leukemia suggest mutator phenotype. Blood. 88 (11), 4296-4303 (1996).
- Casorelli, I., et al. Drug treatment in the development of mismatch repair defective acute leukemia and myelodysplastic syndrome. DNA Repair. 2 (5), 547-559 (2003).
- Olipitz, W., et al. Defective DNA-mismatch repair: a potential mediator of leukemogenic susceptibility in therapy-related myelodysplasia and leukemia. Genes Chrom. Cancer. 34 (2), 243-248 (2002).
- Haase, D., et al. New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients. Blood. 110 (13), 4385-4395 (2007).
- Kohler, S. W., et al. Analysis of spontaneous and induced mutations in transgenic mice using a lambda ZAP/lacI shuttle vector. Environ. Mol. Mutagen. 18 (4), 316-321 (1991).
- Rogers, B. J., Provost, G. S., Young, R. R., Putman, D. L., Short, J. M. Intralaboratory optimization and standardization of mutant screening conditions used for a lambda/lacI transgenic mouse mutagenesis assay. 327 (1-2), 57-66 (1995).
- Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
- Ward, T. L., Prtenjaca, A., Hill, K. A. A novel Escherichia coli-derived mutation detected with the Big Blue cII mutant selectable assay. Environ. Mol. Mutagen. 51 (4), 344-348 (2010).
- Miller, J. H., Coulondre, C., Farabaugh, P. J. Correlation of nonsense sites in the lacI gene with specific codons in the nucleotide sequence. Nature. 274 (5673), 770-775 (1978).
- Provost, G. S., et al. Transgenic systems for in vivo mutation analysis. Mutat. Res. 288 (1), 133-149 (1993).
- Schaaper, R. M., Danforth, B. N., Glickman, B. W. Mechanisms of spontaneous mutagenesis: an analysis of the spectrum of spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. J. Mol. Biol. 189 (2), 273-284 (1986).
- Schaaper, R. M., Dunn, R. L. Spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. Genetics. 129 (2), 317-326 (1991).
- Burkhart, J. G., Burkhart, B. A., Sampson, K. S., Malling, H. V. ENU-induced mutagenesis at a single A: T base pair in transgenic mice containing phi X174. Mutat. Res. 292 (1), 69-81 (1993).
- Valentine, C. R., et al. Characterization of mutant spectra generated by a forward mutational assay for gene A of Phi X174 from ENU-treated transgenic mouse embryonic cell line PX-2. Environ. Mol. Mutagen. 39 (1), 55-68 (2002).
- Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6674), 193-197 (2000).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Stratagene, Transpack packaging extract for lambda transgenic shuttle vector recovery. Instruction manual. , (2001).
- Stratagene, RecoverEase DNA isolation kit. Instruction manual. , (2009).
- Stratagene, Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay system. Instruction manual. , (1992).
- Nishino, H., Buettner, V. L., Sommer, S. S. Towards validation of the Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay: the mutational spectrum of ex vivo pinpoint mutant plaques. Muta. Res. 372 (1), 97-105 (1996).
- Stuart, G. R., Gorelick, N. J., Andrews, J. L., de Boer, J. G., Glickman, B. W. The genetic analysis of lacI mutations in sectored plaques from Big Blue transgenic mice. Environ. Mol. Mutagen. 28, 385-392 (1996).
- Bielas, J. H., Heddle, J. A. Proliferation is necessary for both repair and mutation in transgenic mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11391-11396 (2000).
- Paashuis-Lew, Y., Zhang, X. B., Heddle, J. A. On the origin of spontaneous somatic mutations and sectored plaques detected in transgenic mice. Mutat. Res. 373 (2), 277-284 (1997).
- de Boer, J. G., Glickman, B. W. The lacI gene as a target for mutation in transgenic rodents and Escherichia coli. Genetics. 148 (4), 1441-1451 (1998).
- Piegorsch, W. W., et al. Study design and sample sizes for a lacI transgenic mouse mutation assay. Environ. Mol. Mutagen. 25 (3), 231-245 (1995).
- Yang, L., et al. Identification of Lin(-)Sca1(+)kit(+)CD34(+)Flt3- short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients. Blood. 105 (7), 2717-2723 (2005).
- Hilbe, J. M. Negative Binomial Regression. second edn. , Cambridge University Press. (2011).
- de Boer, J. G., Provost, S., Gorelick, N., Tindall, K., Glickman, B. W. Spontaneous mutation in lacI transgenic mice: a comparison of tissues. Mutagenesis. 13 (2), 109-114 (1998).
- Huffman, M. D. An improved approximation to-sample poisson test. Appl. Stat. 33 (2), 224-226 (1984).
