Summary
Inchworming is een zeer repetitief synchrone graven motion weergegeven door BTBR T + Itpr 3tf / J (BTBR) muizen wanneer geplaatst in een test kooi met voldoende zaagsel beddengoed. De procedure is een wijziging van de jeugdige sociale interactie protocol en wordt hier gebruikt om herhalende motorische stereotiep om Autisme Spectrum Stoornis relevant beoordelen.
Abstract
Autisme Spectrum Stoornis (ASS) is een gedragsmatig gedefinieerde neurologische aandoening gekenmerkt door verminderde wederkerige sociale interactie, abnormale communicatie, en repetitief gedrag met beperkte belangstelling. Van de diagnose is gebaseerd op klinische criteria, moeten alle mogelijk relevante knaagdier modellen van dit heterogene aandoening ideaal recapituleren deze diverse gedragskenmerken. De BTBR T + Itpr3 tf / J (BTBR) muis is een gevestigd dierlijk model van ASS weergeven herhaald gedrag zoals verhoogde verzorging, alsmede cognitieve starheid. Met betrekking tot sociale interactie en interesse, heeft de jeugd play-test werd toegepast in meerdere knaagdier modellen van ASD. Hier laten we zien dat een repetitieve synchrone graven beweging wanneer BTBR muizen worden getest in een juveniele sociale interactie afgesloten ruimte waarin zaagsel beddengoed, geven ze. Deze herhalende motorische gedrag, aangeduid als "inchworming," werd genoemdvanwege de stereotiepe aard van de bewegingen vertoond door de muizen terwijl horizontaal bewegen over de vloer. Inchworming muizen moeten hun voor-en achterste ledematen gebruiken synchroon met de aanwezige verplaatsen, uitvoeren van ten minste een actieve en een passieve beweging. Hoewel zowel BTBR en C56BL/6J (B6) muizen vertonen dit gedrag, BTBR muizen tonen een significant hogere duur en frequentie van inchworming en een verminderde latentie te leiden inchworming wanneer geplaatst in een bedden behuizing. Wij concluderen dat deze nieuw beschreven gedrag biedt een maatstaf voor een herhalende motorische stereotypy die gemakkelijk kan worden gemeten in diermodellen van ASD.
Introduction
Hoewel de pathofysiologie van autisme spectrum stoornissen (ASS) blijft onduidelijk, diagnose hangt af van de aanwezigheid van drie brede categorieën symptoom: abnormale sociale wederkerigheid, beperkingen in de communicatie, en repetitief / stereotiep gedrag 1. De meeste knaagdier modellen zijn niet in staat om gelijktijdig te reproduceren alle drie symptomen bij een enkel dier. Zo modellen die met zekerheid kan simuleren sommige of alle aspecten van de stoornis houden grote waarde voor de ontwikkeling van doeltreffende preventieve en therapeutische strategieën. Een model dat doet al drie aspecten van ASD weer is het BTBR muis 1,2.
In combinatie met ultrasone geluiden en sociale aanpak testen, is de jeugdige sociale interactie testen vaak gebruikt om muismodellen van pediatrische ASD karakteriseren; Deze tests meten daalde en abnormale sociale gedragingen die kerneigenschappen van ASD vertegenwoordigen. Naast de juveniele sociale interactie test, vele andereproeven zijn gebruikt om stereotype gedrag meten diermodellen van ASS. Bijvoorbeeld, de marmeren begraven test, die de neiging van een dier strooisel verplaatsen met de snuit en voorpoten in het werk om een object te dekken onderzoekt, wordt gedacht dat dwangmatige stereotypische gedragingen die optreden als gevolg van aversieve stimuli 3,4 meten. Daarom hebben graven testen uitgevoerd om dit repetitief gedrag bij ASS diermodellen en verschillende soorten knaagdieren 3,5-7 kwantificeren. Graven gedrag worden gedefinieerd als voor de hand liggende gerichte acties van de snuit of poten te strooisel verdringen en zijn hypothese een gevoelige parameter van herhalende motorische gedrag 4 zijn.
Hier melden wij een nieuw type van graven, die we "inchworming," hebben genoemd in de BTBR stam van muizen. De karakterisering van deze nieuwe gedrag kan een robuuste maatregel van herhalende motorische gedrag dat kan worden gebruikt voor verdere val biedenidation van knaagdier modellen zoals ASS, Huntington Disease of obsessief dwangmatig gedrag 8,9. Wij "inchworming" ten minste een synchrone beweging van de voor-en achterpoten ledematen binnen gevolgd door een synchrone beweging buiten die leidt tot de verplaatsing van strooisel. Dit verschilt van de typische graafgedrag op vele manieren. Eerst wordt de inchworming gedrag meestal waargenomen als een combinatie episodes plaats van een geïsoleerde gebeurtenis. Daarentegen kan graven optreden als gebundeld beweging van ofwel de achterpoten of voorpoten 3. Bovendien inchworming bewegingen meestal horizontaal plaatsvinden over de leefruimte in tegenstelling tot de stationaire posities die kenmerkend graven gedragingen. Ten slotte is de inchworming gedrag hieronder beschreven komt vaak voor bij de BTBR inteeltstam van muizen, maar wordt zelden genoemd in de B6 controle stam, terwijl typische graafgedrag zijn gemeenschappelijk in B6 en BTBR stammen van muizen
Gezien het feit dat marmer begraven, graven, en juveniele speelwaarde hebben vastgesteld voor het meten van abnormaal gedrag in muismodellen van ASD, de inchworming gedrag vult deze eerder gedefinieerde metingen van stereotiep gedrag. Met name de inchworming gedrag een bruikbare maat voor lagere orde motor stereotiep die gewoonlijk worden geïdentificeerd ASD 8,11. Bovendien kan deze nieuwe inchworming procedure onderzoekers een extra waardevol instrument voor de analyse van zich herhalende motorische gedrag aan ontwikkelingsstoornissen zoals ASS relevant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Canadese Animal Care Comite gedragen en door de Universiteit van Calgary Animal Care Comite goedgekeurd.
1. Bereiding van dieren
- Isoleer muizen overnacht (12 uur) voor de test. Om dit te doen, plaatst alle BTBR en B6 muizen (P35-P40) die nodig zijn voor experimentele analyse in kooien op zich de dag voor het testen.
- Plaats de geïsoleerde muizen in de gedragsanalyse kamer 30 min voorafgaand aan het testen, zodat dieren wennen aan de nieuwe omgeving.
2. Apparatuur voorbereiding
- Plaats de 30 x 30 cm Plexiglas box met een verwijderbaar deksel in de testkamer. Plaats de doos op een tafel en plaats de videocamera op een hoek van 45 ° van de bodem; deze plaats van de camera visualisatie van de gehele vloer van de ruimte en de muis mogelijk. Gebruik een infrarood-backlight te helpen minimaliseren schittering van de muur vande doos.
- Gebruik een videocamera die een hoge zoomfunctie bezit met infrarood mogelijkheden om het filmen te optimaliseren in een lage lux omgeving. De focus van de camera op de behuizing het beeld te vergroten, zodat de muizen worden gevisualiseerd in het hele vak.
- Bedek de hele bodem van de doos met zaagsel beddengoed (moet ongeveer 1 cm diep).
3 Testing Procedure
- Plaats een intra-stam paar muizen (BTBR - BTBR of B6-B6) binnen het testen behuizing.
- Schakel het licht uit in de testkamer.
- Start de video camera op te nemen en verlaat de kamer. Dit experimentator invloed op het gedrag van de muizen te verhinderen. Noteer de activiteit 11 min.
- Zodra de registratie is voltooid, opnieuw in te voeren de testkamer en de terugkeer van de muizen naar hun oorspronkelijke thuis kooien.
- Gooi het zaagsel beddengoed, was het gehele testproces doos met 70% ethanol, en leg nieuwe zaagsel beddengoed in de bodem van de testenbehuizing.
- Herhaal de gehele procedure voor de rest van de intra-vlek paren en terug de muizen om hun oorspronkelijke kooien.
Opmerking: Om de betrouwbaarheid van de inchworming gegevens te controleren, kan de procedure worden herhaald op de volgende dagen met verschillende BTBR-BTBR en B6-B6 paar combinaties. Dit zorgt ervoor dat het waargenomen gedrag niet afhankelijk van de specifieke partner in de ruimte, maar de inchworming individu.
4. Data Analysis
- Inchworming wordt gedefinieerd als de synchrone en afvoer van het dier voor-en achterbenen-meter, met een minimum van een co-voorkomende actieve en daaropvolgende beweging naar buiten die effectief verplaatst het beddengoed. Handmatig kijken en scoren elke video twee keer (een keer voor elke muis) om de totale duur, de frequentie en latency na te gaan in inchworm in de 10 minuten video. Handmatig scoren van inchworming duur, frequentie en latency moeten worden gebaseerd op de following definities:
Inchworming Duur: wordt gedefinieerd als de totale tijd elke muis is ingezet in de inchworming gedrag. Om dit aspect van inchworming scoren, gebruik maken van een timer die kan worden gestart en gestopt. Start timing wanneer de muis begint te inchworm en stoppen van de timer wanneer de muis stopt inchworming. Wanneer en als de muis weer begint te inchworm, herstart en opnieuw stop de timer. Herhaal het starten en stoppen van de timer voor de duur van 10 min observatieperiode telkens de muis inchworms. Dit zal een inchworming duur score die 0:00-10:00 min te genereren.
Inchworming Frequentie: wordt gedefinieerd als het aantal malen de muis neemt in de inchworming gedrag in de 10 min. observatieperiode. Een enkele telling wordt toegekend telkens wanneer de muis starts en stops inchworming. De inchworming frequentie score zal een getal tussen 0 en ∞.
Latentie Inchworm: wordt gedefinieerd als de tijd ebij gaat voordat het eerste begin van inchworming. Start de timer wanneer de video begint, deze keer 00:00, en stopt de timer wanneer de muis inchworms voor de eerste keer. Als de muis de inchworming gedrag niet wordt weergegeven de latency te inchworm zal zijn 10:00. Bij het analyseren van latentie te inchworm, zal een score 0:01-10:00 min worden verkregen. Muizen die niet inchworm voor de duur van de testperiode moet het monster populatie worden verwijderd zodat de resultaten zijn relevant voor een populatie van muizen die de inchworming gedrag vertonen. - Bereken de totale frequentie en duur van inchworming voor elke muis in de video. Bereken de benodigde tijd voor de eerste muis van het paar inchworm de latentie inchworm voor die specifieke paar muizen. Deze parameters zijn gebaseerd op voorafgaande methodologische werkzaamheden die verband houden met repetitieve graven gedrag bij muizen 6.
- Bereken de gemiddelde duur, de frequentie,en latency te graven voor elke experimentele groep in de analyse (dwz BTBR vs B6). Gebruik een ANOVA of een t-test om gegevens tussen stammen / experimentele groepen te vergelijken.
Opmerking: Wanneer de procedure is voltooid op een tweede dag, gebruik dan een herhaalde metingen ANOVA om ervoor te zorgen dat er geen verdere effecten proef of pairing effecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De aangepaste versie van de jeugdige play-test hier beschreven kan worden gebruikt om te observeren en analyseren van de roman repetitieve graafgedrag genoemd inchworming. Inchworming wordt tentoongesteld in veel grotere mate door BTBR muizen dan B6 controles. In een typische 10 min sessie, zal BTBR muizen de verschillende inchworming gedrag vertonen (synchroon-en afvoer van de poten in een poging om het zaagsel beddengoed verdringen) gedurende ongeveer 5 minuten, of de helft van de observatieperiode. Bovendien, de latentie om inchworm significant korter voor BTBR muizen - ze meestal beginnen inchworming binnen de eerste 10 seconden na het begin van de opgenomen sessie. In tegenstelling, de controle muizen (B6) een gemiddelde latency naar inchworm van 4 min en besteden zeer klein deel van hun tijd daadwerkelijk tonen van het gedrag. Deze bevindingen komen overeen met gegevens uit eerdere studies repetitieve graafgedrag bij knaagdieren 3,6.
Figure 1 toont de juiste experimentele opstelling voor testprocedures. Figuur 2 toont de gemiddelde inchworming duur (A), frequentie (B) en latentie (C) aan inchworm voor BTBR muizen en controle B6 stam. Alle parameters waren significant verschillend tussen de stammen. In het experiment hier gemeld, was de inchworming proef toegediend over een 2-daagse proefperiode, met alternatieve indelingen in de tweede dag, en de resultaten van elke dag werden vergeleken. Geen significante verschillen werden gevonden, waardoor de effecten waren niet afhankelijk van hetzij specifieke muis paringen of de herhaling van de test. Tenslotte Figuur 3 bevat nog steeds foto's van verschillende muizen die zich bezighouden met de twee belangrijkste componenten van de inchworming gedrag.
Figuur 1. Apparatuur opgezet voor de inchworming experiment. Apparatuur opgezet voor de inchworming experiment. Een doos 30 cm kubus plexiglas ligt op een tafel voor een infrarood zoom camera gepositioneerd op een hoek van 45 °. De bodem van de behuizing is volledig bedekt met een gelijkmatige laag van ten minste 1 centimeter zaagsel.
Figuur 2. Gemiddelde inchworming duur, frequentie en latency weergegeven door paren BTBR en B6-muizen. Het BTBR (n = 8) en B6 (n = 8) muizen werden getest bij P35-P40 over een tweedaagse testperiode en verkleint inchworming gedrag. A) De BTBR-stam vertoonde een significant langere gemiddelde duur van inchworming dan de B6 controlestam (p <0,001). B) De BTBR-muizen toonde een significantly hogere frequentie van inchworming in vergelijking met B6 controles (p <0,001). C) was er een significant verschil in BTBR (n = 8) en B6 (n = 7) latentie te graven met BTBR tonen een duidelijke afname in de tijd nam het gedrag weer tegenover B6 controles (p = 0,001).
Figuur 3. Illustratieve vertegenwoordiging van verschillende muizen in beide aspecten van de inchworming gedrag. Het bovenste paneel is een voorbeeld van muizen in de extensiefase van de inchworming gedrag, terwijl het onderste paneel is een voorbeeld van muizen in de contractiefase van de inchworming gedrag . Inchworming wordt gedefinieerd als de synchrone inkomende en uitgaande synchrone beweging van de voor-en achterpoten van de muis beddengoed verplaatsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inchworming is een nieuwe maat repetitieve gedrag dat kan worden gebruikt om vele aandoeningen die stereotiep zoals ASS vertonen bestuderen. Er zijn 4 stappen die van groot belang voor het genereren betrouwbare inchworming gegevens van de gewijzigde juveniele sociale interactie protocol: 1) de verlengde afzonderingsperiode is essentieel voor de inchworming testen en niet van het protocol worden verwijderd of ingekort. Deze eis is specifiek proeven op inchworming paarsgewijs beschreven. 2) De videocamera vereist een degelijk geplaatst en gericht, zodat de muizen volledig kan worden gevisualiseerd in het gehele plexiglas behuizing. 3) De behuizing moet grondig worden gereinigd tussen testen paren dat de huidige gedrag niet beïnvloed door geuren van het voorafgaande paar muizen. 4) Het beddengoed materiaal voor de behuizing moet voldoende zijn (~ 1 cm diep) en moet zaagsel zijn; muizen niet de inchworming gedrag vertonen met weinig / geen beddengoed of wanneergeplaatst op andere strooisel.
Hoewel hier niet beschreven, hebben we inchworming door een niet-geïsoleerde, sociaal gehuisvest BTBR muizen alleen (niet in paren) op een soortgelijke bedden behuizing geplaatst waargenomen. Onder deze omstandigheden, de BTBR muizen nog inchworm, maar met een lagere frequentie en duur, hetgeen aangeeft dat de inchworming gedrag een stereotiep gedrag mogelijk geïnduceerd door sociale angst (gegevens niet getoond). Echter, gezien het feit dat studies er niet in geslaagd om op betrouwbare wijze te tonen verschillen in angst tussen de BTBR en B6 controle muizen, angst is waarschijnlijk een interactie met andere factoren om dit gedrag 12 induceren. De focus van dit methodologische artikel was de gestandaardiseerde wijziging van de juveniele sociale interactie protocol omdat ontlokt gedrag snel en betrouwbaar, met dramatische verschillen tussen BTBR en B6 muizen. Daarnaast worden gegevens verzameld van twee dieren in een keer, waardoor de hoogteatie opgedaan uit elke testperiode. In ons laboratorium is het inchworming gedrag alleen bevestigd in de leeftijd van P35-P55. Hoewel het mogelijk is dat muizen jongere en oudere dit repetitief gedrag vertonen, kan niet identificeren inchworming bij andere leeftijden aan dat het gedrag specifiek voor adolescenten en jonge volwassen muizen.
De gegevens uit dit experiment geven duidelijk aan dat de BTBR muizenstam houdt zich bezig met de repetitieve inchworming gedrag sneller, vaker en voor langere duur dan de B6 controles. De inchworming gedrag kan daarom voorzien onderzoekers met een nieuwe maatregel van repetitief gedrag in andere ASS en ziekte modellen. Hoewel het nog niet duidelijk wat drijft deze repetitieve graven beweging BTBR muizen ook weer hogere niveaus van zelf-verzorging en sociale vermijding 1, 9. Als graven is een aangeboren genetisch gereguleerd eigenschap in muizen, kan het testen van de inchworming gedrag be gemakkelijk toegepast op andere stammen en heeft het potentieel om een waardevol instrument voor de beoordeling van de motor stereotiep en dwangmatig gedrag in andere ziekte modellen.
Een van de keurmerk gedragskenmerken dat ASD karakteriseren is repetitief gedrag met beperkte belangen 9. Naast benadrukkend een waardevolle motor stereotypie, heeft dit experiment de geldigheid van de BTBR muismodel van ASS verhoogd tonen extra repetitief gedrag vergelijkbaar met de klinische presentatie van de motor stereotiep bij ASS patiënten. Inchworming wordt in zowel de BTBR (ASD) B6 muizen en controlemuizen, maar het gedrag relatief zeldzaam in B6-muizen. Het gedrag dat het meest lijkt inchworming graaft gedrag bij knaagdieren. Thomas et al.. 4 suggereert dat voor knaagdieren, graven serveert een verscheidenheid aan functies, waaronder opslag van voedsel, roofdier fraude, en bescherming tegen aversieve omgevingen. Omdat deze functies niet negEssary in het laboratorium setting, muizen die hoge niveaus van graven gedrag vertonen kunnen vervullen van een dwangmatige gedrag behoefte 4. Bovendien Silverman et al.. 9 stelt graven gedrag in de analyse van de juveniele sociale interactie test als een maat voor niet-sociale activiteit worden opgenomen.
Samengevat, inchworming is een zeer herhaald gedrag significant vaker voor in BTBR muizen (een model van ASS) in vergelijking met B6 muizen (controle-stam). Hoewel de etiologie van het gedrag is momenteel niet bekend is, kan het een waardevolle bron voor onderzoekers onderzoeken dwangmatigheid en herhaling in knaagdier modellen van vele ziekten. De procedurele technieken zijn eenvoudig en kan worden aangevuld met gemak in een 24-uurs periode. Gegevensanalyse is complexer en tijdrovend, maar video-opname van de testprocedure kan de onderzoeker de analyse off-line te voltooien en herhaaldelijk te interbeoordelaar consistentie enbetrouwbaarheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar voor de technische en logistieke steun en expertise uit door Rose Tobias, Younghee Ahn, en David N. Ruskin. Het hier beschreven onderzoek werd gefinancierd door de Alberta Children's Hospital Foundation en Alberta Children's Hospital Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 cm X 30 cm Plexiglas box with lid | Can be constructed | ||
| IR Camera | Survshop (Calgary, Alberta) | Sony CCD Camera DP955V- 30’ Infrared Armor Dome | Find a camera with high-resolution and zoom capabilities |
| DVR | Supercircuits (Austin, Texas) | BLACK Enterprise-Class 4-Channel H.264 security DVR with DVD Burner | High data capacity |
| Sawdust | Same as bedding material |
References
- McFarlane, H. G., Kusek, G. K., Yan, M., Phoenix, J. L., Bolivar, V. J., Crawley, J. N. Autism-like behavioral phenotypes in BTBR T+tf/J mice. Genes, Brain, and Behavior. 7, 152-163 (2008).
- Crawley, J. N. Designing mouse behavioral tasks relevant to autistic-like behaviors. Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews. 10 (4), 248-258 (2004).
- Deacon, R. Digging and marble burying in mice: simple methods for in vivo identification of biological impacts. Nature Protocols. 1 (1), 122-124 (2006).
- Thomas, A., Burant, A., Bui, N., Graham, D., Yuva-Paylor, L. A., Paylor, R. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology. 204, 361-373 (2009).
- Dudek, B. C., Adams, N., Boice, R., Abbott, M. E. Genetic influences on digging behaviours in mice (Mus musculus) in laboratory and seminatural settings. Journal of Comparative Psychology. 97 (3), 249-259 (1983).
- Webster, D., Williams, M. H., Owens, R., Geiger, V., Dewsbury, D. A. Digging behavior in 12 taxa of muriod rodents. Animal Learning and Behavior. 9 (2), 173-177 (1981).
- Pobbe, R. H., Pearson, B. L., Defensor, E., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Expression of social behaviours of C57BL/6J versus BTBR inbred mouse strains in the visible burrow system. Behavioural Brain Research. 214, 443-449 (2010).
- Lewis, M. H., Tanimura, Y., Lee, L., Bodfish, J. Animal models of restricted repetitive behavior in autism. Behavioural Brain Research. 176, 66-74 (2007).
- Silverman, J. L., Yang, M., Lord, C., Crawley, J. N. Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nature Reviews. 11, 490-502 (2010).
- Deacon, R., Rawlins, J. Hippocampal lesions, species-typical behaviours and anxiety in mice. Behavioural Brain Research. 156, 241-249 (2005).
- Pearson, B. L., et al. Motor and cognitive sterotypies in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. Genes, Brain, and Behavior. 10, 228-235 (2011).
- Pobbe, R. H., Defensor, E., Pearson, B. L., Bolivar, V. J., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. General and social anxiety in the BTBR T+ tf/J mouse strain. Behavioural Brain Research. 216 (1), 446-451 (2011).
