قياس إجمالي الكالسيوم في الخلايا العصبية بواسطة الكترون مسبار الأشعة السينية التحليل المجهري

Summary

وتصف هذه الورقة تطبيق cryoanalytical المجهر الإلكتروني لقياس الكمي من مجموع محتوى الكالسيوم وتوزيعه في قرار التحت خلوية في العينات البيولوجية المحددة من الناحية الفسيولوجية.

Abstract

في هذه المقالة موصوفة الأدوات والتقنيات والأدوات المناسبة لقياس الكمي للمحتوى عنصري داخل الخلايا باستخدام تقنية تعرف باسم المسبار الإلكترون التحليل الدقيق (EPMA). Intramitochondrial الكالسيوم هو التركيز بشكل خاص نظرا للدور الحيوي الذي تلعبه الزائد الكالسيوم الميتوكوندريا في أمراض الاعصاب. ويستند الأسلوب على تحليل الأشعة السينية ولدت في المجهر الإلكتروني (EM) من خلال التفاعل بين شعاع الالكترون مع العينة. من أجل الحفاظ على التوزيع الأصلي من عناصر إنتشاري في الإلكترون المجهري العينات، يتطلب EPMA "cryofixation" من الأنسجة يليها إعداد cryosections سامسونج. ويتم تجميد السريع للخلايا المستزرعة أو الثقافات شريحة عضوي النمط من قبل يغرق في الإيثان السائل تجميد أو عن طريق البطولات الاربع تجميد ضد كتلة معدنية باردة، على التوالي. Cryosections أبعاده يتم قطع 80 نانومتر سميكة جافة بسكين الماس في كاليفورنيا. -16076؛ C، التي شنت على الكربون / المغلفة pioloform شبكات النحاس، وcryotransferred في البرد EM باستخدام حامل cryospecimen المتخصصة. بعد المسح ورسم الخرائط البصرية في موقع ≤ -160 درجة مئوية، والإلكترون جرعة منخفضة، cryosections المجمدة رطب هي في -100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ~ تجميد المجفف. وتسجل الصور على مستوى عضية من cryosections المجففة، وأيضا في جرعة منخفضة، عن طريق كاميرا CCD بطيئة مسح والمناطق التحت خلوية من الفائدة المحددة للتحليل. يتم جمع الأشعة السينية المنبعثة من رويس من قبل ثابتة ومركزة وعالية الكثافة التحقيق الإلكترون عن طريق الأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDX) مطياف، التي تتم معالجتها بواسطة الإلكترونيات المرتبطة بها، وقدم بوصفه الطيف بالأشعة السينية، وهذا هو، مؤامرة من كثافة الأشعة السينية مقابل الطاقة. برامج إضافية تسهل: 1) تحديد مكونات عنصري بحكم "مميزة" الطاقات الذروة وبصمة؛ و 2) التحليل الكمي من خلال استخراج المناطق الذروة / الخلفية. ويختتم هذه الورقة مع اثنين من الأمثلة التي توضح نموذجيةتطبيقات EPMA، واحدة في التي وفرت تحليل الكالسيوم الميتوكوندريا البصيرة الحاسمة في آليات الاصابة excitotoxic المواد وآخر كشفت أساس مقاومة نقص التروية.

Introduction

أيونات الكالسيوم ويمكن القول إن الكيان إشارة الخلية الأكثر أهمية وتنوعا في علم الأحياء، ولعب دورا أساسيا في العمليات العادية متنوعة مثل انتقال متشابك والتعبير الجيني. من ناحية أخرى، والكالسيوم المهم أيضا في موت الخلايا. على وجه الخصوص، ورفع القيود الكالسيوم هو عامل أساسي في الإصابة العصبية في المخ والشلل الرعاش والزهايمر والأمراض العصبية الأخرى ^3،5. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن نفهم كميا كيفية توزيع الكالسيوم داخل الخلايا، وكيف يتغير هذا المنبهات الفسيولوجية التالية أو المرضية في جسم المريض. معقد هذا الهدف من خلال حقيقة أن الكالسيوم يتم توزيعها بشكل حيوي بين دولتين المادية - الحرة في حل أو منضما إلى الركيزة - وأن تركيزات الكالسيوم الخلوية تغيير على مدى عدة أوامر من حجمها نتيجة التحفيز.

في حين أن هناك العديد من المنهجيات المتقدمة المتاحة لتحليل الابهه الكالسيوم داخل الخلايا، وتحديد تركيزات الكالسيوم الكلي في حجرات داخل الخلايا المحددة يقتصر واقعيا لنهج واحد، وهما الإلكترون التحقيق التحليل الدقيق (EPMA). EPMA هو الاسلوب الذي الأزواج مطياف الأشعة السينية إلى المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). بندقية الإلكترون تيم يركز على القرطاسية وsubmicron التحقيق الإلكترون على المنطقة التحت خلوية من الفائدة والأشعة السينية المنبعثة عنصر محددة نتيجة القصف الإلكترون يتم جمعها وتحليلها (انظر المراجع ^{7، 4} للاستعراضات الفنية التفصيلية). وتشمل مزايا EPMA القرار على مستوى عضية واحدة وحساسية submillimolar. في الممارسة العملية، ومع ذلك، يتطلب EPMA cryotechniques المتخصصة والأجهزة لإعداد العينات وتحليلها. هنا، يتم وصف الأدوات والتقنيات والأدوات المناسبة لقياس الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام EPMA. Intramitochondrial الكالسيوم ط خاصةnterest بسبب الدور الحاسم الذي الميتوكوندريا المسرحيات الزائد الكالسيوم في أمراض الاعصاب.

Protocol

وقد تم تطوير النهج وصفها هنا باستخدام أدوات معينة والأدوات والبرمجيات. لأن مختبرات لن يتم استخدام نفس الإعداد التجريبية وتعميم النهج حيثما كان ذلك ممكنا.

1. التجميد السريع

الطريقة التحليلية إلى وصفها على الاطلاق يعتمدون على نهج المبردة من أجل: 1) "cryofixation" من الخلايا أو الأنسجة بطريقة تحافظ على كميا توزيع مكونات الأنسجة إنتشاري والعناصر الكيميائية كما كانت في الخلايا الحية في لحظة من تجميد ، و 2) إعداد سامسونج cryosections مناسبة للتصوير والتحليل في TEM. يتم وصف هذه التقنيات لفترة وجيزة هنا، ولكن التفاصيل اللازمة لإنتاج هذه الإجراءات في المختبرات الأخرى خارج نطاق هذا المقال. ويشار إلى قراء المهتمين المقالات الأخيرة ممتازة ^9،14.

الحذر: يصف هذا القسم استخدام LIQUefied الإيثان، والتي هي شديدة الاشتعال وقابلة للانفجار، وينبغي اتخاذ الاحتياطات المناسبة. يجب أيضا أن يكون المشغل دراية النيتروجين السائل (LN ₂₎ احتياطات السلامة، بما في ذلك معطف المختبر الواقية، والنظارات، والقفازات cryoresistant. ملاحظة: هنا وطوال، وجميع الأدوات (ملقط، الخ) تستخدم لمعالجة يجب precooled العينات المجمدة في LN ₂ قبل استخدامها لتجنب ذوبان عرضي.

الخلايا المستزرعة coverslips على

1. إعداد جهاز تجميد يغرق بواسطة التكثيف الإيثان الغازي في -160 درجة مئوية في LN ₂ تبرد جيدا المركزية. ملء إلى العلامة وتغطية جيدا مع غطاء الألومنيوم التمحور عندما لا تكون قيد الاستعمال.
2. باستخدام أسافين رقة الترشيح، وصمة عار coverslips البلاستيك من الخلايا المستزرعة تحت تجريبيا الظروف المناسبة لفيلم مائي رقيقة. وصمة عار من الحافة وذلك لتجنب لمس الأنسجة؛ الفيلم المتبقية مثالية، والتي تحددها التجربة والخطأ، رقيقة قدر الإمكان ولكن ليس ذلك الفي لتتبخر والسماح تجفيف سطح الأنسجة.
3. عقد ساترة على حافة مع ملقط لقط، تزج بسرعة في الإيثان السائل، إما يدويا أو باستخدام المكبس بالطاقة الجاذبية.
4. وضع ساترة المجمدة في وعاء الستايروفوم القريبة LN _2، كبيرة بما يكفي لمعالجة العدد المطلوب من coverslips في حاويات التخزين الطويل الأجل. ينصح علب الألومنيوم كأب المسمار الذي لا اغتنام تحت LN _2.

تجميد السريع للشرائح الدماغ مثقف

5. تحت المجهر تشريح، وعرض وتوجيه شريحة الحصين عضوي النمط، دون عائق ولا تزال تعلق على إدراج الغشاء الثقافة. وضع علامات إيمانية على الغشاء بالقرب من حافة شريحة مع الأسود شربي من نوع القلم والصورة.
6. لا يزال تحت المجهر، وقطع تقريبا. 5 × 5 مم الساحات الغشاء مع شرائح الفردية تركز على المربعات. تجنب لمس شريحة أو الانحناء MEMBRANه.
7. جبل شريحة المدعومة من الغشاء، خففت من قبل ¼ في لوحة أجار قطر، على قرص الألمنيوم مصممة خصيصا لتناسب على cryoultramicrotome (موضح أدناه). بسرعة تجميد شريحة عن طريق دفع هوائيا ضد كتلة الياقوت LN ₂ المبردة عن طريق "تجميد البطولات الاربع" الجهاز حسب الطلب.
8. الانتقال إلى تخزين كما هو موضح للخلايا المستزرعة.

2. Cryosectioning

التحذير: إنتاج بنجاح الجافة قطع شرائط من المقاطع سامسونج، في حين واضحة ومنطقية، يتطلب التدريب والممارسة والصبر الكبير.

1. خبز خارج cryoultramicrotome مجهزة cryoattachment وبارد ل-135 درجة مئوية.
2. قطع coverslips المجمدة في تقريبا. 3 × 3 مم الساحات باستخدام حادة، مشرط precooled. تضمين القطع مع الثقافات مواجهة في سائل لزج "cryoglue" (أ 1:06 خليط من الإيثانول و 2 بروبانول ^11)، على مستوى 3مم دبابيس الألمنيوم قطرها مصممة لتناسب العينة تشاك مشراح. تجنب تسرب cryoglue على سطح الثقافة. يصلب cryoglue عن طريق خفض درجة الحرارة إلى cryobox ≤ -160 درجة مئوية.
   • لشرائح الدماغ المجمدة، ونعلق بشكل آمن مباشرة إلى أقراص عينة تشوك حسب الطلب عن طريق طوق المسمار.
3. تقليم مناطق مختارة من العينات المجمدة - على سبيل المثال مناطق خلايا غنية من القطع ساترة أو المناطق التي تم تحديدها من شرائح - إلى تقريبا. 250 × 250 ميكرون مواجهة كتلة و~ 100 عمق ميكرومتر باستخدام أداة الماس التشذيب.
4. جاف قطع شرائط من الشرائح الرقيقة في كاليفورنيا. -160 درجة مئوية باستخدام 35 ° الماس cryoknife، كما وصفها أساسا في referencs ^{4، 9.} ويتم تحديد سرعة القطع وسكين زاوية الخلوص تجريبيا؛ نقطة انطلاق جيدة هو 0.4-0.6 ملم / ثانية في 9 درجة. سمك الاسمية، أي عينة مسبقا، من أقسام رطب طق 80 نانومتر عادة، على الرغم من المقاطع هي في الواقع 1.5-2.0X سمكا، ويرجع ذلك أساسا إلى الضغط. لباجتزاء مرضية، جهاز التحجر أمر ضروري. وضع غيض المؤينة الجهاز 0.5-1 سم من حافة سكين وضبط انتاج الطاقة حتى يتم إنتاج أشرطة مرضية من أقسام.
5. إعداد تحقيقات رمش من قبل الإلتصاق (مع الايبوكسي) الرموش لقضيب العصي الخشبية. استخدام مثل هذا التحقيق، والتقاط ونقل أقسام من الجزء الخلفي من السكين على توهج تصريفها، والأفلام دعم pioloform المغلفة الكربون يلقي أكثر من 100 شبكة الشبكات للطي النحاس ويستريح على الإنديوم احباط المغلف نصف مطوية على رف وراء العمل السكين. أضعاف خلال النصف العلوي من الشبكة والمغلف، اضغط مع أداة إلحاحا الباردة.
6. نقل شبكات ملفوفة إلى مربع الشبكة مريحة وتخزينها في الألومنيوم ويمكن موضح في الخطوة 1.4.

3. Cryotransfer العينات إلى المجهر الإلكتروني

الصك الأساسي لEPMAفي هذا المختبر هو المجهر الإلكتروني التحليلية تعمل في 120 كيلو فولت ومجهزة لcryomicroscopy، وهذا هو، مصممة مع فراغ نظيفة، anticontaminator عينة منطقة، و2K العاشر 2K ذات حساسية عالية والكاميرا الرقمية وحامل cryotransfer العينة. التحقق مسبقا محاذاة المجهر وظروف التشغيل في كل من وسائط المنخفضة والعالية التكبير وتأكيد عمود فراغ مرضية، من الناحية المثالية ≤ 10 ^-7 عربة. تصل قيمتها حسب الضرورة.

1. تؤكد أن عزل فراغ المكون ديوار من cryoholder مرضية. ضخ حسب الضرورة.
2. تبريد cryoholder إلى الحد الأدنى درجة حرارته، -160 ° م على الأقل، في حين ظل فراغ عالية ضمن المرحلة المجهر؛ فصل الكابل الذي يربط بين حامل لمربع سيطرتها. إمالة مقياس الزوايا 45 درجة في اتجاه عقارب الساعة قبل إزالة حامل لتقليل LN ₂ إراقة على المشغل والمجهر السطوح.
3. إعداد cryoworkstation الفوق عن طريق التبريد في عزل لا يتجزأد الكأس ل≤ 160 درجة مئوية.
4. نقل (quickly!) وcryoholder تبريد من البرد المجهر لمحطة العمل. التراجع الصقيع درع حاملها.
5. استرداد تحت LN ₂ شطيرة من شبكة التخزين ومكان على الطاولة عمل cryoworkstation. يتم وضع خاتم الاحتفاظ لصاحب العينة وكذلك أيضا على الطاولة.
6. فتح المغلف الإنديوم ونقل الشبكة للطي المغلقة إلى البئر عينة من cryoholder. تأمين الشبكة مع الإبقاء على عصابة باستخدام أداة البراغي المقدمة وإغلاق الدرع الصقيع.
7. بسرعة إزالة cryoholder من cryoworkstation وإدخاله في غرفة معادلة الضغط المجهر وتذهب من خلال تسلسل الضخ في أسرع وقت ممكن. على الإدراج، ينبغي أن يكون هناك أقل قدر من الاضطراب في فراغ العمود.
8. العودة مقياس الزوايا إلى 0 درجة الميل. إعادة الاتصال وإعادة تنشيط مربع التحكم والتأكد من أن درجة حرارة العينة و≤ 150 درجة مئوية.
9. إعادة ملء ديوار للعينة حامل والسماح فراغ ودرجة الحرارة حتى يتعافى تماما.

4. المسح البصري للأقسام

1. سحب الدرع من الصقيع حامل لفضح العينة وبدوره على شعاع الالكترون.
2. تقييم بصريا العينة في تضخم منخفض، وعادة 250X، وإضاءة منخفضة. كما هو موضح في الشكل 1، وينبغي أن تكون المقاطع رقيقة وناعمة، وليس مطوية أو متداخلة، مسطحة وتعلق بشكل جيد لدعم الفيلم، وعموما لا تحجب قضبان الشبكة.
3. اختياريا تصوير المقاطع المحددة. (ملاحظة: تصغير التعرض شعاع، منذ أقسام المجمدة رطب معرضة جدا للضرر الناجم عن شعاع.) استخدم الآلي المرحلة مقياس الزوايا الرقمية لتخزين إحداثيات المقاطع المحددة.

5. تجميد التجفيف الأقسام

1. تجميد الجافة عن طريق زيادة درجة الحرارة أقسام حامل لكاليفورنيا. -100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ~.
2. Recool حامل ل-160 درجة مئوية أو أقل.

6. التصوير من الخلايا والعضيات

ويتم الحصول على الصور الهيكلية للأقسام تجميد المجفف في كاليفورنيا. -160 درجة مئوية كما جرعة منخفضة والصور صفر الخسارة المسجلة رقميا باستخدام كاميرا CCD بطيئة مسح 2K العاشر 2K تسيطر عليها البرامج المناسبة.

1. تفعيل EM في وضع مرحبا-ماج.
2. اختيار والصورة في ~ 2،000 X (كما المشاجرات، انظر الشكل 2) الخلايا المحددة والمناطق التحت خلوية من الاهتمام في أقسام ذات الجودة العالية التي تم تسجيلها وتخزينها مسبقا المواقع. (ملاحظة: المقاطع المجففة هي الآن إلى حد كبير أقل هشاشة وأقل عرضة للضرر شعاع الإلكترون.
3. تقييم الصور من أجل تحديد المناطق ذات الاهتمام (رويس) لتحليل الأشعة السينية. يمكن اختياريا هذه الخطوة أن يؤديها خارج الخط، وفي هذه الحالة يمكن أن تحول EMقبالة والعينة يسمح لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة.

7. اقتناء أشعة الأطياف

يمكن تسجيل أطياف الأشعة السينية باستخدام أي من عدة تجارية أو مصمم خصيصا الأشعة السينية نظم تحليل تتألف بالحد الأدنى من الأشعة السينية (EDX) للكشف عن التشتت الطاقة، ويرتبط الالكترونيات نبض المعالج واقتناء وعرض برنامج متوافق. (يوصف النظام المستخدم في هذا المختبر في الجدول 1.)

1. تكوين EM لاقتناء الأشعة السينية عن طريق إدراج كاشف EDX في العمود (إذا لزم الأمر)، سحب الفتحة الهدف، وإدراج وتركز أي فتحات الإشعاع طائشة. ضبط cryoholder إلى أدنى درجة الحرارة التي يتم تجنب تلوث الصقيع من العينة، ولكن على الأقل أقل من -100 درجة مئوية.
2. إمالة صاحب 20 درجة نحو كاشف.
3. في ظل ظروف التصوير واسعة المجال، وعلى افتراض واحد وتعتزم لتحليل مصفوفة من individuaل الميتوكوندريا، واختيار الحبيبات الخيطية للتحليل، نقله إلى وسط الميدان والتركيز.
4. اذهب إلى وضع بقعة (على بعض المجاهر فقط تتلاقى باستخدام شعاع التركيز المكثف الثاني) وزيادة شعاع الحالي لكاليفورنيا. 3 غ (مقاسا مع فنجان فاراداي أو ما شابه) في بقعة 100 نانومتر.
5. إطلاق برنامج الحصول على الطيف وتبدأ عمليات الاستحواذ 100 ثانية، والتي يمكن الاطلاع الوقت على الهواء مباشرة على شاشة العرض. حفظ الطيف سجلت (الشكل 2). ويفضل تنسيق EMSA معايير الصناعة.
6. اغلاق EM ونقل الملف متعددة الأطياف (ق) إلى (حاليا) تحليل محطة العمل.

8. تحليل أطياف الأشعة السينية

التحليل النوعي

الطيف EDX (الشكل 2، الشكل) هو في الأساس مؤامرة س ص كثافة الأشعة السينية مقابل الطاقة. أطياف تحتوي على معلومات نوعية وكمية عن التركيب العنصري رحلل الحجم، في أن الطاقة "سمة" من ذروة يحدد عنصر مما أدى إلى أن ذروة في حين يعكس شدة مبلغ ذلك العنصر. قمم مميزة ركوب على رأس خلفية متفاوتة ببطء، و "التواصل". (يناقش أسطورة الشكل 2 مزيد من التفاصيل البارزة EDX الأطياف.) يتم تعريف الطاقة من الفتحات الذروة للجدول الدوري كامل بواسطة بنية إلكترونية معروفة من العناصر، وبالتالي جميع الروابط البرمجيات EDX إلى قاعدة البيانات التي تحدد مكونات تلقائيا وتحليلها. في سياق الفسيولوجية، وعناصر من المصلحة العامة التي هي مناسبة تماما لتحليل EDX تشمل نا (K _α 1.04 في كيلو)، P (2.01 كيلو)، K (3.31 كيلو)، والكالسيوم (3.69 كيلو).

1. الاستفادة من قاعدة بيانات البرمجيات المتاحة وإجراءات الذروة مطابقة لتحديد العناصر الرئيسية في الأطياف. في العينة البيولوجية تتوقع أن تجد قمم للنا، والمغنيسيوم، P، S، CL، K، والكالسيوم. (تنبيه:والعنصران الأخيران تتداخل!)

تحليل كمي

يتكون التحليل الكمي من EDX أطياف استخراج منطقة متكاملة من القمم التي تم تحديدها وتحويل هذه القيمة إلى تركيز. للتحليل البيولوجي، والمنهج الذي هو قاعة الأسلوب الذروة / متصلة ^4،7،10، الذي يستفيد من حقيقة أن شدة متصلة (المحددة أعلاه وفي الشكل 2) يتناسب مع الكتلة الجافة من حجم تحليلها . وبالتالي، فإن نسبة الذروة المنطقة منطقة / متصلة، بالمقارنة مع نفس النسبة في أطياف معايير تكوين المعروفة، يحدد تركيز في المقصورة الخلوية المستهدفة. لاحظ أن هذا النهج يتيح تركيزات في وحدات من الشامات في الوزن، وعادة ما أعرب ملمول / كغ من الوزن الجاف. هذه الوحدة هي غير عادية وللتفسير قد تتطلب التحويل إضافية، على سبيل المثال، ملمول / لتر الوزن الرطب أو مليمول / ملغ من البروتين، كما هو موضح شsewhere ^(4،10).

2. استخراج المناطق الذروة (وتقديرات الخطأ) من العناصر البيولوجية بين Z = 10-20 (0،5-4،0 كيلو)، أي نا، والمغنيسيوم، P، S، CL، K، والكالسيوم، وذلك باستخدام واحدة من إجراءات مناسبة في صلب تحليل البرامج (انظر الجدول 1، وخصوصا الحاشية 4). يستخدم هذا المختبر البسيط أو متعددة المربعات المناسب. لاحظ أن هذا يتطلب عناية فائقة المناسب لحل التداخل بين K والكالسيوم القمم (انظر الشكل 2).
3. دمج التواصل بين 1،45-1،61 كيلو. ويمكن استخدام مناطق خالية من التدخل البديلة.
4. حساب نسب الذروة / متصلة ثم تركيزات بالمقارنة مع المعايير. نشر الأخطاء في جميع أنحاء التحليل.
5. استخدام البرمجيات الإحصائية القياسية وصيغ لتقدير المعدلات التي تعكس التباين البيولوجي.

Representative Results

الحفاظ على خلايا الدماغ عادة إصابة excitotoxic المواد نتيجة لإطلاق ناقل عصبي المرضية التي تحدث تحت ظروف الدماغية. كان EPMA حاسمة لاكتشاف كيفية قدرة الميتوكوندريا الخلايا العصبية لعزل كميات هائلة من الكالسيوم وراء آلية الإصابة. صورة مجهرية الإلكترون في الشكل 3 يوضح مظهر الميتوكوندريا في cryosections تجميد المجفف من الخلايا العصبية الحصين مثقف المجمدة بسرعة بعد 30 دقيقة من التعرض لحافز excitotoxic المواد (100 ميكرومتر NMDA). يبدو أن معظم الميتوكوندريا للتلف هيكليا، كما هي منتفخة للغاية وتحتوي على، شوائب صغيرة مظلمة (الأسهم الحمراء). EPMA، الذي لديه القرار كافية لإجراء تحليل عنصري داخل والحصرية ("مصفوفة") مشتملات الميتوكوندريا (الشكل 3 والأحمر والأزرق الأطياف، على التوالي)، وكشف أن شوائب تتكون إلى حد كبير من الكالسيوم والفوسفور. يخدع الكالسيوم عالية للغايةخيمة من هذه الادراج - ~ 1،300 ملمول / كغ من الوزن الجاف، في حين <1 مليمول / كغ هو نموذجي من يستريح الميتوكوندريا - يشرح قدرة غير عادية الكالسيوم التخزين المؤقت الخاصة بهم، ولماذا الساحقة يؤدي هذا إلى آلية التخزين المؤقت الكالسيوم الزائد تسبب موت الخلايا ^11.

الحصين، وهي منطقة من الدماغ الحرجة للتعلم والذاكرة، هو المكان الرئيسي للإصابة بعد نقص التروية. ومن المثير للاهتمام، ومهمة علاجية، منطقة متميزة وظيفيا اسمه CA3 هو أقل عرضة بكثير للإصابة الدماغية مما هو المتاخمة، والمنطقة CA1 متصل synaptically. تحليل EMPA - بالتزامن مع cryosections من مناطق معينة من شرائح قرن آمون التي تحافظ على بنية الموقع وظيفة (الشكل 4، مجهرية) في - كانت تستخدم لإظهار أن المحفزات لحث السامة الارتفاعات الكالسيوم أكبر من ذلك بكثير في الخلايا العصبية CA1 ضعفا من الخلايا العصبية في مقاومة CA3 المجاورة ( الرقم 4، شريط الرسم البياني). بالتالي، CA1 mitochon dria تظهر إصابة واسعة النطاق واختلال وظيفي، مشيرا إلى أن كا ^{2 +} يسببها الزائد، ضعف الميتوكوندريا هي العامل الحاسم في الضعف انتقائية من الخلايا العصبية CA1 ^13.

الشكل 1. منخفضة التكبير صورة مجهرية الإلكترون من اثنين من أشرطة من cryosections المجمدة رطب معتمدة على فيلم pioloform. ويوضح خصائص التحضير الجيد، بما في ذلك شقة، تعلق أيضا، أقسام مجزأة الحد الأدنى. وينبغي تجنب الساحات الشبكة مع مزقت في الفيلم الدعم، والدموع الفيلم مزيدا من تحت شعاع الالكترون. يشار إلى مربعين مناسبة تماما لتحليلها من قبل العلامات النجمية. مقياس شريط = 100 ميكرون.

"FO: SRC =" / files/ftp_upload/50807/50807fig2highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50807/50807fig2.jpg "/>
الشكل 2. والمسح الضوئي الرقمي صورة مجهرية الإلكترون انتقال الخلايا العصبية متعاطفة في cryosection تجميد المجفف المحضرة من السيطرة العقدة المجمدة بسرعة ويوضح التحليل الكمي للعضية التركيب العنصري من قبل EPMA. جرعة منخفضة من التفاصيل يمكن تحقيقه في مثل هذه العينات. ملاحظة غشاء البلازما حادة، مداخن المحفوظة جيدا من الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا وفيرة أقحم - EDX الطيف سجلت من منطقة نموذجية من مصفوفة الميتوكوندريا، كما يتبين من النقطة الحمراء. ويتم تحديد العناصر المقابلة لK قذيفة قمم أشعة X الرئيسية؛ في حالة البوتاسيوم والكالسيوم، يتم حل خطين K-قذيفة الناشئة عن التحولات الإلكترونية البديلة، كما أشار K _{α β} K وفقا لمنهج التحليل الطيفي القياسية. يوضح توزيع الطيف نموذجية من العناصر الرئيسية في الخلايا العصبية الحية. ملاحظة الإشعاع متواصلة متفاوتة ببطء، على سبيل المثال بين 1.5-1.8 أو 2،8-3،1 كيلو، الأمر الذي يعكس كثافة كتلة من هذه المقصورة الخلوية. معقد التحليل الكمي من الكالسيوم في الخلايا السليمة من خلال وجود مستويات عالية نسبيا من البوتاسيوم (الوزن كاليفورنيا. 500 ملمول / كغ الجافة، أي ما يعادل تقريبا 150 ملم)، والذي يؤدي إلى تداخل _β K البوتاسيوم والكالسيوم K _α القمم في الطيف EDX. هناك خوارزميات قياسية لdeconvolving هذا التداخل. يمثل شريط النطاق 1 ميكرون.

الرقم 3. التحفيز excitotoxic المواد يؤدي تراكم الكالسيوم متغير والمترجمة في الميتوكوندريا الفردية. الرقمية صورة مجهرية الإلكترون انتقال تجميد المجفف cryosection أعدت من غير المثبتة، والثقافة المجمدة بسرعة الخلية الحصين بعد التحفيز excitotoxic المواد من سلالة NMDA مستقبلات الغلوتامات من (100 ميكرومتر NMDA لمدة 30 دقيقة) ويبين العديد من الميتوكوندريا التي تحتوي على، وبطبيعة الحال كثيفة الإلكترون، الادراج منقط الصغيرة (الأسهم الحمراء). إظهار المقابلة أطياف الأشعة السينية أن التحفيز السامة أدى إلى فقدان التوازن الأيوني، كما يتضح من زيادة الذروة نا وانخفاض K الذروة في المصفوفة خالية من إدراج الميتوكوندريا (الأسهم الزرقاء والطيف). ذروة كا كبيرة في الطيف الأحمر يعكس تراكم الكالسيوم الميتوكوندريا قوية المترجمة إلى مشتملات مميزة، والتي تحتوي أيضا على كميات كبيرة من الفوسفور والأكسجين. وكان متوسط ​​تركيز الكالسيوم في الادراج ومصفوفات ~ ~ 1،300 و60 ملمول / كغ وزن جاف على التوالي. يمثل شريط نطاق 500 نانومتر.

7fig4.jpg "/>
الشكل 4. الكالسيوم الزائد الميتوكوندريا هي المسؤولة عن الضعف الدماغية انتقائية من الخلايا العصبية CA1 الحصين اللوحة اليسرى - الميكروسكوب الكترون من cryosections من أجسام الخلايا في CA3 والمناطق CA1 ثقافة شريحة الحصين عضوي النمط، والمجمدة بسرعة تحت ظروف محاكاة نقص التروية (100 ميكرومتر NMDA). اللوحة اليمنى - EPMA يحلل محتوى الكالسيوم الميتوكوندريا تبين أن نقص التروية الكيميائية يدفع الارتفاعات الكالسيوم أكبر من ذلك بكثير في الميتوكوندريا من الخلايا العصبية CA1 ضعفا مما كانت عليه في المجاورة، ومقاومة للنقص تروية الخلايا العصبية CA3 (*، ف <0.05 مقارنة NMDA تتعرض-CA1). ألغيت الناجم عن NMDA الزائد الكالسيوم عن طريق NMDAR خصم MK-801. يمثل شريط النطاق 2 ميكرومتر.

Discussion

المنهج التحليلي القائم على المجهر الالكتروني المقدمة هنا يسمح للكشف، وتحديد، وتحديد الكميات من عدة عناصر ذات الأهمية البيولوجية، بما في ذلك نا، K، P، وخاصة الكالسيوم. ويمكن إجراء هذه التحاليل في التحت خلوية، أي داخل عضية، القرار بسبب القدرة على اكتشاف وتحديد هياكل الفائدة في صور عالية الجودة من cryosections أعدت من العينات المجمدة بسرعة. لاحظ أنه لا يلزم تلطيخ لتسجيل الصور الإلكترون مقارنة في نوعية الهيكلية ل، الاستعدادات البلاستيك جزءا لا يتجزأ الثابتة التقليدية، حتى في حين أن موقع العناصر الأنسجة يتم الاحتفاظ كميا.

على الرغم من أن يتم تسجيل الصور المسح الهيكلي في انخفاض جرعة الإلكترون التطبيقية، يطلب جرعات أعلى من ذلك بكثير للحصول انبعاث الأشعة السينية بمعدلات العد كافية للحصول على إحصاءات جيدة. وبالتالي، يجب أن يكون المجهر مفيدة لEMPA قادرة على تشكيل تحقيق عالية مركزة الحالي؛ 2-5 غفي 25-50 نانومتر، ومناسبة لتشمل العضيات مثل صهاريج ER أو حويصلات متشابك، غير مقبول. هذا الحد الأدنى يتطلب عالية السطوع بندقية اللانثانم سداسي بوريد الإلكترون. في ظل هذه الظروف دورا أساسيا والكالسيوم بتركيزات الأنسجة نموذجية من 1-10 الوزن مليمول / كجم جافة يمكن تحليلها كميا إلى الخطأ المعياري لل± 0.1 ملمول / كغ في ~ 100 ثانية الوقت حية. ان حساسية تحليل الكالسيوم أن تحسنت كثيرا لو لم يكن للتداخل مؤسف من الكالسيوم خط الأشعة السينية الرئيسية مع خط البوتاسيوم طفيفة، deconvolution التي تضيف حالة من عدم اليقين لإدماج إشارة الكالسيوم (انظر الشكل 1 أسطورة ل مزيد من التفاصيل). لاحظ أن الظروف هي الحدود التي وصفت خففت كثيرا عندما تركيزات الكالسيوم المحلية مرتفعة بشكل غير عادي، كما يحدث أثناء الفسيولوجية، والباثولوجية وخاصة، وتراكم الكالسيوم الميتوكوندريا (الأرقام 2-3).

على الرغم من العديد من successfتطبيقات المجاهدين، فمن الواضح أن EPMA ليست تقنية فعالة بشكل خاص، حتى لا يكون هناك الكثير من الحوافز لتحسين سرعة نقل البيانات. وذكر ثلاثة سبل واعدة هنا: 1) فقدان الطاقة الطيفي الإلكترون (ثعابين) بدلا من EDX؛ 2) خرائط عنصر 2D بدلا من تحقيقات نقطة، و 3) أجدد، للدولة من بين الفن الأجهزة. بدلا من جمع تنبعث الأشعة السينية، ثعابين يعتمد على تسجيل الإلكترونات الحادث التي فقدت، وكميات عنصر محدد سمة من الطاقة بعد اصطدام الإلكترون / ذرة. إحصائيا، ثعابين بطبيعته ~ 4X أفضل من EDX، وثعابين الأجهزة والبرامج هي الآن ناضجة عمليا لعلماء الأحياء. (انظر المراجع ^{6، 2} لاستعراض التطبيقات ثعابين في علم الأحياء.)

تحسن حساسية التي تقدمها ثعابين - وأيضا من خلال أحدث الإنتاجية العالية سي الانجراف كشف EDX، انظر أدناه - يسمح مرات يسكن أقصر في التحليل، مثل ميلي ثانية بدلا من حundreds من ثانية، وبالتالي القدرة على توليد الخرائط الرقمية لمناطق مختارة في أوقات معقولة. على سبيل المثال، خريطة الكالسيوم 128 × 128 يمكن تسجيلها في ~ 1 ساعة ^1. لاحظ أن هذا النهج، والمعروفة باسم "التصوير الطيف" ^6،2، ويوفر مجموعة كاملة ثعابين في كل بكسل، بحيث يتم تضمين المعلومات على عدة عناصر في تسجيلها "المكعب البيانات" (خ مقابل. ذ مقابل هاء).

أخيرا، كانت هناك التقدم الموضوعي في مجال التكنولوجيا أداة والأداء منذ النظام الحالي، كما هو موضح في قسم البروتوكول، وقد وضعت منذ أكثر من 20 عاما. وستشمل دولة من بين الفن التكنولوجيا التي من شأنها أن تكون من الواجب في المختبر يجري الإعداد EMPA اليوم: 1) بندقية عالية السطوع مجال الانبعاثات التي يمكن أن ضخ عدة nanoamps (NA) الحالي في البقع subnanometer الحجم؛ 2 ) مساحة واسعة للكشف عن الانجراف السيليكون لمكبر الأشعة السينية كفاءة التحصيل والإنتاجية ^8، و 3) البرامج الحديثةتقدم المرونة العالية والأداء لاقتناء الطيفي، والتحليل وتحديد الكميات. حزم البرمجيات مثل متاحة تجاريا من معظم الشركات المصنعة، بدلا من ذلك، وهو نسخة محدثة ومحسنة من DTSA البرمجيات، DTSA الثاني، يتوفر في أي تكلفة من نيست (انظر الجدول 1، الحاشية 4). الميزات وصفه للتو هي على رأس أي الأتمتة و / أو الروبوتات المتاحة في قاعدة المجهر الإلكترون.

وقد ثبت بروتوكول EMPA كما هو موضح في حد ذاته مفيد للغاية لمهاجمة العديد من القضايا التي تهم علماء الأعصاب، مما يساعد، على سبيل المثال، للكشف عن الآليات الخلوية من تنكس عصبي. النظر في التحسينات الموصى بها فقط، يجب EMPA ستظل مساهما الصلبة للبحث في المستقبل.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)