הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

25.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50808

⸱

12 בנובמבר 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Robert Wood Johnson Medical School, Rutgers University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

המשקעים סידן פוספט הוא שיטה נוחה וחסכונית עבור transfection של תאים בתרבית. עם אופטימיזציה, ניתן להשתמש בשיטה זו בתאים שקשה transfect כמו נוירונים עיקרי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס cocultured עם תאי astroglial.

תקציר

המשקעים סידן פוספט הוא שיטה נוחה וחסכונית עבור transfection של תאים בתרבית. עם אופטימיזציה, ניתן להשתמש בשיטה זו בתאים שקשה transfect כמו נוירונים עיקרי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס cocultured עם תאי astroglial.

מבוא

הנוירונים עיקריים הם אחד מסוגי התאים בצורה הקשה ביותר לtransfect כפי שהם postmitotic ורגישים מאוד לשינויי מיקרו סביבתיים. ישנם ארבעה סוגים נפוצים של שיטות לביטוי של גנים אקסוגניים וRNAs קצר סיכה (shRNAs) בתאים אלה 1. לכל אחד יש יתרונות משלה וחסרונות. לדוגמא, electroporation מבוצע בדרך כלל על נוירונים מבודדים טרי 2, כמו תאים חייבים להיות מועברים לcuvettes עבור transfection. זיהום בנגיף בדרך כלל ניתן להשיג יעילות גבוהה מאוד 3, אבל הוא יותר עתיר עבודה ומסוכנת למפעילים. ריאגנטים transfection בתיווך שומנים רבים זמינים באופן מסחרי, בדרגות שונות של הצלחה בתאי עצב ורמות שונות של cytotoxicity.

transfection סידן פוספט מייצג שיטה נוחה וחסכונית להחדרת גנים זרים לתוך תאי עצב. השיטה שימשה לראשונה להציג את ה-DNA adenovirus לתוך cel היונקיםls ידי גרהם ואן דר Eb (1973) 4. Transfection בוצע על ידי ערבוב של סידן כלורי עם ה-DNA רקומביננטי בחיץ פוספט. זה מאפשר היווצרות של פוספט DNA / סידן שוקע בו, כאשר ירד בהדרגה על monolayer של תאים, לדבוק בתא השטח, נתפס על ידי אנדוציטוזה וסופו של דבר להיכנס לגרעין 5. תהליך זה יביא לביטוי של גנים זרים הציגו בתא היעד. יעילות אופיינית למגוון transfection סידן פוספט בין 0.5-5% 6-8. עם זאת, עם אופטימיזציה מדוקדקת וביצוע של פרוטוקול הניסוי עולה בקנה אחד, אפשר להגיע ליעילות transfection של כמעט 50%. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס עיקריים, אשר cocultured עם תאי astroglial בפורמט כריך 9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת עכברוש astrocyte תרבות למדיה אוויר וastrocyte נוירון cocultures.

  1. הכן את חיץ דיסקציה (BSS, ראה טבלת מס '1 למתכון) ולאחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.
  2. הרדימי גורי ילוד חולדה (P0-P2) עם isoflurane בכוס 500 מיליליטר.
  3. כאשר גורים הם נייחים, תרסיס עם אתנול 70% ולערוף.
  4. הסר את המוח.
    1. חזק היטב את הראש עם זוג דומון # 5 מלקחיים, ולהשתמש במספריים בסדר לעשות חתך קו האמצע דרך העור והגולגולת.
    2. לחשוף את המוח על ידי המשקף את הגולגולת לצדדים, ולהסיר את המוח לתוך צלחת המכילה BSS הקר.
  5. הפרד את אונות המוח מdiencephalon וגזע המוח תחת בהיקף לנתח. מוציא בזהירות את כל קרומי המוח על ידי ייצוב הרקמות עם זוג אחד של מלקחיים ומשייכתו בעדינות משם קרומי המוח עם זוג נוסף של מלקחיים.
  6. לאסוף את כל אונות in אחד 60 מנה מ"מ. בעזרת מספריים קטנים, רקמת בשר טחון כדק ככל האפשר. לאחר מכן להעביר את הרקמות טחונות לצינור חרוטי 50 מיליליטר.
  7. הוסף 1.5 מיליליטר של 1% DNase אני וטריפסין 1.5 מיליליטר של .2.5% ו12 מיליליטר של BSS (נפח כולל של 15ml) למוח. דגירה באמבט מים רועד במשך 15 דקות ב37 ° C. כדי להבטיח ערבוב טוב, צינור התערבל ביד כל 5 דקות.
  8. העברת supernatant דרך מסננת 70 מיקרומטר תא מעל צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש. הוסף 3 מיליליטר FBS לsupernatant זה.
  9. לחתיכות שנותרו, להוסיף 13.5 מיליליטר של BSS וטריפסין 1.5 מיליליטר 2.5% דגירה בwaterbath הרועדת לעוד דקות 15.
  10. מעביר את supernatant שנותר דרך מסננת התא ולשלב עם supernatant משלב 1.8.
  11. צנטריפוגה ב 1,000 סל"ד במשך 5 דקות עד גלולה התאים.
  12. כדורי resuspend ב 5 מיליליטר של תקשורת גליה. Supernatant ניתן centrifuged שוב לגלולת התאים הנותרים.
  13. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
  14. cel פלייטls בצפיפות של 1 x 10 7 סנטימטר ל150 2 בקבוק.
  15. שינוי בתקשורת לתקשורת גליה טרי היום לאחר ציפוי. לאחר מכן, תאים להאכיל פעמיים בשבוע עם תקשורת גליה.
  16. כאשר תאים הגיעו confluency> 80% (כ 10 ימים לאחר ציפוי), להקפיא את התאים למטה ב90% בסרום סוס וDMSO 10% ולהחזיק מלאי בחנקן נוזלי. תאים קפואים ב2 x 10 6 לכל בקבוקון. אפשר להקפיא כ 5 בקבוקונים מבקבוק אחד.
  17. על 10-14 ימים לפני הגדרת התרבות בהיפוקמפוס, ותאי גלייה הם מצופים מהמניות הקפואות. בדרך כלל אנחנו צלחת חמש 6 צלחות היטב, וזה מספיק כדי לתמוך בצמיחה של 90 coverslips של נוירונים בהיפוקמפוס (שלושה coverslips 15 מ"מ עגול לכל טוב). אנחנו גם צלחת שמונה עד עשר מנות נוספות 60 מ"מ של תאי גליה, המשמשת לתקשורת N2.1 האוויר עבור transfection. היום לפני התרבות עצבית, צריכים להיות מוזנים בתאים עם תקשורת NB27. האסטרוציטים אידיאלי צריכים להיות מחוברות 90%> ב ההוא נקודה. אנו מוצאים כי הקפאה מקטינה באופן משמעותי את מספר מיקרוגליה בתרבויות astroglial. מאז רעילות העצבית מוגברת נצפתה כאשר מיקרוגליה קיים בתרבויות astroglial, אנחנו תמיד משתמשים בתרבות astroglial הוכנה ממניות קפוא לcoculture עם הנוירונים.

2. עצבי תרבות

  1. coverslips זכוכית נקי על ידי השטיפה הראשונה ב2x המים milliQ. אז הם ספוגים בחומצה חנקתית מרוכזת ל24 שעות, ולשטוף עם מים milliQ לפחות חמש פעמים על סך של 2 שעות. Coverslips הם מיובשים ועיקור על ידי אפייה בתנור בחום של C ° 225 במשך 6 שעות.
  2. העברת coverslips 60 מ"מ מנות לאחר עיקור. הנח ארבע נקודות של פרפין סטרילי ליד הקצה החיצוני של כל coverslip כדי לשמור על תאי עצב להיפרד מתאי גליה במהלך coculture.
  3. coverslips מעיל עם 1 מ"ג / פולי-L-ליזין מיליליטר במאגר M 0.1 borate לילה בחממת 37 מעלות צלזיוס.
  4. למחרת, לשטוף coverslips פעמיים במ 'סטריליilliQ מים לפחות 15 דקות כל אחד. אז הם מודגרות לילה בתקשורת ציפוי ב37 ° C חממה.
  5. להרדים חולדה בהריון (E18) על ידי הרדמה isoflurane אחרי חזה אוויר, ולהרדים חולדות עוברי על ידי עריפת ראש. הסר את המוח ולנתח את אונות המוח כפי שתואר לעיל.
  6. לנתח את hippocampi מחץ כדור מוחין. מניחים את כל hippocampi לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר, ולעכל עם טריפסין 0.25% (0.5 מיליליטר 2.5% טריפסין, 4.5 מיליליטר BSS) על 37 ℃ במשך 15 דקות.
  7. hippocampi מתעכלת הם שטופים ב3x BSS במשך 5 דקות כל אחד. אז הם נכתשו עם זכוכית פיפטה פסטר, וצפיפות התאים נקבעת באמצעות hemocytometer. אז נוירונים הם זורעים בצפיפות של 2 x 10 5 תאים לכל 60 מנה מ"מ.
  8. כ 2-4 שעות לאחר ציפוי, העברת coverslips עם הנוירונים מחוברים למנות המכילות תאי astroglial, עם הנוירונים פונים כלפי מטה לכיוון גליה. בDIV3, להוסיף arabinoside ציטוזין לתאים בריכוז סופי של 5 מיקרומטר לעצור התפשטות גליה.

3. Transfection סידן

  1. תקשורת N2.1 מצב על גליה היום לפני transfection.
  2. ביום transfection, לקחת תקשורת N2.1 התנתה הנחה של גליה ולהעביר לתוך צלחת חדשה. העברת coverslips עם נוירונים לתוך תקשורת N2.1 המותנה. תן לאזן באינקובטור במשך 10-30 דקות.
  3. לקבוצה אחת של צינורות סטרילי, לשלב 1-4 מיקרוגרם של ה-DNA, 12.5 μl של 2 מ 'CaCl 2, וסטרילי H 2 O להיקף כולל של 100 μl. לסט שני של צינורות, להוסיף של 2x HBS 100 μl.
  4. הוספת ⅛ נפח של 2x HBS (12.5 μl) בכל פעם לצינור המכיל את תערובת CaCl 2 / ה-DNA, vortexing לכמה שניות בכל פעם. לאפשר הצינורות לשבת במשך 15 דקות.
  5. לאחר 15 דגירה דקות, מוסיף את dropwise תערובת transfection לתאים. דגירה של 1-1.5 שעה. שכבה של משקעים כמו חול צריכה להיות גלויהתחת מיקרוסקופ באמצעות מטרת 10X.
  6. לאחר דגירה, לשטוף coverslips פעמיים עם חיץ לשטוף HBS חם.
  7. לחזור coverslips למנות מקוריות עם גליה, להוסיף חומצת kynurenic לריכוז סופי של 0.5 מ"מ.
  8. ניתן הדמיה נוירונים transfected חי או מעובד לimmunocytochemistry כבר ביום שלמחרת. נוירונים יכולים לשרוד עד שלושה שבועות לאחר transfection.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאשר הפרמטרים השונים של transfection מותאמים ונשלטים בקפידה מניסוי לניסוי, ניתן להשיג יעילות transfection של עד 50%. איור 1 מציג שדה של נוירונים שהם transfected עם GFP על DIV4. השדה מכיל בסך הכל 28 נוירונים, ביניהם 16 היו transfected. זה מייצג את יעילות של מעל 50%. דגימה של שדות אחרים באותו coverslip מראה את היעילות הכוללת היא 50% בערך (מידע לא מוצג). עם מערכת coculture astroglial, הנוירונים להישאר בריאים ולהתפתח באופן נורמלי לאחר transfection. איור 2

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ישנם מספר פרמטרים מרכזיים שצריך להיות מבוקרים בקפידה לtransfections המוצלח באופן עקבי 10,11. הפרמטר הקריטי ביותר עבור transfection סידן פוספט הוא ערך ה-pH של 2x HBS, אשר בידיים שלנו בדרך כלל נע בין 7.10-7.15. אנו ממליצים להכין שלוש קבוצות של מניות עם ערכי ה-pH ב0.05 מרווחים כדי להסביר את ההבדל בין pH מטר. לחלופין, ערכת transfection היונקים Clontech מספקת 2x הרוורד כי באופן עקבי תשואות יעילות טובה. יש לזכור כי ה-pH של התמיסה תשתנה במשך זמן, גם כאשר הם מאוחסנים במקפיא. אנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי מעוניינים הכריזו.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי NIH המענק NS065183 וקרנות הזנק מבית הספר לרפואת ראטגרס רוברט ווד ג'ונסון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Dumont #5 מלקחייםכלי מדע עדינים11251-20
מספריים עדיניםכלי מדע עדינים14090-09ישר / חד 8.5 ס"מ
Vannas-Tubinger מספריים קפיצייםכלי מדע עדינים15008-08זוויתי / חד / 8.5 ס"מ / 5 מ"מ קצה חיתוך
מלקחיים דפוס סטנדרטיכלי מדע עדינים11000-16
סטודנטים כירורגיים מספרייםFine Science Tools91401-14קהה / 14.5 ס"מ
מספריים קפיצייםFine Science Tools15006-09בזווית לצד / 9 ס"מ / 10 מ"מ קצה חיתוך
IsofluraneWebster וטרינרי14043-225-06
פולי-L-ליזיןסיגמאP2636
MEMSigmaM2279
100 מ"מ נתרן פירובטסיגמאS8636
גלוקוזסיגמאG8270
10x HBSSSigmaH4385
1 M HEPES, pH 7.3Gibco/Invitrogen15630-080
GlutaMAXGibco/Invitrogen35050-061
Neurobasal MediaGibco/Invitrogen21130-049
תוסף B27 (50x)Gibco/ Invitrogen17504-044
N2 תוסףGibco/Invitrogen17502-048
OvalbuminSigmaA5503
פניצילין/סטרפטומיציןGibco/Invitrogen15070-063
2.5% טריפסיןGibco/Invitrogen15090-046
DNase ISigmaDN-25
ציטוזין ארבינוזידCalbiochem/EMD Millipore251010
חומצה קינורניתSigmaK3375

מקורות

  1. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  2. Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
  3. Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
  4. Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
  5. Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
  6. Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
  7. Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
  8. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11(2001).
  9. Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
  10. Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
  11. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
  12. Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תרבית תאי אסטרוגליהמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתיעילות טרנספקציית תאיםשיטת השקעת DNAמערכת תרבית משותפת של נוירוניםהתניית מצע גידול גליאליפרוטוקול עיכול בטריפסיןטרנספקציה על זכוכית כיסוי
סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.