We hebben een microfluïdisch platform ontwikkeld voor snelle antibioticagevoeligheidstests. Vloeistof wordt met hoge snelheden doorgegeven over bacteriën die op de bodem van een microfluïdisch kanaal zijn geïmmobiliseerd. In aanwezigheid van stress en antibiotica sterven gevoelige bacteriestammen snel af. Resistente bacteriën kunnen deze stressvolle omstandigheden echter overleven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Stress-geïnduceerde antibiotica gevoeligheid testen op een chip
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
We hebben een snelle microfluïdische methode ontwikkeld voor het testen van de gevoeligheid van antibiotica in een stressgebaseerde omgeving. Vloeistof wordt met hoge snelheden doorgegeven over bacteriën die op de bodem van een microfluïdisch kanaal zijn geïmmobiliseerd. In aanwezigheid van stress en antibiotica sterven gevoelige bacteriestammen snel af. Resistente bacteriën overleven deze stressvolle omstandigheden echter. De hypothese achter deze methode is nieuw: stressactivatie van biochemische routes, die doelwit zijn van antibiotica, kan het testen van de gevoeligheid van antibiotica versnellen. In vergelijking met standaard antibioticagevoeligheidstestmethoden wordt de snelheidsbeperkende stap - bacteriële groei - weggelaten tijdens het aanbrengen van antibiotica. De technische implementatie van de methode is in een combinatie van standaardtechnieken en innovatieve benaderingen. De standaardonderdelen van de methode omvatten bacteriële kweekprotocollen, het definiëren van microfluïdische kanalen in polydimethylsiloxaan (PDMS), cel levensvatbaarheidsmonitoring met fluorescentie en batchbeeldverwerking voor het tellen van bacteriën. Innovatieve onderdelen van de methode zijn in het gebruik van kweekmediastroom voor mechanische stresstoepassing, gebruik van enzymen om de bacteriën te beschadigen maar niet te doden, en het gebruik van microarray substraten voor bacteriële aanhechting. Het ontwikkelde platform kan worden gebruikt bij de ontwikkeling en het testen van antibiotica en niet-antibiotische geneesmiddelen. In vergelijking met de standaard bacteriële suspensie-experimenten kan het effect van het medicijn herhaaldelijk worden in- en uitgeschakeld gedurende gecontroleerde periodes. Repetitieve observatie van dezelfde bacteriepopulatie is mogelijk in de loop van hetzelfde experiment.
Inleiding
De opkomst van bacteriële resistentie versterkt de behoefte aan snelle op fenotype gebaseerde antibioticagevoeligheidstests om onze geneesmiddelen in laatste instantie te beschermen. Standaard gevoeligheidstests zijn gebaseerd op bacteriële groeiremming in aanwezigheid van antibiotica die meerdere (8-24) uur in beslag nemen. We hebben een nieuwe antibioticagevoeligheidstest ontwikkeld op een microfluïdisch platform dat afhankelijk is van de stressactivering van biosyntheseroutes om de werking van antibiotica te versnellen.
Antibiotica gevoeligheidstests op microfluïdische schaal hebben het voordeel van effectief monstergebruik, omdat ze kle....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Maak de PDMS-laag (figuur 1)
- Meng PDMS en curing agent krachtig in een 10:1 verhouding. Om bellen te verwijderen, ontgast u het viskeuze mengsel gedurende 1 uur in een vacuümkamer bij kamertemperatuur.
- Giet het PDMS op een schaal langzaam over de aluminium mal. Giet vanuit het midden en houd de mal waterpas. Zorg ervoor dat u de pinnen onbedekt laat. Stop met gieten zodra het streefgewicht is bereikt.
Onze mal vereist 4 g PDMS en 0,4 g uithardend reagens. - Breng de mal waterpas in een oven en hard 's nachts uit bij 37 °C.
Alternatieve uithardingstijden zijn 2 uur bij 60 °C of 1 uur bij 90 °C. - Ontleed ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De gegevens in figuur 4 tonen de respons van een gevoelige Staphylococcus aureus stam in de loop van de tijd in een antibioticumbevattend microfluïdisch kanaal. Fasecontrastbeelden die na 1 minuut en aan het einde van het 1 uur durende experiment zijn verkregen, zijn weergegeven in de figuren 4A en B. De geanalyseerde 1 uur gegevens zijn weergegeven in figuur 4C met de bacteriën gemarkeerd in rood (5.828 totaal). Overeenkomstige fluore.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gepresenteerde protocol werd gevalideerd en geoptimaliseerd in een reeks experimenten met methicillinegevoelige en methicillineresistente Staphylococcus aureus stammen10. Daarom moet dit protocol zonder wijziging rechtstreeks van toepassing zijn op andere stammen van S. aureus en andere antibiotica met werkingsmechanismen die de biosynthese van de bacteriële celwand beïnvloeden. Andere bacterietypen dan S. aureus kunnen variatie in de stressparameters vereisen: oplosbare (enzymat.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De microfluïdische methode is patent aangevraagd: Sauer-Budge A, Sharon A, Kalashnikov M, Wirz H, uitvinders; Methode en apparaat voor snelle detectie van bacteriële antibioticaresistentie / gevoeligheid patent PCT / US10 /33523.
Dankbetuigingen
We danken de ingenieurs en studenten van het Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. Voor het helpen bij het ontwerp, de bewerking en de automatisering van het experimentele systeem, bedanken we Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin en Dr. Sudong Shu. We danken Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu en Katarzyna Kuliga voor hulp bij het testen van experimentele protocollen en het verzamelen van gegevens. We erkennen Drs. Anne E. Carpenter en Mark-Anthony Bray van het Imaging Platform van het Broad Institute of Harvard en MIT voor hulp bij de ontwikkeling van de beeldanalyseroutine in CellProfiler. Het beschr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Dead cell fluorescence stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Gebaat voor lysostaphin opslag |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | Gebaat voor lysostaphin opslag |
| Lysostaphin | Cell Sciences | CRL309A | Komt als 1 mg vaste stof. Voor opslag: Oplossen in 20 mM natriumacetaat. Meng met BSA-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 1% BSA en 100 µg/ml lysostaphin voor opslag |
| Oxacillin zout | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibioticum |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Natriumchloride | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% toegevoegd aan Mueller-Hilton bouillon vóór autoclavage |
| 1 ml, Luer-lock spuit | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, Luer-lock spuit | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 - 60 mL | Overvullen tot ~65 ml |
| Microscoop | |||
| Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Fluorescence/Phase contrast objectief | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12-bit monochrome CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Microscope automatisering | |||
| Shutters fase contrast/fluorescentie | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| Focus motor | PRIOR Scientific | H122 | |
| Joystick voor XYZ controle | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan Controller | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| Image Acquisition Software | Fraunhofer CMI | ||
| Flow Cell Assembly en PDMS | |||
| Flow Cell | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | Engineering tekeningen werden geproduceerd door Fraunhofer CMI |
| Glasvenster | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glasvenster werd op de juiste maat gesneden bij Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Venster 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Afdichtingsplaat | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Epoxide glasplaat | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master gemaakt in aluminium of messing met UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine) |
| PDMS plaat ontwerp | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Tubing | |||
| Moer, Super flensloos Tinytight, koploos, 1/16 inch, PEEK, groen | IDEX Health Science | M-644-03 | Flow cell invoer/uitvoer zijn getapt voor deze ferrule |
| Ferrule, Tinytight, 1/16 inch, 6-40,.030 inch TH, PEEK met SS vergrendelingsring, zwart | IDEX Health Science | M-657 | |
| Moer, Super flensloos Tinytight, koploos, 1/16-1/32 inch, 1/4-28, PEEK, natuurlijk | IDEX Health Science | P-255 | |
| Ferrule, Super Falngeless, 1/16 inch, Tefzel (ETFE), geel | IDEX Health Science | P-259 | Past op Luer-lock adapter |
| Tubing, Teflon FEP,.030 inch x 1/16 inch x 20 ft, groen | IDEX Health Science | 1520G | |
| Adapter, snelkoppeling vrouwelijk Luer naar vrouwelijk 1/4-28, PEEK, rood | IDEX Health Science | P-658 |
Referenties
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Meer artikelen verkennen
Microfluïdische antibioticagevoeligheidbacteriële immobilisatiestress door hoge stroomsnelheidfluorescentiemonitoring van levensvatbaarheidfasecontrastbeeldvormingPDMS-stroomcelassemblagesubstraten voor bacteriële aanhechtinggenormaliseerde berekening van celdoodsnelle antibioticumtestenstress-geactiveerde biochemische routes
