Den Optokinetic respons som en kvantitativ måling af Visual Acuity i zebrafisk

Summary

Zebrafisk har været et værdifuldt redskab for mange forskningsområder. Her vi demonstrere en metode til at fremkalde en visuel reaktion og beregne en funktionel synsstyrke i den voksne zebrafisk.

Abstract

Zebrafisk er en gennemprøvet model for vision forskning, men mange af de tidligere metoder, der generelt fokuseret på fiskelarver eller demonstreret et simpelt svar. For nylig voksen visuel adfærd i zebrafisk er blevet af interesse, men metoder til at måle specifikke svar er nye på vej. For at løse dette hul, vi satte sig for at udvikle en metode til gentagne gange og præcist udnytte optokinetic respons (OKR) til at måle synsstyrke i voksen zebrafisk. Her viser vi, at der kan måles den voksne zebrafisk visuelle skarphed, herunder både kikkerter og monokulare acuities. Fordi fisken ikke skades under proceduren, kan måles synsstyrke og sammenlignes over kortere eller længere perioder. Synsstyrke målinger der er beskrevet her, kan også gøres hurtigt giver mulighed for høj kapacitet og yderligere visuelle procedurer, hvis det ønskes. Denne type analyse er befordrende for narkotika interventionsstudier eller undersøgelser af sygdomsprogression.

Introduction

Zebrafisk (Danio rerio), er en god model til at studere visuel fysiologi på grund af ligheden af deres nethinden til andre hvirveldyr, deres korte levetid, og tilgængeligheden af genetisk ændrede mutanter ^1,2. Den optokinetic refleks / respons / nystagmus (OKR) er en kombination af glat forfølgelse og hurtige saccade øjenbevægelser. For mere end 60 år klinikere har vist, at OKR kan bruges til objektivt at måle synsstyrke hos patienter og er især nyttig til at bestemme spædbarn visuelle evner ^3-5. Den første registrerede brug af OKR i dyr var ved hjælp af duer i 1950'erne ^6. For nylig har OKR blevet et værdifuldt redskab til at vurdere den visuelle funktion i larvernes zebrafisk og er ofte brugt til at screene for genetiske mutanter, der har en synshandicappet ^1,2. Mens OKR har været meget anvendt til at bestemme visuel funktion i larve zebrafisk, er det først for nylig blevet påvist i voksne zebrafiske ^7-10. En nylig papir ved Tappeiner bruger en kommercielt tilgængelig optomotor systemet traditionelt anvendes til mus et al., OptoMotry, at påvise, at synsstyrke den voksne zebrafisk stadig temmelig konstant, ~ 0,59 cykler per grad (CPD), også på tværs af forskellige vinkelhastigheder ⁷ .

Selvom OKR har vist sig at være ganske nyttigt i larvernes zebrafisk undersøgelser har andre metoder til visuel adfærd blevet brugt i zebrafisk voksne med varierende grader af succes. Flugten respons assay viste, at albino og rubin zebrafisk begge pigmentering mutanter, har reduceret visuelle reaktioner i lyse lysforhold ^11,12. Denne samme flugt respons assay har også med succes identificeret nat blindhed D mutanter, omend på 2 år ^13. Imidlertid flugtrespons assayet er ikke uden mangler. Det er svært at tilskrive en nøjagtig visuel funktion og er kun en grov approximation af visuelle ændringer - betyder, at det tager en stor ændring, før ændringen er identificeret.

En anden metode, der er udviklet til at identificere voksne zebrafisk med synshandicap er optomotor respons (OMR) ^11. I dette assay er fisk anbragt i en cirkulær tank med en uigennemsigtig spalte i midten. Sorte og hvide striber roterer omkring tanken, og fisken har til opgave at svømme i retning af stribe bevægelse. Ligesom flugt reaktion, OMR fokuserer på visuomotor kapaciteter af den voksne zebrafisk. Det har dog været anvendt med succes til at identificere fisk med synshandicap, såsom lrp2/bugeye mutanter ^14. De lrp2/bugeye zebrafisk udstille buphthalmos, forhøjet intraokulært tryk, formindsket OMR og progressiv retinal degeneration ^14,15.

Mange undersøgelser har brugt visuomotor kapaciteter i voksen zebrafisk, som ofte er subjektive og ikke kan Quantitatively analyseret. Ved at bruge OKR, kan man studere synsstyrke voksne fisk mere objektivt. Vi har bygget vores egen OKR-enhed, modelleret efter et oprindeligt brugt til larve undersøgelser ^1.. I denne undersøgelse har vi vise, at OKR kan bruges til at beregne både monokulære og binokulære synsstyrke i zebrafisk.

Protocol

Alle husdyrbrug og eksperimenter bør godkendes og gennemføres i overensstemmelse med retningslinjerne, som beskrevet af Institutional Animal Care og brug Udvalg for den pågældende institution eller andre juridiske krav.

1.. Zebrafisk Care

1. Opretholde zebrafisk under standardbetingelser ved 28,5 ° C på en 10 timers mørke-14 timers lys cyklus ^16.
2. Hold voksen zebrafisk med en tank densitet på ca 3 fisk / L.

2. Optokinetic respons (OKR)

1. Byg brugerdefinerede OKR optagelse enhed ved hjælp af en 14,5 cm i diameter roterende tromle, et stereoanlæg mikroskop med justerbare lys intensitet indstillinger (300-8,000 lux) og en computer (figur 1a).
   1. Vedhæft et kamera til mikroskop, der vil give en levende foder på en tilstødende skærm og mulighed for billedoptagelse og optagelse.
   2. Styre den roterende tromle ved hjælp af en mikrocontroller er knyttet til en computer, som vil accommodate forskellige hastighed og retning markeringer.
2. Bedøver fiskene i 0,016% tricaine for 2-3 min og derefter placere fisken på en lille platform med øjne og gæller ophængt over kanten.
3. Placer en tynd svamp / håndklæde over kroppen af ​​fisken og pin 2-3 stykker af skum, formet til at rumme de fisk, over fisken for at holde det immobiliseret. Begrænsning af bevægelse af halen af ​​fisken viste sig at være et afgørende aspekt for immobilisering uden at forårsage skade på fisk, og blev bedst opnås ved hjælp af et fladt stykke skum. (Figur 1b)
4. Anbring fisk inden for en cylindrisk, vand-fyldt tank, der passer inde i den roterende tromle OKR optageenheden. Brug magneter på platformen for at placere fisken oprejst, med øjnene ca 7,3 cm fra kanten af ​​tromlen. Fiskene skal genoplive fra anæstesi inden for et par minutter - normal vejrtrækning vil genoptage og tilfældige øjenbevægelser skal overholdes.
5. Placer en base rist på 0,07 cykler per grad (CPD) i den roterende tromle og engagere de edb-kontroller for at begynde rotation og videooptagelse (en hastighed på 12 rpm blev brugt til dette papir, men hastigheder på 8-16 rpm bør give lignende resultater).
6. Når en indledende OKR er fremkaldt af basen rist, pause rotationen kortvarigt, og erstatte den rist med en mindre rist (højere rumlig frekvens).
7. Gentag denne proces, indtil en OKR ikke længere kan fremkaldes. Gentest med den mindste rist, der forårsagede en OKR efter en modificeret trappe tilgang og derefter gentage bruge risten, som undlod at fremkalde en reaktion for at kontrollere tabet af OKR. Denne proces kan gentages for at verificere en korrekt reaktion på den mindste påviselige rist, hvis den endelige rist ændret i forhold til den første udslettelse begivenhed.
8. Opnå monokulare skarphed målinger ved at placere en sort plast okkluderingsindretning over striber der støder op til det modsatte øje. Gentag proceduren ovenfor (trin 2,6-2,7).
9. Anskaf skarphed af det modsatte øje ved at flytte okkluderen og gentage trin 2,6-2,7 igen.
10. Bemærk afstanden hvert øje er fra striberne under proceduren ved hjælp af henvisningen måling strimmel under akvarium så præcise skarphed foranstaltninger kan beregnes på følgende trin testning.

3. Beregning Visual Acuity

1. Anskaf synsstyrke ved at beregne byggevaredirektivet: hvor a er afstanden fra linsens centrum til gitteret, og h er længden af en cyklus af mindste gitteret hvor OKR blev observeret (figur 1c).
2. For kombinerede synsstyrke målinger det gennemsnit en værdi fra både venstre og højre øje er brugt.

Representative Results

OKR Device Funktionalitet

Den OKR anordning som beskrevet ovenfor og vist i figur 1 fungerer med minimal vedligeholdelse. Som bemærket i trin 2.3 immobilisere halen er afgørende for at holde fiskene fastholdes under optagelsen. Tilstrækkeligt immobiliseret, kan fiskene holdes i OKR enheden i længere perioder. Derfor bør der udvises forsigtighed i de første immobiliseringstrin, så der kan indsamles flere data for hver enkelt fisk.

Synsstyrke målinger

Kikkerten OKR let fremkaldt hos normale voksne fisk. Ved at følge ovenstående fremgangsmåde kan man finde visuelle acuities for zebrafisk af mange aldre (figur 2). Den bedste kikkert rumlige skarphed vi indspillede var 0.74 byggevaredirektivet. Som bemærket i figur 2, kikkerten skarphed generelt stiger med alderen (n = 46, p = 0,002 ANOVA hjælp SPSS V14), men flader udefter omkring 12 måneder. Når vi sammenlignede den målte synsstyrke i fem måneder gammel vildtype fisk til alder-matchede lrp2/bugeye fisk, fandt vi, at lrp2/bugeye fisk væsentligt havde reduceret synsstyrke (p <0,001; vildtype: 0,49 ± 0,05 cpd n = 8, lrp2/bugeye: 0,35 ± 0,06, n = 10; Students t-test med Excel).

Ved at okkludere det højre øje kan bestemmes synsstyrke for det venstre øje og omvendt. I forhold til den binokulære skarphed, er kikkerten summation observeret på samme måde som det menneskelige øje ¹⁷ (figur 3). Kikkerten skarphed var generelt 5-10% bedre end enten højre (OD) eller venstre (OS) acuities målt uafhængigt. For nogle enkelte fisk var forskellen en forbedring på 25%.

Figur 1. Okr recording. A) OKR består af en 14,5 cm i diameter roterende tromle og mikroskop med justerbar lysintensitet indstillinger (300-8,000 lux). Et kamera giver en live-feed på en tilstødende skærm. Den roterende tromle har forskellige hastigheder i både med og mod uret retninger og udskiftelige rumfrekvens riste indsættes og fjernes efter behov. B) Fisk er sikret og placeret i midten af den roterende tromle. C) Cykler pr grad (CPD) er beregnet hjælp CPD = Klik her for at se større billede .

Figur 2. Synsstyrke ændrer sig med alderen. Grafen viser uafhængige visuelle acuities målt 5 - 15 måneder i alder. Den synsstyrke stiger generelt i hele det første år af udvikling og derefter haler off en smule ved 15 måneder (p = 0,002 ANOVA hjælp SPSS v14). Hvert punkt kan enten repræsentere 1 eller flere fisk. Synsstyrke måles i cyklusser / grad (CPD). (N = 46 i alt, 8 ved 5 måneder, 4 ved 6 måneder 7 ved 8 måneder, 6 ved 9 måneder, 11 ved 10 måneder, 2 ved 11 måneder, 2 på 12 måneder og 6 til 15 måneder). Klik her at se større billede .

Figur 3. Binokulære synsstyrke summation effekt. Kikkerten (OU) synsstyrke er generelt højere i forhold til højre (OD) eller venstre (OS) øjet acuities. I denne særlige gruppe var OS acuities betydeligt lavere. (* P = 0,006, N = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Discussion

Til tider fiskene kan slippe ud i vandbeholderen. Det er afgørende at immobilisere halen. Derudover brugen af ​​en tynd svamp / håndklæde over fisken krop blev også fundet at være uvurderlig for at holde fiskene suspenderet i længere tid. Vi var i stand til at holde fisk immobiliseret i mere end 30 min ved hjælp af denne procedure uden at skade fisken. Denne mængde tid er mere end nok til at gøre kikkerten og begge monokulare acuities.

Præsentationen af risten kan enten gøres som beskrevet her og andre steder ved hjælp af en fysisk roterende tromle eller ved at præsentere et digitalt display ^18-22. Begge typer har særlige fordele og ulemper. Vi valgte at bruge den fysiske rotation både omkostningsmæssige årsager og tekniske specifikationer. Eksklusive computeren og imaging udstyr, kan det OKR anordning beskrevet her blive bygget for omkring 150 dollar.

Den OKR er en objektiv metode til bestemmelse visual skarphed i voksen zebrafisk. Mens flere andre visuomotor assays for syn er anvendt i tidligere eksperimenter og endda elektroretinogrammet er med held blevet udført i voksne zebrafisk øjne, selv om det ikke har været stærkt udnyttet den voksne zebrafisk OKR åbner døren til mange nye eksperimentelle betingelser ^22. Denne undersøgelse har vist, at OKR anvendelighed måle synsstyrke ændringer over tid, identificere synsstyrke forskel i øjet sygdomsmodeller, og i fastsættelsen af ​​monokulært synsstyrke.

Interessant, voksen zebrafisk vision i forhold til menneskets syn (20/20) er ca 20/1, 000 (når 0,60 cpd omdannes til -0.3 logMAR). Selv om dette kan synes dårlig, er zebrafisk øjne meget velegnet til miljøet. På trods af den visuelle opgave at kigge gennem 6,5 cm vand, et par millimeter af polycarbonat, og en anden centimeter af luft, fiskene udføre ganske godt! Vi fandt, at den voksne zebrafisk skarphed er ABOut 70% af, hvad der kunne forventes i betragtning af deres fotoreceptorer afstand. ^23. Kontrast, at med optimal menneskelig ydeevne ~ 20/12, hvilket er omkring 80% af den forventede 20/10, og OKR teknik til at måle visuel kapacitet i voksen zebrafisk er imponerende ^{24 25.}

Teknikken med at måle uafhængige øjet visuelle acuities giver mulighed for studier, hvor det ene øje kunne være behandlet, og den anden bruges som en kontrol. Derudover kunne fiske med asymmetrisk udvikling øje såsom lrp2/bugeye eller fisk, der udvikler grå stær overvåges mere præcist. Det skal bemærkes, at pleje skal tages for at præcist at måle afstanden fra øjnene til striberne, og at okkludere den fulde synsfelt. Denne teknik skal åbne døren til mere præcise og specifikke foranstaltninger af zebrafisk visuel funktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Super Low Light Black White Video Security Camera	Super Circuits	PC164CEX-2	Any low light camera may be used
Arduino Duemilanove microcontroller	Adafruit Industries		The Arduino Uno is also compatible with the speed control software.
Tricaine Methanesulfonate	VWR	101107-950