Zebrafisk har varit ett värdefullt verktyg för många forskningsområden. Här visar vi en metod för att framkalla en visuell respons och beräkna en funktionell synskärpa i den vuxna zebrafisk.
Zebrafisk är en beprövad modell för syn forskning, men många av de tidigare metoder i allmänhet inriktade på yngel eller visat ett enkelt svar. På senare vuxna visuella beteende i zebrafisk har blivit av intresse, men metoder för att mäta specifika svar är nya kommer. För att åtgärda denna brist, vi på att utveckla en metod för att vid upprepade tillfällen och korrekt utnyttja optokinetic svar (OKR) för att mäta synskärpa i vuxen zebrafisk. Här visar vi att den vuxna zebrafisk synskärpa kan mätas, inkluderande både binokulära och monokulära acuities. Eftersom fisken inte skadas under förfarandet, kan synskärpan mätas och jämföras över korta eller långa tidsperioder. Synskärpan mätningar som beskrivs här kan också göras snabbt vilket möjliggör hög genomströmning och för ytterligare visuella förfaranden om så önskas. Denna typ av analys leder till läkemedelsinterventionsstudier och undersökningar av sjukdomsprogression.
Zebrafisk (Danio rerio) är en bra modell för att studera visuell fysiologi på grund av likheten mellan deras näthinna till andra ryggradsdjur, deras korta livslängd, och tillgången till genetiskt förändrade mutanter 1,2. Den optokinetic reflex / svar / nystagmus (OKR) är en kombination av mjuk strävan och snabba saccade ögonrörelser. I mer än 60 år kliniker har visat att OKR kan användas för att objektivt mäta synskärpan hos patienter, och är särskilt användbart för att bestämma spädbarn visuella kapacitet 3-5. Den första inspelade användning av OKR djur använde duvor på 1950-talet 6. På senare tid har det OKR blivit ett värdefullt verktyg för att bedöma den visuella funktion i larver zebrafisk och används ofta för att screena för genetiska mutanter som har en synskada 1,2. Medan OKR har i stor utsträckning använts för att fastställa synfunktion i larver zebrafisk har det först nyligen visats hos vuxna zebrafiska 7-10. En färsk artikel av Tappeiner et al. Använder en kommersiellt tillgänglig optomotor systemet som traditionellt används för möss, OptoMotry, att visa att den synskärpa av den vuxna zebrafisk förblir ganska konstant, ~ 0,59 cykler per grad (CPD), även över olika vinkelhastigheter 7 .
Fastän OKR har visat sig vara ganska användbar i larval zebrafisk studier har andra metoder för visuella uppträdande använts i zebrafisk vuxna med varierande grad av framgång. Analysflyktsvaret visade att albino och rubin zebrafisk, både pigmente mutanter, har minskat visuella reaktioner i starkt ljus 11,12. Samma flykt svarsanalys har också lyckats identifiera natten blindhet d mutanter, om än vid 2 års ålder 13. Emellertid är avbrottssvarsanalysen inte utan brister. Det är svårt att tillskriva till en exakt visuell funktion och är bara en grov approximation av synförändringar – vilket betyder att det tar en stor förändring innan ändringen identifieras.
En annan metod som har utvecklats för att identifiera vuxna zebrafisk med nedsatt syn är det optomotor svar (OMR) 11. I denna analys är fisk placeras i en cirkulär tank med en ogenomskinlig kolumnen i mitten. Svarta och vita ränder roterar runt tanken och fisken har till uppgift att simma i riktning mot rand rörelse. Liksom flyktrespons, OMR fokuserar på visuomotor kapaciteten hos vuxna zebrafisk. Det har dock använts framgångsrikt för att identifiera fisk med synskador, såsom lrp2/bugeye mutanterna 14. De lrp2/bugeye zebrafisk uppvisar buphthalmos, förhöjt intraokulärt tryck, minskat OMR, och progressiv retinal degeneration 14,15.
Många studier har använt visuomotor kapacitet i vuxen zebrafisk, som ofta är subjektiva och kan inte vara quantitatively analyseras. Genom att använda OKR kan man studera den synskärpa av vuxen fisk mer objektivt. Vi har byggt vår egen OKR enhet, modellerad efter en början användes för larv studier 1. I denna studie visar vi att den OKR kan användas för att beräkna både monokulära och binokulära synskärpan hos zebrafisk.
Ibland fisken kan fly in i vattentanken. Det är kritiskt att immobilisera svansen. Dessutom användning av en tunn svamp / handduk över fiskens kropp visade sig också vara ovärderlig för att hålla fisken suspenderade under längre tidsperioder. Vi kunde hålla fisk immobiliserade i mer än 30 min med hjälp av denna procedur utan att skada fisken. Denna tid är mer än tillräckligt för att göra kikare och båda monokulära acuities.
Presentationen av gallret kan antingen göras som beskrivs här och på andra ställen med hjälp av en fysiskt roterande trumma eller genom att presentera en digital display 18-22. Båda typerna har särskilda fördelar och nackdelar. Vi valde att använda den fysiska rotationen både av kostnadsskäl och tekniska specifikationer. Exklusive datorn och bildutrustning, kan det OKR enhet som beskrivs här byggas för runt $ 150.
Den OKR är ett objektivt sätt att bestämma visUAL skärpa i vuxen zebrafisk. Medan flera andra visuomotor analyser för visionen har använts i tidigare experiment och även elektroretinogram har framgångsrikt gjort i vuxen zebrafisk ögon, även om det inte har varit starkt utnyttjats, den vuxna zebrafisk OKR öppnar dörren till många nya experimentella förhållanden 22. Denna studie har visat på OKR s verktyg för att mäta synskärpa förändringar över tid, identifiera synskärpa skillnad i ögonsjukdomsmodeller och för att fastställa monokulär synskärpa.
Intressant, jämfört med det mänskliga ögat (20/20) är vuxen zebrafisk syn ca 20/1, 000 (då 0,60 CPD omvandlas till -0,3 logMAR). Även om detta kanske inte är bra, är de zebrafisk ögon mycket väl lämpad för sin omgivning. Trots den visuella uppgiften att titta igenom 6.5 cm vatten, några millimeter av polykarbonat och annan centimeter i luft, fiskarna utför ganska bra! Vi fann att den vuxna zebrafisk skärpan är ABOut 70% av vad som skulle förutsägas med tanke på deras ljusmätare avstånd. 23 Kontrast som med optimal mänsklig prestation ~ 20/12, vilket är ungefär 80% av den beräknade 20/10, och OKR teknik för att mäta visuell förmåga i vuxen zebrafisk är imponerande 24 , 25.
Tekniken att mäta oberoende ögon visuella acuities skulle möjliggöra studier i vilka ett öga kunde behandlas och den andra används som en kontroll. Dessutom fiskar med asymmetrisk ögonens utveckling såsom lrp2/bugeye eller fisk som utvecklar grå starr skulle kunna övervakas mer noggrant. Det bör noteras att vård måste vidtas för att noggrant mäta avståndet från ögonen till ränder och att täppa till hela synfältet. Denna teknik bör öppna dörren för mer exakta och specifika åtgärder för zebrafisk synfunktion.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering från Western University of Health Sciences College of Optometri till DJC. Speciellt tack till Irisa Tam för grafisk design.
Super Low Light Black White Video Security Camera | Super Circuits | PC164CEX-2 | Any low light camera may be used |
Arduino Duemilanove microcontroller | Adafruit Industries | The Arduino Uno is also compatible with the speed control software. | |
Tricaine Methanesulfonate | VWR | 101107-950 |