Membranpotential Dye avbildning av ventromediala Hypothalamus nervceller från vuxna möss för att studera Glucose Sensing

Summary

Aktiviteten av enstaka nervceller från vuxna-äldre möss kan studeras genom att ta avstånd nervceller från specifika delar av hjärnan och med hjälp av fluorescerande membranpotential färg bildbehandling. Genom att testa reaktioner på förändringar i glukos, kan denna teknik användas för att studera glukoskänslighet vuxna ventromediala hypotalamus nervceller.

Abstract

Studier av neuronal aktivitet utförs ofta med hjälp av nervceller från gnagare mindre än 2 månaders ålder på grund av de tekniska svårigheter som är förknippade med ökad bindväv och minskad neuronal livsduglighet som uppstår med åldern. Här beskriver vi en metod för dissociation av friska hypotalamus nervceller från vuxna-äldre möss. Möjligheten att studera nervceller från vuxenåldern möss tillåter användning av sjukdomsmodeller som manifesterar vid en senare ålder och kan vara mer utvecklingsmässigt korrekta för vissa studier. Fluorescens avbildning av dissocierade nervceller kan användas för att studera aktiviteten av en population av nervceller, jämfört med att elektrofysiologi för att studera en enda neuron. Detta är särskilt användbart när man studerar en heterogen neuronal population i vilken den önskade neuronal typ är sällsynt såsom hypotalamiska glukos avkänning neurons. Vi utnyttjade membranpotential färgämne avbildning av vuxna ventromediala hypotalamus nervceller för att studera deras svar till changes i extracellulär glukos. Glukos avkännande neuroner tros spela en roll i centrala regleringen av energibalansen. Möjligheten att studera glukosanalys hos vuxna gnagare är särskilt användbart eftersom övervikt av sjukdomar relaterade till dysfunktionella energibalans (t ex. Övervikt) ökar med åldern.

Introduction

Hjärnan reglerar energi homeostas genom neuroendokrina och autonoma nervsystemet. Det ventromediala hypotalamus (VMH), som består av den ventromediala kärnan (VMN) och den bågformiga kärnan (ARC), är viktigt för att den centrala regleringen av energi homeostas. Specialiserade glukos avkänning nervceller, inom VMH, länka neuronal aktivitet och perifer glukoshomeostas ^1. Det finns två typer av glukos avkänning nervceller, glukos upphetsad (GE) nervceller öka medan glukos hämmas (GI) nervceller minskar sin verksamhet som extracellulära glukos ökar. VMH glukos avkänning nervceller i allmänhet studeras med hjälp av elektrofysiologi eller kalcium / membranpotential känsligt färgämne avbildning.

Den elektrofysiologiska patch clamp-tekniken anses vara den gyllene standarden i studien av ex vivo nervaktivitet. Vid denna teknik används en glasmikropipett elektrod fäst till cellmembranet via en hög resistans(GΩ) tätning. Patch clamp elektroder tillåter realtid registrera aktionspotential frekvens (strömtång) eller jon konduktans (spänning klämma) förändras inom en enskild neuron. Medan patch clamp teknik ger detaljerad information om förändringar i specifika jonkanal konduktanser, är en stor nackdel att endast en neuron kan observeras i taget. Det tar ca 30-45 min för inspelning för att kontrollera att man spelar in från en glukossensor neuron innan ens börjar en viss experimentell behandling. Dessutom, GI och GE nervceller omfattar <20% av den totala VMH neuronala befolkningen. Compounding denna fråga är bristen, i många fall av en identifierande cellulär markör för dessa nervceller. Således är det uppenbart att trots att ge värdefull elektrisk information att andra tekniker kan inte, är patch clamp-analys mödosamt, tidskrävande och lågt utbyte.

Användningen av fluorescensavbildning av dissocierade VMH neurons möjliggör studiet av hundreds av nervceller samtidigt. Kalciums känsliga färgämnen kan användas för att mäta intracellulära kalciumförändringar, som indirekt korrelerar till förändringar i neuronal aktivitet. Membranpotential känsliga färgämnen används för att övervaka membran potentiella förändringar. Mätning cellulär membranpotential är en mer direkt index av neuronal aktivitet jämfört med förändringar i intracellulära kalciumnivåer. Dessutom upptäcker membranpotential färgämne (MPD) imaging potentiellt mindre förändringar i membranpotential där aktionspotential bränning inte ändras och intracellulära kalciumnivåer kan inte ändras. Båda dessa fluorescens avbildningstekniker har använts för att studera VMH glukos avkänning nervceller från unga möss ^2-7. Även om resultaten är mindre detaljerade än de som erhållits med patch clamp elektrofysiologi, är styrkan i imaging experiment som de samtidigt utvärdera en stor population av celler som oundvikligen innefattar ett betydande antal glukossensor nervceller. MPD avbildning iär särskilt användbart för att studera GI nervceller som är mer enhetligt lokaliserad i hela VMH, vilket ger en lämplig population att studera i den dissocierade VMH (~ 15% GI). Däremot, medan GE nervceller är tätt lokaliserade till ventrolaterala-VMN och cell fattig region mellan ARC och VMN, att de inte utgör ett betydande antal nervceller inom VMH (<1% GE). Dessutom, genom att studera isolerade nervceller, astrocytic och presynaptiska effekter elimineras. Detta kan vara en fördel, i att studera första ordningens neuron effekter, såväl som en nackdel eftersom fysiologiska anslutningar och processer går förlorade.

En begränsande faktor i både patch clamp elektrofysiologi och MPD / kalcium färgämne avbildning är behovet av att använda yngre djur (t ex. Möss eller råttor <8 veckors ålder). Detta är främst på grund av ökad bindväv i kombination med minskad neuronal viabilitet som sker med åldern. I hjärnan-skiva elektrofysiologi studies, gör ökad bindväv det svårare att visualisera nervceller. Ökad bindväv gör det också svårare att särskilja ett stort antal friska nervceller för imaging studier. Dessutom nervceller från yngre djur överlever längre under någon patch clamp inspelning eller bildbehandling. Emellertid kan användning av unga möss är en stor begränsning. Neuronal aktivitet och / eller svar på signalsubstanser eller cirkulerande näringsämnen förändras med åldern. Till exempel, eftersom energibalansen är nära knuten till reproduktiv status, kan de hypotalamus nervceller som reglerar energibalansen reagerar olika i pre-vs postpubescent djur. Dessutom har många sjukdomar kräver långtidsbehandling eller inte uppenbart förrän i vuxen ålder. Utmärkta exempel på sådana sjukdomar är kost fetma eller typ 2 diabetes mellitus. Eftersom glukos avkänning nervceller tros spela en roll i dessa sjukdomar vi utvecklat en metodik för att framgångsrikt odla friska vuxna VMH nervceller för användning i MPD imaging experiments.

Protocol

1. Djur

1. Alla förfaranden godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Medicine and Dentistry av New Jersey.
2. Grupp hus hane C57BL / 6 möss på en 12 h light/12 h dark schema och tillåta ad libitum tillgång till vatten och mat. Offra vid 4-5 månaders ålder. Avlivning av mössen utfördes under användning av den kirurgiska plan av anestesi och en sekundär form av eutanasi (dvs. inträngande incision in i brösthålan genom membranet). Detta överensstämmer med de AVMA Riktlinjer för eutanasi.

2. Beredning av Perfusion Solution, Täckglas, glaspipetter, och Media

1. Gör 1L perfusion lösning bestående av 2,5 mM KCl, 7 mM _MgCl2, 1,25 mM NaH ₂ PO _4, 28 mM NaHCOa _3, 0,5 mM _CaCl2, 7 mM glukos, 1 mM askorbat, och 3 mM pyruvat i destillerat dH ₂ O. Justera osmolaritet till ~ 300 mOsm med användning av ca 80 g / liter sackaros. Oxygenat genom bubbling med 95% _O2 / 5% _CO2 och justera pH till 7,4. Varje experiment kräver ca 200 ml perfusion lösning. Alikvoter kan lagras vid -20 ° C i upp till 2 månader.
2. Gör 250 ml Neurobasal lager innehållande Neurobasal media utan glukos, 2,5 mM glukos, och 100 U / ml penicillin streptomycin. Justera osmolaritet Neurobasal lager till 280 mOsm med hjälp av sackaros. Gör 500 ml Viloläge lager innehållande Viloläge-A-media utan glukos, 2,5 mM glukos, och 100 U / ml penicillin streptomycin.
3. Rör om både aktier väl och filter-sterilisera använda Stericup vakuumfilterenheterna. Var noga med att inte införa glukos eller andra föroreningar genom glas eller stir barer. Slå in flaskorna i folie för att skydda mediet från ljus och lagras vid 4 ° C i upp till 2 månader.
4. Flamma tips av 4 autoklaveras glaspipetter (9 i) så att tipsen är ingen longer skarpa och öppningen diametrar är stora (~ 0,9 mm), medium-stor (~ 0,7 mm), medium (~ 0,5 mm) och liten (~ 0,3 mm). Den största bör knappt polerad och den minsta bör vara ungefär en tredjedel av denna diameter.
5. På dagen före skörd nervceller, ren fyra 25 mm täckglas med hjälp av 70% etanol och passerar över en bunsenbrännare flamma. Placera varje täckglas i en steril 35 mm odlingsskål och tillsätt 2 ml steril 1% poly-D-lysin i dH ₂ O. Sätt skålarna i en inkubator (37 ° C) över natten. Nästa dag, tvätta med steril dH ₂ O 3x och låta täck torka helt.
6. Se till 75 | il alikvoter av 1 M mjölksyra och 200 | il alikvoter av GlutaMAX, förvara vid -20 ° C. Helt tina portioner av mjölksyra och GlutaMAX före användning för att säkerställa homogenitet.
7. På dagen för skörd av neuroner, göra 30 ml färskt odlingsmedium bestående av Viloläge-Ett lager innehållande 1 mM mjölksyra, 0,5 mM GlutaMAX, och 2% B27 utan insulin. Vortex och justera pH till 7,4 med användning av 1 N NaOH.
8. Sätt 10 ml odlingsmedia i ett 60 mm glas petriskål på is, sätta 2 ml i en 15 ml koniska rör på is och hålla de kvarvarande media i rumstemperatur.
9. På dagen för skörd av neuroner, göra 25 ml färskt tillväxtmedium bestående av Neurobasal lager innehållande 1 mM mjölksyra, 0,5 mM Glutamax, och 2% B27 utan insulin. Vortexa och justera pH till 7,4 med användning av 1 N NaOH. Låt färskt tillväxtmedia till jämvikt i en inkubator (37 ° C, 5% _CO2) under minst 30 min.

3. Cardiac Perfusion

1. Fullt tina 200 ml perfusionslösning och oxygenat med 95% _O2 / 5% _CO2 på is under åtminstone 15 min.
2. Tvätta en vibratome blad med aceton, 70% etanol, och dH ₂ O. Placera kniven i vibratome.
3. Skölj vibratome kylningskammaren och perfusion slangar med dH ₂ O. Fyll kylkammaren (4 ° C) Med perfusions-lösning och fortsätter att syre.
4. Bedöva en mus med pentobarbital-natrium 50 mg / ml, utspädd 1:1 med sterilt vatten, injicerades intraperitonealt. Verifiera musen är helt bedövad genom att klämma stjärten och observera inget svar.
5. Häll kall perfusion lösningen i perfusion reservoar och slang strax före dissekering. Spara 20-30 ml för hjärnan dissekering och fortsätta att syre på is. Gravity flöde från en upphöjd 60 ml spruta med slang och en 20 G nål ger tillräckligt flöde. Låt lösningen gå tills luftbubblor tvättas ut. Fortsätt att syresätta.
6. Skär tillbaka huden ovanför bröstkorgen av musen. Lyft bröstkorg och försiktigt göra ett horisontellt snitt genom diafragmat. Gör två laterala snitt genom bröstkorgen upp mot armarna för att exponera hjärtat. Använd pincett för att hålla tillbaka bröstkorgen.
7. Gör en liten 2 mm snitt i högra atrium för att tillhandahålla en utgång för blod som skall tvättas ut ur VascuLAR-system.
8. Punktering vänster kammare med perfusion nål, precis tillräckligt för att sätta in nålen öppningen. Håll nålen på plats med en hand och starta flödet av perfusion lösningen med den andra handen. Efter 10 till 15 ml av perfusionslösningen bör blod tvättas ut och utflödet kommer att klara.

4. Brain Skivning och Dissection

1. Efter hjärt-perfusion, oxygenated överföring kall perfusionslösningen till en petriskål på is alldeles före användning.
2. Snabbt halshugga, ta bort hjärnan från skallen och placera hjärnan i perfusion lösning. För att ta bort hjärnan: dra huden framåt, gör en mittlinje snitt i skallen mot ögonhålorna, gör två laterala snitt mot varje öga, använder pincett för att dra tillbaka varje sida av skallen, gör en koronalt snitt mellan ögonhålorna, och Använd en spatel för att försiktigt lirka hjärnan ut i perfusion lösning. Använd en sax för att klippa de optiska skrifter om det behövs. Inte röra hypothalamic område och inte dra de optiska skrifter eftersom detta sätter för mycket press på median eminens och underliggande hypotalamus vävnad.
3. Använd ett rakblad och nål för att lateralt trimma hjärnvävnad ungefär 3 mm posterior och anterior till hypotalamus medan vävnaden är nedsänkt (bregma -3,52 mm). Det är särskilt viktigt för den främre sidan snittet vara nivå så att hjärnan kommer att sitta rakt på vibratome chuck.
4. Ta bort den kvarvarande hjärnvävnad från lösning och använder filterpapper för att transportera bort lösningen från den monterade hjärnsektionen.
5. Placera en klick superlim på en vibratome chuck och sprida limmet till storleken på hjärnan. Sätt hjärnvävnaden ovanpå limmet med den främre sidan nedåt och hypotalamus vetter mot bladet. Wick bort överflödigt lim och placera chucken i vibratome kylningskammaren. Iakttag försiktighet för att inte lämna mycket lim som det kommer att bubbla upp runt hjärnan när de placeras i lösning.
6. Med vibratome inställd på en låg hastighet (nivå 2) och hög amplitud (nivå 9), gör 300-500 ìm skivor fram till att hypotalamus området. Nu gör tunna 100 ìm skivor skär från den bakre till den främre. De visuella referenser är följande. Posterior till hypothalamus den tredje ventrikeln kommer att vara mycket liten (bregma -2,70 till -2,30 mm). Vid bregma -2,30 mm, är den tredje ventrikeln separeras i rygg-och ventrala delar på coronal slice.
7. När delar av den tredje ventrikeln säkring, gör två 500 ìm skivor som innehåller den korrekta regionen av VMH (bregma -2,18 till -1,22 mm). Anterior till VMH, den tredje ventrikeln inte längre sträcker sig till den ventrala våningen i hjärnan (bregma -1,06 till -0,82) ^8.
8. Överför dessa skivor till petriskål på is innehållande odlingsmedier. Dissekera VMH (VMN + ARC) som visas i Figur 1. Använd en pipett för att försiktigt överföra VMH bitar i 2 ml odlingsmedium på is.

5. Dissociation och kultur

1. Avlägsna VMH från is och placera vid rumstemperatur. Lägg 20 U / ml papain till 4 ml av odlingsmediet. Vänd för att blanda och placera i ett 34 ° C vattenbad. Kontrollera och blanda genom inversion varje minut tills matsmältningen media är inte längre grumlig. Filtrerat (0,22 ^ m) i en steril kolv och överföra vävnad till uppslutningsmediet.
2. Digerera vävnaden genom skakning vid 100 rpm vid 34 ° C under 30 min.
3. Bered en ml av medium innehållande 8% bovint serumalbumin (BSA) under uppslutning. Lös 80 mg BSA i 1 ml odlingsmedia och filter (0,22 mikrometer) i en konisk tub.
4. Skölj vävnaden genom att överföra till 5 ml odlingsmedium i ett koniskt rör och långsamt invertera en gång.
5. Addera 30 pl DNas enzym till 6 ml av odlingsmedia och blanda för att göra triturering medier. Aspirera tvättmedia och tillsätt 3 ml finfördelning media.
6. Använd glaspipetter som mal sönder i storleksordningen largest till minsta. Försiktigt mal sönder 10x och sedan vänta 4 min för större bitar att lösa. Använd den andra pipetten för att överföra de bästa 2 ml innehåller en dissocierade cellsuspension till en ny koniska rör. Tillsätt 2 ml av pulverisering media, finfördela 10x och vänta 3 min. Använd den tredje pipett för att överföra de bästa 2 ml till cellsuspensionen. Tillsätt 1 ml rivning media, Finfördela 5x och vänta 2 min. Använd den fjärde pipett för att överföra den övre 2 ml till cellsuspensionen.
7. Varva dissocierade cellsuspension på toppen av 8% BSA, är noga med att inte blanda. Centrifugera vid 1000 rpm under 5 min.
8. Placera autoklaveras 6 mm x 8 mm kloning cylindrar i mitten av varje täckglas. Täck måste vara helt torr. Sug och suspendera pelleten i 440 l varmt tillväxtmedier. Fyll kloning cylindrar med den neuronala fjädring och plats i inkubatorn i 20 minuter.
9. Avlägsna kloningscylindrar och mycket försiktigt tvätta bort skräp. Fyll varje maträtt with 2 ml av tillväxtmediet. Låt cellerna att återhämta sig under minst en timme innan några analyser utförs.

6. Förberedelse för MPD Imaging

1. Gör inspelning lösning bestående av 121 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2 mM _CaCl2, 0,1 mM _MgCl2, 1,2 mM MgSO _4, 0,97 mM K ₂ HPO _4, 0,23 mM KH ₂ PO _4, 5 mM NaHCOs _3, och 25 mM HEPES. Justera pH till 7,4.
2. Lägg glukos för att göra den önskade låga glukostestlösning (0,1-2,0 mM glukos). Blanda väl och boka 400 ml låg glukosinspelningslösning. Lägg glukos till de återstående 600 ml för att göra 2,5 mM glukos inspelningslösning och blanda väl.
3. Skydda färgämne från ljus så mycket som möjligt. Tillsätt 4 ml rumstemperatur buffert till en blå MPD flaska. Blanda väl och tillsätt 5 l färgämne per ml inspelningslösning. Förvara lösningen homogen genom att blanda med pipett i mellan lösningar. Färgen innehåller fluorescerande molecules, som träder celler med depolarisation, och utsläckande molekyler, som inte kan passera cellmembranet. Alikvoter kan lagras vid -20 ° C och användas inom 4 dagar. Frys inte-upptinings mer än en gång.
4. Inkubera cellerna i 2 ml av 2,5 mM glukos inspelning lösning plus färgämnet vid 34 ° C under 30 min. En torrvärmeblock kan användas. Skyddas mot ljus.
5. Förbered sprutpumpar och perfusion systemet med 2,5 mM och 0,1 mM inspelningslösningar plus färgämne. Slangar från 60 ml sprutor bör anslutas till ett samlingsrör.
6. Efter att stoppa någon pump, vänta ~ 10 sekunder innan du slår lösningar på grenröret för att förhindra att tryck byggs upp i sprutan. Tryckförändringar förändrar vätska leverans till sluten kammare som innehåller nervceller, vilket orsakar förändringar i mikroskop fokus under experimentet och snedvridning av bilder.
7. Fördelaren utgång slang ska anslutas till en in-line-värmaren och sedan polyeten slang, som ansluts till en sluten kammare. Bubblor ska rensas och perfusionshastighet bör sättas till 0,5 ml / min. Skyddas mot ljus.
8. För över 25 mm täckglas med tillhörande nervceller till den slutna kammaren, var försiktig så att täckglaset för att torka och att inte införa luftbubblor. Den slip är justerad i spåren av bottenstycket, är ett par droppar av inspelningslösning placeras längs sidorna, och toppstycket försiktigt monteras för att hålla täckglaset på plats.
9. Använd en pipett för att fylla kammaren med inspelning lösning och sedan placera en 18 mm täckglas ovanpå. Passa försiktigt vit ring in i kammaren för att hålla den mindre täckglas på plats. Tryck ner mycket långsamt och försiktigt för att förhindra luftbubblor från att införas i den slutna kammaren.
10. Starta sprutpumpen för 2,5 mM glukos inspelningslösning, tryck ner på den vita ringen, och ansluta till den slutna kammaren. Långsamt släppa trycket från vit ring och ansluta till slangen som leder till en avfallsbehållare.

e "> 7. MPD Imaging

1. Centrera nervceller med hjälp av låga ljusa fält ljus. Försök att minimera den tid som cellerna utsätts för ljus.
2. Tillåt perfusionssystemet för att köra för 10 min för att medge stabilisering av temperaturen, fokus, och färgämnes jämvikt.
3. Medan grundning, öppna metamorfa programmet och ta ett ljust fält bild (10X) av nervceller. Använd Auto-Focus-funktion för att ta tre staplar av fluorescerande bilder (150 msek, Narrow Cy3 filter, 10X) och bestämma fokus inom 5 um. Vid slutet av den 10 minuter priming period, kontrollera fokus igen.
4. Börja med att spela in fluorescerande bilder var 30 sekund under 40 minuter. Etablera en baslinje vid 2,5 mM glukos under 10 minuter, därefter sänka glukos i 15 min, och slutligen återgå till 2,5 mM glukos i 15 min. Lösningar byts genom att stoppa en sprutpump, väntar 10 sekunder och vände en port på grenröret, och påbörjar en sprutpump. Ändringar bör ske före önskade tidpunkter based på den eftersläpning mellan grenröret och celler.
5. Efter inspelning alla fluorescerande bilder, ta en ljust fält bild av nervceller.

8. MPD bildanalys

1. Använd metamorfa att skapa ovala regioner runt varje cell i det ljusa området bild tagen i slutet av experimentet. Regionerna bör vara något större än varje neuron och kan göras 1 pixel utanför cellens mörka kanten. Välj inte celler som är ohälsosamt, överlappande, eller nära skräp. Ohälsosamma celler verkar ofta mörk. Slutligen skapar 5 stora ovala regioner i områden med inga celler eller skräp för bakgrundsmätningar.
2. Överför regionerna till alla fluorescerande bilder och inspektera för att kontrollera att ingen rörelse / förändring har skett. Använd Mät-funktionen för att spela in fluorescensintensiteten för varje region för alla bilder i en Excel-fil. Användningen av tidskrifter i metamorfa rekommenderas.
3. I Excel, skapa ett genomsnitt av de fem bakgrundsregionerna för varje fluorescerent image. Detta representerar det genomsnittliga bakgrundsvärdet vid varje tidpunkt. För varje bild / tidpunkt, subtrahera bakgrunden från alla mätningar region. Bakgrunden korrigerad fluorescensintensiteten kommer att benämnas Intensity nedan.
4. För varje cell, beräkna den genomsnittliga intensitet under några minuter 2-8 av inspelningen. Detta representerar baslinjen för den cell i 2,5 mM glukos. En 2 minuters buffert på båda ändarna av varje behandling användes för att minimera buller.
5. För varje cell, beräkna den procentuella förändringen från baseline: (Intensity-Baseline) / Baseline
6. Skapa ett linjediagram med den procentuella förändringen från baseline vs tid.
7. Beräkna den genomsnittliga procentuella förändringen från baseline under min 18-23. Beräkna den genomsnittliga procentuella förändringen från baseline under min 35-40. Även bildbehandling inte används, är buller reduceras genom medelvärdesbildning av intensiteten i varje cell region, bakgrund subtraktion, och medelvärdes av regionen intensitet under 5 min or längre.
8. Kontroll experiment där 2,5 mM glukos inspelningslösning utbyts med 2,5 mM glukos inspelningslösning måste utföras för att fastställa tröskel buller. Beräkna den genomsnittliga procentuella förändringen från baseline under min 18-23 för minst 6 rätter och 3 möss. Bestäm medelvärdet och standardavvikelsen för dessa värden.
9. Ställ in tröskelvärdet för en positiv depolarisation svar på medelvärdet plus två standardavvikelser. Medelvärdet plus två standardavvikelser motsvarar en skillnad med p <0,05. Våra kontrollexperiment visade en 10% förändring från utgångsvärdet som det lämpliga tröskelvärdet.
10. För varje cell, bedöma reversibla depolarisation svar baserat på 2 kriterier. För det första måste den genomsnittliga procentuella förändringen från baseline under min 18-23 vara större än 10%, den tröskel som fastställts i föregående steg. För det andra måste den genomsnittliga procentuella förändringen från baseline under min 35-40 vara mindre än hälften av den genomsnittliga procentuella förändringen frånbaslinjen under minuter 18-23. Det andra kriteriet valdes, eftersom det visade sig vara mer rigorös än stimulering med glutamat eller KCl. Ohälsosamma nervceller ofta svara på stimulering med glutamat eller KCl även om deras svar på minskad glukos inte är reversibla.
11. För varje maträtt, beräkna% av depolariserade nervceller. Detta värde används för att kvantifiera% av GI nervceller mellan olika behandlingsgrupper.

Representative Results

Den exakta dissektion av VMH från andra hypotalamus områden är viktigt för att få konsekventa resultat. Att andra områden skulle kunna späda VMH neuronala befolkningen, ändra% av depolariserade nervceller beräknas. Dessutom har glukos avkännande neurons identifierats i andra hypotalamiska regioner, såsom den laterala hypotalamus, vilket kan skilja sig funktionellt och mekanistiskt från VMH glukos avkänning nervceller. Figur 1 illustrerar de korrekta anatomiska platser för korrekt dissekering. Efter protokollet ovan, kan hjärnvävnad som innehåller rätt VMH regionen skiljas. Ytterligare dissektion att exakt separera VMN och ARC, samtidigt som helheten av varje subpopulation, kanske inte möjligt. Figur 2 visar ett exempel på sund dissocierade VMH nervceller. Med hjälp av immuncytokemi, bekräftade vi att våra förberedelser är> 90% neuronal. Endast friska nervceller bör användas för data analysis och rätter med alltför många ohälsosamma nervceller ska kasseras. Neuroner som är ohälsosamma har ofta mycket mörka kanter, ta upp MPD i större utsträckning, och har oregelbundna former. Dessutom bör nervceller beläggas med en täthet så att de flesta nervceller inte vidrör varandra under inspelningen. Nervceller som valts för analys bör inte vidröra andra celler eller skräp.

Uppgifter som erhålls från inspelningar av ett GI neuron och en nonGI neuron visas i figur 3. Efter att ha fått en baslinje för 10 minuter, var det extracellulära glukos minskade från 2,5 till 0,1 mM. GI neuron visar en robust reversibel reaktion större än det förutbestämda tröskelvärdet på 10% förändring från utgångsvärdet. Ökningen i fluorescens återspeglar depolarisation. Medan GE neuron hyperpolarisering svar också upptäckts, är frekvensen för låg (<1% neuroner) för framgångsrik användning av denna teknik på denna subtyp av glukossensor neuron. Ett område av fysiologiska Glucose minskningar testades och andelen VMH nervceller som reversibelt depolariseras beräknades för varje maträtt. Figur 4 visar att det finns ett positivt samband mellan storleken av glukos minskar och andelen depolariserande nervceller. Detta visar att en lyckad primär kultur av vuxna murina nervceller kan användas i samband med fluorescensavbildning för att möjliggöra undersökning av vuxna VMH GI neuroner.

Figur 1. Coronal avsnitt med markörer för korrekt VMH dissekering. Den dissekerade vävnaden innehåller VMN och ARC med minimal kontamination från andra hypotalamus områden. Diagonala nedskärningar bör göras från ~ 25 till 30% under den övre delen av den tredje ventrikeln till ~ 25 till 30% mellan den punkt där cortex möter hypotalamisk area (blå *) och den tredje ventrikeln(3V). Anpassad från bregma -2,8 mm Paxinos och Watson 1998 ^9, vilket motsvarar Mouse Brain bregma-1.7mm. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Brightfield bild av friska VMH nervceller från en vuxen mus. Denna bild togs 24 timmar efter dissociation och har använts för MPD avbildning. Några exempel på nervceller som skulle (blå *) eller inte (röd x) användas för analys är markerade. Klicka här för att visa en större bild .

Figure 3. Representativa MPD fluorescens spår av en GI neuron (grön linje) och en nonGI neuron (orange linje). Cellerna perfunderades med 2,5 mM glukos (G) inspelning lösning under 10 min, följt av en minskning till 0,1 mM G under 15 min och en återgå till 2,5 mM G under 15 min. I GI neuron, den procentuella förändringen från utgångsvärdet till över 10% under 0,1 mM G perfusion perioden (40% i genomsnitt 20-25 min) och minskade till mindre än hälften av denna ökning på 2,5 mM G återföring perioden (15 % i genomsnitt 35 till 40 min). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 4. Andelen vuxna VMH nervceller som reversibelt depolarize som svar på minskad glukos detekteras med fluorescerande MPD avbildning. Aexisterar positivt samband mellan storleken av glukos minskar och andelen depolariserande nervceller. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Nyckeln till att kunna studera aktiviteten i nervceller från vuxna möss är förmågan att skilja friska nervceller. Dissociation av hypotalamus nervceller från vuxna möss är svårare på flera viktiga steg i protokollet jämfört med nervceller från unga möss. Vi har övervunnit detta problem på ett antal olika sätt. Göra tjock 500 pm hjärnan skivor minimerar mekaniska skador på nervceller jämfört med de vanliga 250-350 ìm skivor som används för hjärnvävnad från yngre möss. Men tjockare skivor kräver större uppmärksamhet på hjärt perfusion och papain nedbrytning av hjärnvävnad. Om blod syns på hjärnvävnad, utvärdera precisionen och placering av snitt i det högra förmaket och nålen placeras i den vänstra ventrikeln. Flödeshastigheten och mängden av perfusionslösningen kan också justeras. En grundlig perfusion är absolut nödvändigt eftersom blod är giftigt för nervceller och kommer att resultera i ett lägre utbyte av friska nervceller. Papaindigerering måste vara tillräckligt effektiv för att tillåtaför skonsam rivning och enkel frisättning av enstaka celler från hjärnvävnad. Misstänkt Ett ineffektivt papaindigerering är när VMH vävnaden sjunker snabbt i slutet av matsmältningen och när större vävnadsbitar är närvarande under andra rivning. Med god matsmältning, är vävnadsbitar knappt detekteras med blotta ögat under tredje triturering. Om rivning är inte mild, kommer neuronal hälsa drabbas. Vid misstanke om en ineffektiv papaindigerering är, kan ökas koncentrationen av papain med 5 U / ml eller en ny injektionsflaska med papain kan användas. Dock bör papain koncentrationen inte hamnar över 30 U / ml, eftersom detta kan försämra neuronal hälsa.

Exponeringen för BSA är ett kritiskt steg i protokollet. Efter triturerades celler har centrifug på BSA lutning, både den tid neuroner utsätts för BSA och mängden BSA få stanna med pellets bör minimeras. Den överstående och BSA gradientenbör aspireras omedelbart efter centrifugerperioden. Vakuum sugning kan användas för att avlägsna huvuddelen av supernatanten, men den sista ~ 100 | il bör avlägsnas manuellt med en pipett, så att cellpelleten inte störs. En annan viktig aspekt att erhålla friska nervceller är att optimera celldensitet. Nervceller pläterade är alltför glest inte så hälsosamt. Eftersom så få neuroner erhålles från varje mus hjärnan, är det inte praktiskt att räkna celler före plätering. Under den tid som skulle användas räkna, skulle ett stort antal celler hålla sig till plast och skulle gå förlorad. Med hjälp av fyra rätter per mus (~ 1 x 10 ⁴ celler / ml) som utgångspunkt, är empirisk bestämning av antal rätter den mest praktiska tillvägagångssätt för att uppnå optimal neuron täthet. Kan förväntas Utbytet av VMH neuroner från äldre möss för att vara ungefär hälften av utbytet från unga möss. Ytterligare felsökning för att förbättra neuron avkastning innebär kvantifiering av nervceller kvarvid varje steg av dissociation protokollet för att sätta fingret på stegen tung neuronal avgång.

Med hjälp av våra protokoll, kan friska dissocierade nervceller överlever i kultur upp till 2-3 dagar. Emellertid har användningen av filtrerad astrocyt konditionerade tillväxtmedier tillåter neuroner överleva upp till 2 veckor i kultur. Tillväxt media kan kondition genom inkubation på sammanflytande primära astrocyter natten. Astrocyter från samma gnagare stammar, kön och hjärnregion bör utnyttjas. Även om användningen av astrocyt-konditionerat medium införs ytterligare en variabel, kan denna ändring vara nödvändig för alternativa experiment som kräver mer tid i odling. Dessutom, av skäl som inte är klart, har vi funnit att förmågan att känna glukos lätt går förlorat med suboptimal neuronal hälsa, trots att underhållet av reaktioner på andra stimuli, såsom glutamat. Sålunda måste extra försiktighet iakttas. För att observera neuronala svar på minskad glukos, är det absolut nödvändigt att undvika contaminatiden av bakterier, mögel, salter, tvål, och glukos. Allt glas och osterila plaster bör tvättas noggrant med dH ₂ O. Förutom levande föroreningar, skulle rengöringsmedel och salter påverkar neuronal integritet och aktivitet. Små mängder glukos skulle avsevärt förändra glukoskoncentrationer. Detta skulle störa resultat eftersom glukos avkänning nervceller är mycket känsliga för små förändringar i extracellulär glukos inom nonhyperglycemic fysiologiska intervallet 0,1-2,5 mM ^10,11.

Vid användning av MPD bildbehandling, konsekvens och sida vid sida experiment mellan behandlingsgrupperna är avgörande för meningsfulla resultat. Olika behandlingsgrupperna bör testas på samma dag om det är möjligt eller åtminstone på alternerande dagar. Detta minimerar möjliga variationer i kultur preparat eller MPD portioner. Dessutom fann vi den minsta variationen uppstår när imaging utförs inom 24 timmar av neuron dissociation av skäl som nämnts ovan. Eftersom resultatenanalyseras i% av depolariserande nervceller, noggrannhet och konsekvens i VMH dissekering och neuronal förberedelser är också viktigt. Den totala VMH neuronala befolkningen skördas måste vara konstant och får inte innehålla nervceller från andra regioner. Därför bör protokollet ovan följas noggrant och precist. Men om alternativa experiment ska utföras och befolknings underhåll är inte ett bekymmer, vävnads slag kan göras för att isolera VMN eller ARC nervceller.

De metoder som beskrivs här fastställa hur man skörda friska VMH nervceller från en vuxen mus och hur man använder MPD bildbehandling för att studera glukos avkänning nervceller. I stället kunde experiment utformas för att undersöka VMH neuronala svar på stimuli än glukos förändringar. Alternativt kan dissociationen protokoll extrapoleras till skörd nervceller från andra hjärnregioner. Med hjälp av nervceller från vuxna möss, kan studier nu utföras med hjälp av modeller murina sjukdom som utvecklar eller framsteg med åldern. Moreover, kan friska vuxna neuroner att utredas ytterligare med användning av andra än MPD avbildningstekniker, såsom kalcium avbildning, elektrofysiologi, single-cell PCR, immunocytokemi eller en kombination av dessa tekniker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal-A Medium (Custom)	Invitrogen	0050128DJ	custom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom)	BrainBits		custom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)	Invitrogen	15140	other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm)	Millipore		other vendors acceptable
25 mm Glass coverslips	Warner	#1 25mm round
18 mm Glass coverslips	Warner	#1 18mm round
GlutaMAX	Invitrogen	35050
B27 minus insulin (50x)	Invitrogen	0050129SA
Razor blade	VWR	55411
Vibratome & cooling chamber	Vibratome	Series 1000 Sectioning system
Vibratome blades	Polysciences	22370	injector or double edge blades from other vendors acceptable
Papain, suspension	Worthington	LS003124
BSA, suitable for cell culture	Sigma		other vendor acceptable
DNAse, for cell culture	Invitrogen		other vendor acceptable
cloning cylinders, 6 mm x 8 mm	Bellco Glass	2090-00608
Membrane Potential Dye (blue)	Molecular Devices	R8042
In-line heater	Warner	SF-28
Syringe pumps	WPI	sp100i	other vendor acceptable
Closed chamber	Warner	RC-43C
Polyethylene tubing	Warner	PE-90
Metamorph	Molecular Devices		alternate image analysis software acceptable
Microscope	Olympus	BX61 WI	used with 10X objective
Camera	Photometrics	Cool Snap HQ
Narrow Cy3 Filter Set	Chroma	41007a
Illumination System	Sutter Instruments	Lambda DG-4