Um N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina induzida pelo modelo de cancro da bexiga foi desenvolvido em mucina humana 1 (MUC1) ratinhos transgénicos para o fim de testar a MUC1-imunoterapia dirigida. Após a administração de uma vacina de péptido MUC1-alvo, uma resposta de linfócitos T citotóxicos para MUC1 foi confirmada por medição dos níveis de citocinas no soro e da actividade específica da célula T.
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Artigo de método
Indução de carcinoma da bexiga invasivo de células transicionais em imunológico intacto Humanos MUC1 Ratos transgênicos: um modelo de desenvolvimento Imunoterapia
Neste artigo
Resumo
Resumo
A modelo pré-clínico de câncer de bexiga invasivo foi desenvolvido em mucina humana 1 (MUC1) camundongos transgênicos (MUC1.Tg) com a finalidade de avaliar a imunoterapia e / ou quimioterapia citotóxica. Para induzir o cancro da bexiga, C57BL / 6 (tipo selvagem e MUC1.Tg) foram tratados oralmente com o agente cancerígeno de N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) a 3,0 mg / dia, 5 dias / semana durante 12 semanas. Para avaliar os efeitos de OH-BBN no perfil de citocinas no soro durante o desenvolvimento do tumor, sangue foi coletado por meio de hemorragias submandibular antes do tratamento ea cada quatro semanas. Além disso, uma vacina de péptido MUC1-alvo e um placebo foram administrados a grupos de ratinhos por semana durante oito semanas. Multiplex fluorométricos immunoanalyses microbead de citocinas no soro durante o desenvolvimento do tumor e após a vacinação foram realizadas. No término, o interferão gama (IFN-γ) / interleucina-4 (IL-4) análise ELISpot para MUC1 resposta imunitária das células T específicas e as avaliações histológicas do tipo de tumore grau foram realizados. Os resultados mostraram que: (1) a incidência de câncer de bexiga em ratos tipo tanto MUC1.Tg e selvagem foi de 67%, (2) carcinomas de células transicionais (TCC) desenvolvidos na proporção de 2:1 em relação ao carcinoma de células escamosas (SCC) , (3) as citocinas inflamatórias aumentou com o tempo, durante o desenvolvimento do tumor, e (4) a administração do péptido de vacina induz um perfil de citocinas Th1 soro polarizado e uma resposta de células T específica MUC1. Todos os tumores em MUC1.Tg camundongos foram positivos para MUC1 expressão, e metade de todos os tumores em camundongos tipo MUC1.Tg e selvagens foram invasivo. Em conclusão, utilizando uma abordagem de equipe, através da coordenação dos esforços dos farmacologistas, imunologistas, patologistas e biólogos moleculares, desenvolvemos um modelo de camundongo transgênico imune intacto de câncer de bexiga que expressa hMUC1.
Introdução
O câncer de bexiga é o quarto tipo mais comum de câncer ea oitava causa de morte por câncer em homens americanos. Nos Estados Unidos, estima-se 72.500 novos casos e 15.000 mortes por câncer de bexiga são esperados entre homens e mulheres juntos em 2013 1. A incidência de câncer de bexiga é aproximadamente três vezes maior nos homens em relação às mulheres. Nos Estados Unidos, os carcinomas de células transicionais (TCC) são responsáveis por mais de 90% dos casos, enquanto os carcinomas espinocelular (CEC) têm uma incidência de menos de 2% 2. A taxa de sobrevida em 5 anos relativo global para papilar TCC é de 91,5% em comparação com apenas 30,9....
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Protocolo
Todos os estudos em animais e experimentos foram conduzidos em um protocolo aprovado pela University of California, Davis Institutional Animal Care e do Comitê Use Consultivo Administrativo.
1. MUC1.Tg Rato Breeding e Propagação
- O Davis Programa de Biologia Rato UC (MBP) raças tipo camundongos C57BL / 6 machos selvagens com heterozigotos MUC1.Tg C57BL / 6 do sexo feminino para estabelecer a nossa colônia de reprodução. MUC1.Tg filhotes são entregues para os estudos, conforme necessário.
- Pessoal MBP cortar os dedos do filho em um padrão definido (0-99) para identificação mouse, e quando aplicável clipe da cauda. O dedo....
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Resultados
A avaliação pré-clínica dos efeitos de novas imunoterapias e combinações no cancro da bexiga, exige o desenvolvimento de um modelo animal adequado. Em nosso modelo de camundongo transgênico, a indução com o carcinógeno químico OH-BBN resultou em uma alta taxa de incidência de câncer de bexiga predominantemente TCC com algum SCC, que é semelhante ao câncer de bexiga em humanos. Para determinar a histologia do tumor, estado de MUC1 expressão e a resposta imunitária ao tratamento com a vacina peptídica, MUC1.Tg 21 e 18 rat.......
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Discussão
A indução bem-sucedida de carcinoma de células transicionais da bexiga e escamosas invasivo em ratos MUC1.Tg humanos oferece um modelo pré-clínico para o desenvolvimento de imunoterapia. Estudos imunoteraptico requerem o uso de um modelo espontâneo intacto, imune a fim de avaliar a resposta inflamatória a progressão do tumor ao longo do tempo, bem como a resposta imunitária a imunoterapia. Em um modelo de desenvolvimento de tumores espontâneos, o microambiente do tumor permanece intacta e os tumores se desenvolvem a uma.......
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Divulgações
DPV, GTW, SMG, CJK, AMG, e GKH declaram que não há interesses conflitantes. MWD é o investigador principal de um subsídio recebido da Merck KGaA, e MW é um funcionário da Merck KGaA.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Programa de Biologia Rato Davis UC para a reprodução dos ratos. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | |||
| N-butil-N-(4-hidroxibutil)-nitrosamina (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Agulhas de Gavagem | Popper Sons, Inc. | 7921 | Vacina |
| Peptídica | N / A | N / A | agente investigacional |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| de tecido | Simport | M490-12 | |
| 10% Forma tamponada neutra | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Coquetel de inibidor de fosfatase | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Contas de microesferas magnéticas | Luminex | MC100xx-01 | xx é a região do grânulo |
| Anti-mouse TNF- Anticorpo de captura | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anticorpo de detecção de TNF anti-rato | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anticorpo de captura IFN anti-rato | Abcam | ab10742 | |
| Anti-rato IFN- Anticorpo de detecção | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7,4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Tampão de ensaio | Millipore | L-MAB | |
| Placas de filtro padrão | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well | da Cytokine Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Peneiras | ||
| BD | 352360 | ||
| Meios de separação de esplenócitos | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 Placas ELISpot | R& D Systems | ELD5217 | |
| anticorpo monoclonal anti-MUC1 de coelho | Epitomics | 2900-1 | |
| anticorpo monoclonal anti-actina de cabra | Sigma | A1978 | |
| Anticorpo HRP anti-coelho | Promega | W401B | |
| Anticorpo HRP anti-rato de cabra | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| Membrana PVDF | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Géis Pré-moldados | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Kit de Viabilidade | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Anticorpo | BD Pharmingen | 550486 | IHC |
| Anticorpo Animal Research Peroxidase | Kit Dako | K3954 | Coloração IHC |
| Equipamento e Software | |||
| Millipore Aparelho de vácuo de placa | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Fabricado pela Luminex, distribuído pela Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Versão 3.1; incluído com o Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Versão 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Versão 1.1.0.0; incluído com |
| Microscópio de Dissecação | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N / A | Versão 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel aparelho | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell e PowerPac | BioRad | 170-3849 |
Referências
- Siegel, R., Naishadham, D., et al. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Lynch, C. F., Davila, J. A. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. , National Cancer Institute, SEER Program. Bethesda, MD. 07-6215(2007).
- Jacobs, B. L.,....
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Reimpressões e permissões
