Summary
<em> Caenorhabditis elegan </ em> est un modèle utile pour explorer les fonctions d'acides gras polyinsaturés dans le développement et la physiologie. Ce protocole décrit une méthode efficace de compléter la <em> C. elegans </ em> alimentation avec des acides gras polyinsaturés.
Abstract
Les acides gras sont essentiels pour de nombreuses fonctions cellulaires. Ils servent molécules de stockage d'énergie efficaces, forment le noyau hydrophobe des membranes, et de participer à diverses voies de signalisation. Caenorhabditis elegans synthétise toutes les enzymes nécessaires pour produire une gamme d'acides gras oméga-6 et oméga-3 acides gras. Ceci, combiné avec la simple anatomie et la gamme d'outils génétiques disponibles, en font un modèle intéressant pour étudier la fonction des acides gras. Afin d'étudier les voies génétiques qui assurent la médiation des effets physiologiques des acides gras alimentaires, nous avons mis au point un procédé pour compléter l'C. alimentation elegans avec des acides gras insaturés. La supplémentation est un moyen efficace pour modifier la composition en acides gras de vers et peut également être utilisé pour sauver les défauts de mutants déficients en acides gras. Notre méthode utilise la croissance à moyen agar nématode (NGM) additionné de sels gras de acidsodium. Les acides gras présents dans les plaques deviennent incorporation complétéested dans les membranes de la source d'alimentation bactérienne, qui est ensuite reprise par le C. elegans qui se nourrissent de bactéries complétées. Nous décrivons également un protocole de Chromatographie en phase gazeuse pour contrôler les changements dans la composition d'acide gras qui se produisent dans les vers complétés. C'est un moyen efficace de compléter les régimes de grandes et de petites populations de C. elegans, permettant une gamme d'applications de cette méthode.
Introduction
Les acides gras sont des composants structurels essentiels des membranes ainsi que des molécules de stockage d'énergie efficace. En outre, les acides gras peuvent être clivés à partir de membranes cellulaires par des lipases et peuvent être modifiées par voie enzymatique pour produire des effecteurs de signalisation 1. D'origine naturelle des acides gras polyinsaturés (AGPI) contiennent deux ou plusieurs doubles liaisons cis. Les acides gras oméga-3 acides gras et les acides gras oméga-6 se distinguent l'une de l'autre sur la base des positions des doubles liaisons par rapport à l'extrémité méthyle de l'acide gras. Une alimentation saine exigent à la fois acides gras oméga-6 et oméga-3 acides gras. Cependant, les régimes occidentaux sont particulièrement riches en acides gras oméga-6 acides gras et pauvres en oméga-3 acides gras. Une haute teneur en oméga-6 et oméga-3 ratio d'acide gras est associée à un risque accru de maladies cardiovasculaires et inflammatoires, cependant, les fonctions bénéfiques et nuisibles précis d'acides gras spécifiques ne sont pas bien comprises 2. Les ascaris elega Caenorhabditisns est utile pour étudier la fonction des acides gras, car il synthétise toutes les enzymes nécessaires pour produire une gamme d'acides gras oméga-6 et oméga-3 acides gras, y compris une oméga 3 désaturase, une activité qui est absente dans la plupart des animaux 3,4. Mutants dépourvus enzymes désaturase d'acide gras ne parviennent pas à produire des PUFA spécifiques, conduisant à une série de défauts de développement et neurologiques 4-6.
Pour étudier les effets physiologiques des acides gras alimentaires, nous avons développé un dosage biochimique compatible avec l'analyse génétique en utilisant les deux techniques knock-down ARNi mutant et C. elegans. La supplémentation avec des PUFA spécifiques est obtenue en ajoutant une solution de sel de sodium d'acide gras dans le milieu d'agar avant la coulée. Cela se traduit par l'absorption par le PUFA E. source de nourriture coli, où il s'accumule dans les membranes bactériennes. C. elegans ingèrent les bactéries contenant des AGPI, et ce complément alimentaire est suffisante pour sauver le défectueuxts de mutants déficients en AGPI. La supplémentation de la plupart des acides gras n'a pas d'effets néfastes sur les animaux de type sauvage, cependant, oméga-6 acides gras spécifiques, en particulier l'acide dihomo-gamma-linolénique (DGLA, 20:03 n-6) causer une destruction permanente de C. elegans cellules germinales 7,8.
Chromatographie en phase gazeuse est utilisé pour surveiller l'absorption de l'acide gras complétée dans la source de nourriture bactérienne (soit OP50 ou HT115), ainsi que dans les nématodes. L'addition du Tergitol de détergent (NP-40) dans le support permet d'obtenir une distribution uniforme des acides gras à travers toute la plaque et l'utilisation plus efficace des acides gras par le E. coli et les nématodes. Nous avons découvert que les acides gras insaturés sont facilement absorbés par les bactéries et C. elegans, mais l'absorption d'acides gras saturés est beaucoup moins efficace. Cet article décrit étape par étape comment compléter les médias agar avec des acides gras, ainsi que la façon de contrôler l'absorption des acides gras dans le ee nématode par chromatographie en phase gazeuse.
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Protocol
Les acides gras polyinsaturés sont sensibles à la chaleur, la lumière et l'oxygène. Par conséquent, des précautions doivent être prises lors de la préparation de plaques de supplémentation d'acides gras tels que les acides gras ne sont pas exposés à une chaleur excessive et de la lumière. NGM support contenant 0,1% de Tergitol (NP-40) sont passés à l'autoclave et partiellement refroidies, après quoi les sels de sodium d'acides gras sont ajoutés sous agitation constante. Les plaques sont laissées à sécher à l'obscurité. L'absorption des acides gras par C. elegans cultivé sur ces plaques peut alors être surveillé par Chromatographie en phase gazeuse.
Une. Préparation des acides gras Supplement médias
- Mesurer composants multimédia dans un ballon de taille appropriée. Par 1 L, ajouter 17 g de Bacto-agar, 2,5 g de tryptone, 3 g de NaCl, 1 ml 5 mg / ml de cholestérol dissous dans de l'éthanol, et 10 ml de 10% Tergitol dissous dans l'eau.
- Ajouter 80% du volume final souhaité de l'eau Millipore et l'autoclave les médias ainsi que des bouteilles de verre vide (égal au nombre de différentsLes concentrations d'acides gras à tester), ainsi que des éprouvettes graduées appropriées.
- Médias refroidir dans un bain-marie réglé à 55 ° C. Bien que le milieu est refroidit à préparer la solution de travail de réserve de sel de sodium d'acide gras en brisant ouvert le flacon de verre, en utilisant des mesures de sécurité et d'assurer des particules de verre ne se mélangent pas avec les acides gras. Peser suffisamment d'acide gras pour faire un stock de travail 100 mM.
- Porter la solution d'acide gras à une concentration finale de 100 mM avec de l'eau purifiée. Dissoudre entièrement le sel de sodium d'acide gras prend généralement environ 20 à 30 min. Purger le stock de travail d'acide gras avec de l'argon ou de l'azote, parce que le contact avec un gaz inerte empêche l'oxydation. Boucher le flacon et stocker le stock de travail dans l'obscurité jusqu'à ce que les médias aient refroidi.
- (Facultatif) Si ARNi médias est souhaitée, de mesurer l'ampicilline et isopropilene β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) solutions ici.
- Lorsque la gélose est refroidie à 55 ° C, ajouter par 1 L: 1ml de 1 M MgSO 4, 1 ml de 1 M de CaCl2, et de 25 ml de tampon phosphate (108,3 g KH 2 PO 4 et de 35,6 g de K 2 HPO 4 pour 1 L à l'autoclave). Ajouter le filtre stérilisé ampicilline et solutions IPTG si la fabrication de plaques de RNAi. Pour tous les types de plaques, ajouter de l'eau stérile pour porter le volume de médias final à 1 L.
- Près d'une flamme, transférer des médias à une autoclave et taille appropriée éprouvette graduée puis ajouter de l'eau chaude stérile au volume désiré. Transfert médias retour au flacon initial et mélanger en remuant.
- Près d'une flamme, transférer médias dans un certain nombre de bouteilles égal au nombre de concentrations à tester en mesurant avec un autoclave et de taille appropriée éprouvette graduée. Maintenir les médias aliquotés comme liquide en utilisant un bain d'eau jusqu'à ce que le stock de travail d'acide gras a entièrement dissous.
- Placez une bouteille sur une plaque d'agitation et remuer jusqu'à ce que le support est chaud au toucher, mais pas chaud. Assurez-vous de vous laisser assez detemps à remuer dans la solution mère d'acide gras et versez plaques devant les médias commence à se solidifier. Si la plaque d'agitation a le contrôle de la température, réglez-le à 55 ° C.
- Diluer le stock de travail d'acide gras de 100 mM dans le milieu de la concentration finale souhaitée. médias Remuer jusqu'à ce que le précipité blanc est en solution (environ 1 min). Les médias peuvent encore être légèrement nuageux par la suite.
- (Facultatif) Si l'on souhaite ARNi médias retenir l'ampicilline à 0,1 mg / ml et 2 mM d'IPTG à une concentration finale.
- Verser médias utilisant une aide de la pipette automatique et une aiguille stérile de 25 ml pipette, en ajoutant 8 ml de milieu par 60 mm plaque ou 25 ml de milieu par plaque de 100 mm. Répéter addition d'acide gras et de la plaque de coulée étapes pour les bouteilles restantes.
- Après solidification de la gélose, couvrir les plaques d'acides gras supplémenté avec une boîte ou un magasin à la température ambiante dans un tiroir bien ventilé à l'abri de l'oxydation de la lumière.
- Graine E. coli OP50 sur des plaques, deux jours après les plaques ont séchées.Pour les plaques de 60 mm, une pipette 300 ul d'une culture d'une nuit OP50 (cultivée à 37 ° C). Si les plaques d'ARNi ont été versés, semences avec 300 pi de bactéries ARNi après les plaques ont séché pendant quatre jours. Plate temps de séchage peut être nécessaire de modifier en raison des différences d'humidité dans divers environnements de laboratoire.
- Incuber les plaques dans un environnement sombre à la température ambiante pendant la pelouse bactérienne est le séchage.
2. Induire la destruction des cellules germinales par la supplémentation de DGLA
- C. elegans cultivées sur des plaques contenant mM DGLA 0,3 (20h03 n-6) deviennent stériles à cause de la destruction des cellules germinales dans les deux nématodes de la scène et adultes larvaires.
- Préparer une population synchronisée des larves L1 en traitant hermaphrodites gravides avec une solution d'hypochlorite alcalin (pour une solution à 10 ml: 0,5 ml de NaOH 5M, 2,5 ml d'eau de Javel, et 7 ml H 2 O). Secouez délicatement les hermaphrodites gravides dans cette solution jusqu'à ce que le ver adultes dissoudre. Les œufs sont conservés, et peuvent être rassemblées en un culot par centrifugation à faible vitesse.
- Laver la préparation d'oeuf 3 fois dans du tampon M9 (3 g KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O de 1 L. Ajouter MgSO 4, après passage à l'autoclave). Afin de fournir suffisamment d'oxygène, de remettre en suspension les oeufs dans un tube en plastique de 15 ml à un volume final de 5 ml de tampon M9 et de la roche sur un agitateur pendant une nuit.
- Larves L1 doit être ajouté aux plaques supplémenté deux jours après l'ensemencement avec OP50, ou un jour après l'étalement des bactéries d'ARNi. Incuber les vers à 20 ° C pendant trois jours, ou jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade adulte.
- Les vers adultes peuvent être marqués de la stérilité en utilisant un microscope à dissection avec un grossissement assez haut pour visualiser le développement des embryons dans l'utérus. Succès la perte de cellules germinales apparaît comme un vide de l'utérus clair des œufs.
- Les vers peuvent également être marqués par la fixation et coloration avec l'acide nucléique d'uncid colorant diamindinophenylindole (DAPI), ce qui facilite la visualisation des noyaux dans les cellules germinales et les embryons en développement. Une tache de DAPI rapide est réalisé par la cueillette vers dans une goutte de tampon M9 sur un verre de montre 9.
- Flood verre de montre avec 1 ml de 0,2 ng / m. DAPI dans une solution d'éthanol à 95%, laisser reposer pendant environ 5 min.
- Choisissez vers dans une goutte de Vectashield sur une lame, puis couvrir avec une lamelle.
- lamelle de Seal et conserver à 4 ° C dans l'obscurité pendant une nuit pour la coloration optimale, mais les diapositives peuvent également être consulté immédiatement. Note pour la présence ou l'absence de noyaux de cellules germinales à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé d'une lampe UV et filtre.
3. Confirmant acides gras absorption par chromatographie en phase gazeuse
Composition de C d'acides gras globale elegans peuvent être déterminées par la production d'esters méthyliques d'acides gras (FAME) qui sont ensuite séparés et quantifiés à l'aide de gaz chromatography 4.
- Recueillir 500-1000 vers adultes en les lavant hors des plaques avec de l'eau et de transférer à un 13 mm x 100 mm tube supérieur de vis de verre silanisée.
- Laissez vers déposent par gravité, puis retirez autant d'eau que possible avec une pipette Pasteur en verre.
- Laver avec de l'eau une fois vers, puis retirez à nouveau autant d'eau que possible.
- FAMEs sont formées en ajoutant 1 ml de 2,5% de H 2 SO 4 dans le méthanol, puis chauffage à 70 ° C pendant 1 heure dans un bain d'eau.
- Enlever les tubes du bain d'eau et de refroidir pendant 1 min.
- Extrait FAMEs en ajoutant 1,5 ml d'eau et 0,25 ml d'hexane.
- tubes de reboucher et agiter vigoureusement.
- Tubes à centrifuger dans une centrifugeuse clinique de table pendant 1 min à vitesse maximale pour séparer l'hexane de solvant aqueux.
- Transfert hexane (couche supérieure) pour un insert GC flacon dans un flacon de GC, en faisant attention à ne pas transférer de la phase aqueuse. Pour un GCnalyse, 1-2 pi de FAME à l'hexane est injecté sur une colonne de chromatographie en phase gazeuse capillaire polaire adapté pour l'analyse des FAME. Injecteur de GC Agilent 7890 est fixée à 250 ° C, avec un débit de 1,4 ml / min, et le four de GC est programmé pour une température initiale de 130 ° C qui est maintenue pendant 1 min. Par la suite, la température est en rampe de 10 ° C / min jusqu'à 190 ° C, puis de nouveau en rampe à 5 ° C / min jusqu'à 210 ° C et maintenue pendant 1 min.
- Pour faire en sorte que l'absorption de DGLA a eu lieu, l'analyse FAME de détection de ionisation de flamme (FID) ou la spectrométrie de masse (MS) la détection, en utilisant des étalons authentiques pour l'identification de l'C. elegans acides gras.
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Representative Results
La supplémentation de la C. elegans alimentation est limitée par la capacité de la source d'alimentation à l'absorption de bactéries et d'incorporer des acides gras dans la membrane bactérienne. Pour déterminer la capacité de E. coli OP50 à assimiler différents acides gras dans ses membranes, OP50 a été plaqué sur des supports sans supplément, 0,1 mM et les concentrations mM 0,3 d'acide stéarique (18h00), l'oléate de sodium (18:1 n-9), et le sodium DGLA (20 : 3n-6). Les plaques ont été séchées à température ambiante pendant 2 jours à l'obscurité, et incubées à 20 ° C pendant 3 jours. Pelouses bactériennes ont été collectées en grattant doucement la pelouse dans de l'eau avec une spatule flambé. Les bactéries ont été sédimentées par centrifugation et traitées avec 2,5% de H 2 SO 4 dans le méthanol pour produire des esters méthyliques d'acides gras, qui ont été analysés par GC / MS en suivant les méthodes indiquées dans la procédure, étape 3. Les résultats démontrent que les acides gras insaturés (oléate de DGLA) et incorporent à OP50 en quantités plus élevées que t il saturé d'acide gras de l'acide stéarique (Figure 1A).
En outre, les larves L1 de N2 de phase ont été cultivées sur le même lot de plaques et supplémenté récolté après trois jours de croissance à 20 ° C. Les vers ont été éliminées par lavage des plaques et des acides gras totaux dans les préparations à vis sans fin ont été analysés par GC / MS. Le changement dans les acides gras est complétée en graphique dans la figure 1B. Ces études démontrent que la supplémentation en acides gras saturés ne change pas la quantité relative d'acides gras saturés présents dans les tissus à vis sans fin, tandis que la supplémentation en acides gras insaturés, a augmenté les quantités relatives des acides gras insaturés en C. lipides elegans. Prises ensemble, les données représentées sur la figure 1A et la figure 1B montrent que l'accumulation relative d'acides gras en C supplémenté elegans est en corrélation directe avec l'accumulation relative d'acides gras dans le régime alimentaire E. coli.
e_content "> Nous avons précédemment montré que le DGLA alimentaire provoque la stérilité chez C. elegans 10. figure 2 illustre la réponse à la dose de DGLA induction de la stérilité chez C. elegans. DGLA La concentration de lipides dans la vis sans fin dans lequel 50% de la population aura stérile est d'environ 12%. Fait intéressant, la réponse à DGLA peut être modifié par des mutations génétiques chez C. elegans. Une découverte récente est que les facteurs dépendant de voies de stress de croissance de l'insuline peuvent supprimer la destruction des cellules germinales induite DGLA-8. Compléter le régime des vers contenant des mutations délétères soit dans le récepteur daf-2 l'insuline / IGF, daf-2 (e1370), ou le facteur de transcription daf-16/FOXO, daf-16 (mu86), illustre l'utilité de cette méthode pour éclaircir les voies génétiques qui influence les effets physiologiques de graisses alimentaires. larves L1 ont été synchronisée à la pipette sur les médias DGLA complétées. Après 3-4 jours de croissance, vers ont été marquéspour la stérilité, comme déterminé par l'absence d'oeufs dans l'utérus des vers adultes. DGLA complété daf-2 (e1370) mutants étaient fertiles, avec peu ou pas de perte de cellules germinales induite par rapport au type sauvage (N2) des vers à la fois 0,15 mM et 0,3 supplémentations mM (figure 3). Par contre, DGLA complétée vers avec FOXO inactif (daf-16 (mu86)) affiché un pourcentage plus élevé de vers stériles par rapport au type sauvage lorsqu'il est alimenté sur des plaques contenant 0,15 mM DGLA (Figure 3).
Figure 1. L'absorption et l'incorporation des acides gras, complétée par E. coli OP50 et C. elegans. A. E. coli OP50 a été cultivée sur des plaques contenant 0,1 mM ou 0,3 mM d'acide stéarique, l'oléate de sodium, le DGLA ou de sodium ainsi que des plaques d'un-complétée. Après five jour de croissance sur des plaques à 20 ° C, E. coli ont été récoltées et les esters méthyliques d'acides gras ont été générées pour l'analyse par GC / MS. Parce OP50 ne produit pas d'acide oléique ou de DGLA, et ne produit que des traces d'acide stéarique, le pourcentage de chaque acide gras supplémenté en E. lipides coli révèle la capacité de OP50 pour incorporer l'acide gras complétée. Les barres d'erreur sont SD. B. Variation de C. elegans acides gras chez les jeunes adultes cultivés pendant trois jours, à partir de stade L1, sur E. coli plaques contenant 0,1 mM ou 0,3 mM de l'acide stéarique, l'oléate de sodium, ou de DGLA. Les valeurs de la variation de l'acide stéarique et le DGLA ont été obtenues en soustrayant la quantité relative de 20:03 à 18:00 ou vers cultivées sur des plaques de ceux supplémenté de vers cultivées sur des plaques unsupplmented. Pour surveiller l'absorption de l'acide oléique, la somme de l'acide oléique, plus en aval C20 AGPI (20:03, 20:4 n-6, 20:4 n-3, et 20h05) ont été calculées à compléter et non supplémenté plates, parce que l'acide oléique est en outre constituée désaturé et allongé. Les barres d'erreur sont SD. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Des concentrations croissantes de DGLA dans les lipides des vers en corrélation avec l'augmentation de la stérilité en C. elegans. (N2) vers le type sauvage ont été traitées avec différentes concentrations de DGLA. Le DGLA% du total des lipides des vers et le% de la population qui est stérile est tracée pour est tracée pour 17 points de données provenant de cinq expériences d'alimentation indépendantes en utilisant des concentrations de DGLA alimentaires allant de mM DGLA 0-0,3. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Les effets physiologiques de compléter C. elegans avec DGLA. Starved L1 de type sauvage larvaire, daf-2 (e1370), ou daf-16 (mu86) ont été étalées sur non-complété, 0,15 mM ou 0,3 mM DGLA complété médias et cultivé à l'état adulte. Au moins 150 vers individuelles ont ensuite marqué pour la stérilité. Les daf-2 (e1370) mutants étaient presque complètement fertile, même à 0,3 mM DGLA, tandis que les mutants daf-16 (mu86) affichent une augmentation du nombre de vers stériles par rapport au type sauvage à mM DGLA 0,15. Les barres d'erreur sont SEM. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
Ici, nous décrivons une méthode de supplémentation de C. elegans avec des acides gras insaturés alimentaires. Comme mentionné ci-dessus, il faut prendre soin dans la préparation de plaques PUFA supplémenté en raison de la nature réactive des doubles liaisons dans les acides gras polyinsaturés des causes de ces acides gras pour être sensible à l'oxydation par la chaleur et de la lumière 11. Pour éviter l'oxydation, il est important d'ajouter le PUFA dans le milieu de gélose de liquide après que le support a refroidi à 55 ° C et stocke des plaques dans un environnement sombre.
D'autres ont introduit des acides gras libres à C. elegans en utilisant un support de DMSO ou de l'éthanol, soit par addition directe des acides gras par micro-injection dans la vulve 12-14. Sauvetage partiel de phénotypes mutants a été réalisée par une supplémentation en acides gras des plaques de croissance sans l'utilisation de Tergitol (NP40) de 14 à 15. Il ya apparemment une variété de moyens efficaces pour introduire l'acide gras en C. elegans, bien qu'il soit difficult pour comparer l'efficacité de diverses méthodes, car, dans la plupart des expériences, l'absorption des acides gras dans les nématodes n'a pas été surveillée. Nous constatons que notre méthode permet supplémentation cohérente et efficace de l'acide gras insaturé de la taille des populations de nématodes à quelques dizaines de milliers.
Nous avons trouvé qu'il est essentiel de surveiller l'absorption des acides gras complétées en C. elegans pour aider à l'interprétation des résultats expérimentaux. Par exemple, la fixation de l'acide gras par l'aliment dépend de la bactérie E. coli souche utilisée en tant que source de nourriture pour les nématodes. Nous avons trouvé que OP50 prend de plus grandes quantités d'acides gras insaturés que E. coli souches HT115, HB101, ou NA22, souches couramment utilisées pour nourrir des expériences de RNAi (HT115) ou utilisé pour la croissance des nématodes haute densité (HB101 et NA22). En raison de la variation de l'absorption de certains acides gras, il est important de tester plusieurs concentrations d'acide gras etpour contrôler l'absorption par chromatographie en phase gazeuse. La plupart des laboratoires ont obtenu le sauvetage de phénotypes mutants en utilisant des concentrations d'acides gras dans la plage de 0,08-0,2 mM 5,6,15-18, cependant, les effets sur la durée de vie ont été rapportés avec la supplémentation en acide arachidonique à une concentration aussi faible que 0,01 mM 14 , et d'autres ont utilisé des doses aussi élevées que 0,6 mM pour le sauvetage d'un phénotype induit par l'alimentation ARNi utilisant le HT115 E. coli souche 19. Dans nos mains, la supplémentation de E. coli OP50 avec des concentrations très élevées d'acides gras polyinsaturés, supérieure à 0,4 mM, conduisent à une accumulation excessive de lipides en PUFA alimentaires à vis sans fin, jusqu'à 50% des acides gras totaux. Cela conduit à une croissance lente et non spécifique des anomalies de la vulve.
Une limitation de la technique est l'incapacité à compléter efficacement avec des acides gras saturés. questions de solubilité au moment de l'ajout du supplément aux médias ainsi que l'adoption et l'intégration de sat inefficaceLes acides gras Unom dans E. coli quitter cette méthode plus appropriée pour compléter les acides gras insaturés (figure 1).
Notre méthode fournit reproductible supplémentation en acides gras mono-et poly-insaturés, y compris les acides gras normalement pas produites par C. elegans, tel que l'acide docosahexaénoïque (DHA, 22:6 n-3). Croissance et des anomalies neurologiques chez des mutants déficients en AGPI comme la graisse-3 peuvent être sauvés par des niveaux relativement faibles de AGPI 5. Supplémentation en acides gras peut être utilisé par les chercheurs qui souhaitent modifier la composition en acides gras de C. elegans par des moyens diététiques afin d'étudier une série de processus physiologiques.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions Chris Webster pour effectuer les expériences préliminaires de la figure 3 des résultats représentatifs et Jason Watts et Chris Webster des commentaires utiles sur le manuscrit. Le financement de cette étude a été fourni par une subvention des National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) à JLW. Certaines souches de nématodes utilisés dans ce travail ont été fournies par le Centre de Génétique Caenorhabditis, qui est financé par le Bureau NIH des programmes d'infrastructure de recherche (P40 de OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
References
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