Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Summary

Células-tronco neurais colhidas a partir do cérebro de adultos estão aumentando utilizado em aplicações que vão desde a pesquisa básica do desenvolvimento do sistema nervoso para explorar potenciais aplicações clínicas em medicina regenerativa. Isso faz com que o controle rigoroso das condições de isolamento e cultivo utilizados para cultivar essas células críticas a soar os resultados experimentais.

Abstract

Trabalho recente mostra que o sistema nervoso central (SNC) de regeneração e tumorigénese envolve as populações de células estaminais (SCS) residentes no cérebro adulto. No entanto, os mecanismos dessas células normalmente quiescentes empregar para garantir o bom funcionamento das redes neurais, bem como o seu papel na recuperação de lesões e mitigação de processos neurodegenerativos são pouco compreendidos. Estas células residem nas regiões referidas como "ameias" que fornecem um ambiente de sustentação envolvendo os sinais de modulação de ambos os sistemas vasculares e imunológicas. O isolamento, manutenção e diferenciação de SCs do SNC em condições de cultura definidas que excluem fatores desconhecidos, torna acessíveis ao tratamento por meios farmacológicos ou genéticos, proporcionando, assim, uma visão sobre o seu comportamento in vivo. Aqui oferecemos informações detalhadas sobre os métodos de geração de culturas de SCs do SNC a partir de regiões distintas do cérebro adulto e abordagens para avaliar a sua dpotencial ifferentiation em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos, in vitro. Esta técnica produz uma população homogénea de células como uma cultura em monocamada, que pode ser visualizado para estudar SCs indivíduo e da sua descendência. Além disso, pode ser aplicado através de vários sistemas de modelos animais e amostras clínicas, sendo utilizado anteriormente para prever respostas regenerativos no sistema nervoso adulto danificado.

Introduction

O dogma central da neurobiologia, previsto pelas observações fundamentais da citoarquitetura cerebral feita por Ramón Cajal Y. mais de um século atrás, considerou que a neurogênese era improvável após a adolescência, dada a complexidade das redes neurais encontrados no SNC ^1. Apesar do trabalho de Altman em 1960, e mais tarde Kaplan, demonstrando que ³ H-timidina poderia ser encontrado em neurônios maduros, indicando que, de fato, os neurônios estavam sendo geradas em áreas distintas do cérebro adulto, o dogma continuou a deter ^{2, 3.} Evidência continuou a montar com a pesquisa de Nottebohm descrevendo as mudanças sazonais no número de neurônios presentes no cérebro aves canoras ^4. Não foi até 1999, quando Gould et al trabalho. Publicado na geração de neurônios no hipocampo aumenta com o desempenho de tarefas de aprendizagem associativa em ratos, bem como as observações de Kornack e Rakic ​​demonstraçãoting continuou a neurogênese no macaco adulto que o conceito de um cérebro mais plástico menos rígido, foi reconhecido ^{5, 6.}

A pesquisa para a fonte celular para estes neurónios gerados de novo levar à descoberta de uma população particular de células estaminais (SCS), que residem em áreas do cérebro conhecida como nichos ^7. A zona subventricular e zona granular sub do hipocampo são consideradas como as duas principais regiões de origem neural ^8,9. As células isoladas a partir destes locais exibir a característica clássica de SCs derivados embrionárias ou fetais, a auto-renovação e diferenciação. No caso de células estaminais neurais (NSCs), que podem ser diferenciadas em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. Além disso, estes SCs coloração positiva para os marcadores NSC fetais, tais como o intermediário nestina proteína de filamento ^10. Os trabalhos mais recentes destaca que SCs não pode ser limitado a estes two áreas, e são, de facto, localizada em todo o cérebro como uma grande população de células quiescentes fortemente associadas com a vascularização ^11.

As observações de que a CT são mobilizados em resposta a uma lesão sugere a possibilidade de ser capaz de utilizar estas células para fins regenerativos para ajudar na recuperação da doença neurodegenerativa e acidente vascular cerebral ^{12, 13.} Este não é, ao contrário do papel que as células estaminais mesenquimais (MSCs) desempenhar na cicatrização dos tecidos conjuntivos, os quais são encontrados como células perivasculares que têm o potencial para se tornar osteoblastos, condrócitos e células adiposas ^14. No entanto, NSC não podem ser colhidas da mesma forma que as MSCs de medula óssea por aspiração de rotina e técnicas de centrifugação de gradiente de densidade e subsequentemente utilizado em terapias à base de células autólogas. Em consequência, outras fontes de células, tais como o uso de NSC fetais ou precursores neuronais derivadas embcélulas-tronco ryonic foram amplamente exploradas na doença animal e modelos de lesão com variados graus de sucesso ^15. Tecnologias de células-tronco pluripotentes induzidas, utilizando fontes de células somáticas oferecer uma outra avenida potencial para a produção de terapias baseadas em células terapeuticamente úteis para uma ampla gama de aplicações, superando a disponibilidade limitada e preocupações éticas sobre o uso de células embrionárias e tecidos fetais ^16. No entanto, a tradução clínica destes resultados tem provado ser uma tarefa difícil, como demonstrado nas lutas do tratamento de várias condições neurológicas com terapêutica baseada-SC aborda ^17,18, bem como um caminho tortuoso para aprovação das autoridades regulatórias. Como uma abordagem alternativa, a introdução de tratamentos farmacológicos específicos pode modular números NSC e facilitar a recuperação em modelos de doença de Parkinson e derrame ^19. Seja qual for a estratégia pode ser, a compreensão de como manipular eficazmente estas célulasrequer um sistema acessível in vitro.

Culturas de NSC pode ser realizada tanto como culturas agregadas, também conhecido como neurospheres, ou como uma monocamada ^8,20. Ambas as técnicas têm sido amplamente utilizados, o que permite o estabelecimento de condições de cultura definidos, ou seja, a utilização do Factor de Crescimento Epidérmico (EGF) ou o Factor de Crescimento de Fibroblastos básico (bFGF) como uma fonte de mitogénio, que fornecem para a expansão de precursores multipotenciais. Enquanto as culturas de neuroesferas podem ser mais adequados para estudar a capacidade de propagação clonal de um tipo de célula isolada, o sistema tem sido mostrado para produzir uma população mista de células durante a expansão ^21. Além disso, a estrutura fechada das neuroesferas faz manipulação farmacológica das células impraticável, e a interpretação da influência destes factores pode ter poderia ser confundidos devido ao microambiente estabelecida dentro do próprio neuroesfera. Culturas em monocamada, por outro lado, pode serutilizado em telas de elevada capacidade de bibliotecas de moléculas pequenas, proporcionando uma poderosa ferramenta para explorar os mecanismos de transdução de sinais que regulam o crescimento e diferenciação, SC, e abre a oportunidade de descobrir novos compostos que visam especificamente esta população de células.

Como consequência, a capacidade de gerar de forma reprodutível culturas de NSC adultas a partir de diferentes regiões de interesse no cérebro pode ser utilizado em um amplo espectro de aplicações de pesquisa, variando a partir de estudos de desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC), para explorar novas abordagens de medicina regenerativa . O protocolo aqui apresentado demonstra como a dissecar e avaliar o potencial de diferenciação das SCs SNC isolada a partir do cérebro do roedor adulto.

Protocol

O trabalho adere à Declaração de Helsinski ea Demonstração animal ARVO. Os animais foram utilizados para a coleta de tecido e todos os métodos relevantes foram seguidos de acordo com as instruções do biotério da Universidade de Dresden. Os animais foram manipulados e alojados de acordo com as diretrizes federais alemães para o uso e cuidado de animais de laboratório, eo estudo foi aprovado pelo Landesdirektion Dresden. Favor consultar com política veterinária da sua instituição (IACUC ou outro board) sobre a eutanásia metodologia apropriada.

Ação específica e as concentrações de trabalho de reagentes podem ser encontrados nas Tabelas de reagentes que acompanham esse protocolo.

1. Preparação Cultura Dish

1. Pratos de revestimento com um volume suficiente de 75 ug / ml de poli-L-ornitina (isto é, 2 ml / poço de uma placa de 6 poços) durante a noite na incubadora de cultura celular, 2 dias antes da data marcada dissecção.
2. Retirar a lavagem final, em seguida, adicionar a fibronectina (diluído 1:250, 4 ug / ml em PBS) para a placa e colocar os pratos na incubadora durante a noite.
3. Aspirar a fibronectina no dia da dissecção e lavar os pratos 2x com PBS. Retorne as placas ainda contendo o PBS de lavagem final para a incubadora até que o tecido dissociado está pronto para cultura. Naquele tempo, retire a PBS antes de chapeamento do tecido.
4. Armazenar as placas revestidas com poli-L-ornithinein incubadora durante até 3 semanas. As placas revestidas com fibronectina pode ser armazenado durante até 1 semana. Fibronectina revestimento pode ser realizado em menos de 2 horas, se urgente. A fibronectina é suscetível a desnaturação, não agitar a solução ou deixar secar os pratos.

2. Dissecção / chapeamento

1. Este protocolo é aplicável à utilização de três ratos adultos (3-6 meses de idade).
2. Chill cérebro seccionamento bloco em gelo antes da eutanásia dos ratos.
3. Coloque um tubo Falcon de 15 ml, que contém 5 ml de meio N2 com bFGF adicionado em gelo.
4. Eutanásia os ratos de acordo com a política veterinária da sua instituição.
5. Remover o cérebro do crânio, fazendo uma incisão abaixo da linha média da cabeça. Use uma pinça para descascar o osso permitindo o cérebro para ser cuidadosamente extraído.
6. Coloque o cérebro em um prato de 10 centímetros de Petri contendo PBS gelado. Isto irá remover qualquer cabelo residual e sangue. (Figura 1A)
7. Coloque o cérebro para o bloco de corte refrigerados. (Figura 1B)
8. Insira uma nova lâmina de barbear limpa para o bloco como mostrado na Figura 1C.
9. Inserir uma segunda mm caudal de barbear limpo lâmina 3 para o primeiro, tal como ilustrado na figura 1D.
10. Retire cuidadosamente as lâminas do bloco, levando com eles a seção de interesse.
11. Passe o secção ao largo da lâmina de imersão em PBS. (Figura 1E)
12. Colheita de tecido da área de interesse (neste exemplo usamos a comissura anterior, (anterior) ACA, Figura 1F) usando # 5 fórceps e recolher em um tubo de 15 ml contendo 1 ml de meio de N2 contendo bFGF.
13. Movimentar o tubo em uma capa de cultura de célula de fluxo laminar, continuando o restante do protocolo em condições estéreis.
14. Mecanicamente dissociar o tecido usando uma ponta de pipeta 1 ml ligado a uma pipeta P1000. Pipeta cima e para baixo várias vezes (cerca de 20x, a uma taxa de 1 ciclo de pipetagem por segundo), enquanto pressiona a abertura da ponta da pipeta contra o fundo do tubo cónico (Figuras 1G 1-3). Pare de trituração quando a solução torna-se homogênea.
15. Deixar a solução descansar por 2 minutos para permitir que qualquer tecido nondissociated maior para liquidar o fundo. (Figura 1G 4)
16. Recolher o homogenEOU sobrenadante e colocar num tubo cónico contendo 8,5 ml de meio de N2 + 20 ng / ml de bFGF, 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml de Ang2, e 200 nMJAK inibidor.
17. Placa-os em três poços de uma placa de 6 poços, usando 3 ml de solução diluída de células / poço.
18. Colocar a placa num incubador humidificado de células a 37 ° C, 5% CO _2, 5% O _2.

3. Cuidados diários

1. Substituir o meio das placas de cultura com Meio N2 contendo bFGF, Ang2, Dll4, e inibidor de JAK 24 h após o plaqueamento.
2. Adicionar um bolus de bFGF, Dll4, Ang2, e inibidor de JAK, no dia seguinte.
3. Continue esse processo alternado de mudanças de mídia e adições fatores para um total de 10-14 dias.

4. Indução de Diferenciação

1. Retire bFGF, Dll4, Ang2 e JAK inibidor contendo meio e substituí-lo por meio de N2 que não contém quaisquer outros fatores.
2. Mude o meio cada segundo dia.
3. Fixar as células depois de 10 dias e realizar imunocitoquímica.

5. Detecção imunocitoquímica

1. Aspirar o meio e fixar placas de cultura de células com 2 ml de paraformaldeído a 4% durante 20 min.
2. Lavar 2x com 3 ml de PBS durante 5 min cada.
3. Aspirar PBS, depois permeabilizar as células e bloquear por adição de 2 ml de PBS contendo 5% de soro normal de burro (NDS) e 0,1% de Triton X-100 durante 20 min.
4. Preparar a mistura de anticorpo primário em PBS contendo 5% de NDS. Anticorpo anti-nestina pode ser utilizado para a identificação de SCs, enquanto TUJ1 (classe III β-tubulina), anticorpos de GFAP, e CNPase podem ser utilizados em conjunto para uma coloração tripla de marcadores de diferenciação.
5. Aspirar a solução de bloqueamento e adicionar 1,5 ml da mistura de anticorpo primário em cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 90 min.
6. Remover os anticorpos primários e lavar 2x com 3 ml de PBS, e 1x com 3 ml de PBS contendo 5% de NDS durante 5 min cada.
7. Prepare os anticorpos secundários em PBS contendo 5% de NDS.
8. Aspirar a lavagem final e adicionar 1,5 ml de solução de anticorpo secundário em cada poço. Incubar no escuro durante 40 min à temperatura ambiente.
9. Remover a solução de anticorpo secundário e adicionar 2 ml de uma mancha DAPI recentemente preparada (500 ng / ml em PBS). Incubar durante 3 min.
10. Aspirar a solução DAPI depois lavar 3x com 3 ml de PBS durante 5 min cada. As células podem agora ser visualizadas com um microscópio de fluorescência.

Representative Results

A identificação da região de interesse a partir da qual a colheita de células estaminais neurais é o primeiro passo crítico e irá definir a quantidade de tempo que demora a obter uma placa confluente de células. Por exemplo, o SVZ é uma área neurogénica clássica e, por conseguinte, tem uma proporção relativa mais elevada de células estaminais neurais. No entanto, a técnica aqui apresentada pode ser utilizada com outras regiões não frequentemente reconhecidas como tendo um potencial neurogénica robusta durante a vida adulta. Para efeitos do presente protocolo, a comissura anterior (parte anterior). Enquanto algumas das células e detritos vai resolver sobre o chapeamento, o meio normalmente permanecem turvas como conseqüência da quantidade de material celular que está presente seguinte trituração. A primeira mudança de meio em 24 horas irá remover a maior parte deste. Como visualizado por microscopia de luz, há aparece ser uma grande quantidade de material celular restante, juntamente com os vasos sanguíneos, mesmo após a primeira mudança de meio. Durante o curso deNos próximos dias, as colônias de uma população de células em proliferação distinta se tornará visível ao microscópio (Figura 2A). Estas são as células estaminais neurais que foram seleccionadas para crescimento com a utilização do meio N2 contendo bFGF, Ang2, Dll4, e inibidor de JAK. Além disso, uma população de células fusiformes que mais alongado pode também estar presente (Figuras 2B e   C). Estas não são as células-tronco neurais (glia radial provável com base em morfologia e coloração), que acabará por ser ultrapassado pela proliferação de população de células-tronco neurais mais rápido. Ao longo de uma semana a 14 dias, as células tornam-se mais densos até atingirem confluência (Figura 2D). Estas culturas coloração positiva para um número de marcadores de células-tronco, incluindo nestina, Hes3, e Sox2. (Figuras 2E-H), proporcionando, assim, a confiança de que as populações de células que foram selecionadas e ampliadas são de fato as células-tronco neurais.A confirmação adicional provém da capacidade de FGF retirada a partir do meio, o que permite que as células se diferenciam em 10 dias, para gerar os neurónios, astrócitos e oligodendrócitos (Figura 2I).

Figura 1: Isolamento de secções de cérebro de rato para células estaminais neuronais adultas de colheita. A) de cérebro de rato adulto após a lavagem com PBS. B) Rat cérebro colocado em um aço inoxidável refrigerados seccionamento bloco. C) posicionamento aproximado das lâminas de barbear iniciais dentro do bloco para a produção de cortes coronais do cérebro. D) colocação de duas lâminas de barbear adicionais no bloco de corte. Note, mais finas lâminas de dois gumes foram utilizados para fins de demonstração para permitir a fácil visualização dos sections no bloco E). seções cerebrais coronais contendo áreas a serem colhidas. F) Diagrama esquemático do atlas do cérebro Paxinos destacando a zona subventricular como uma região neurogênica clássica, e comissura anterior a partir do qual as células foram colhidas para esse protocolo. G) imagens seqüenciais do processo de dissociação do tecido usando uma ponta de pipeta 1 ml ligado a uma micropipeta P1000. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 2: as células estaminais neuronais adultas in vitro. Uma) cultura de células estaminais neuronais adultas após uma semana. B) Exemplos de uma forma mais ampla de células de morfologia do fuso (red setas) ocasionalmente presentes nas culturas que não são as células-tronco neurais. C, D), nas condições de cultura definidas neste protocolo, as células-tronco neurais preferencialmente expandir. EH) A expressão de marcadores de células-tronco neurais, após 14 dias in vitro, Sox2 (verde) (E), 3 HES (vermelho) (F), e nestina (violeta) (L). I) A diferenciação de células estaminais neurais para dentro dos neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. Após a retirada mitógeno, as células foram autorizados a diferenciar por 10 dias, em seguida, histoquímica para GFAP (verde), TUJ1 (vermelho), e CNPase (azul). Immunostaining J) Hes3 em cérebro de rato adulto. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Discussion

Muitos dos passos críticos para o isolamento bem sucedido, expansão e diferenciação de células estaminais neurais do cérebro adulto são partilhados em comum com as técnicas de cultura de tecidos padrão. O objetivo de ter em mente é que NSCs isolados do cérebro adulto deve manter como muitas de suas características in vivo quanto possível (Figura 2J). Muitas vezes, um equilíbrio entre a necessária cautela e velocidade apropriada precisa ser atingido. O cuidado com o isolamento do cérebro do crânio vai fazer a identificação da região de interesse significativamente mais fácil. A remoção do tecido tão rapidamente quanto possível após a eutanásia dos animais, e mantendo a frio do cérebro durante a colheita e lavagem mantém-se mais rígida e muito auxilia no tratamento do tecido quando ele é colocado no molde de corte de aço inoxidável. Isto também minimiza o potencial para rasgar do tecido durante o processo de corte. O protocolo também se beneficia de ser able para obter as células para o ponto de plaqueamento rapidamente, pois isso aumenta a viabilidade das células, uma vez que eles são colocados em vitro. Lavagem tecido apropriado, previamente à realização também ajuda a reduzir o potencial de contaminação das culturas. Durante o processo de dissociação, trituração com uma ponta de pipeta de 1 ml deve ser vigoroso, mas feito de uma maneira a não gerar bolhas de formação de espuma em excesso ou da suspensão de células que afeta negativamente a sobrevivência celular. A primeira mudança de meio é também crucial uma vez que remove a maioria das células e uma nonattached detritos celulares que resulta do processo de dissociação do tecido que contém factores que são prejudiciais à sobrevivência da população inicial de células estaminais. Para melhorar a visualização seguinte imunocoloração, as células isoladas de fresco podem ser semeadas em lamelas de 25 mm de vidro colocadas no fundo das placas de 6 poços. As concentrações de poli-L-ornitina e fibronectina utilizado no revestimento deve ser aumentada para 500 ug / ml e 20 μg / ml, respectivamente. Como alternativa, várias lamelas de menores (ou seja, 12 mm) pode ser colocado em cada poço. Estes podem então ser processado para imunocoloração independentemente em poços separados de uma placa de 24 poços, reduzindo as quantidades de reagentes de coloração utilizadas para ter em conta os volumes mais pequenos. As lamelas são então montadas em lâminas usando um meio de montagem aquoso padrão.

Definindo a presença de NSC no cérebro adulto é de grande interesse no campo da neurobiologia. Existem duas abordagens gerais para identificar uma célula estaminal. Em um deles, um conjunto de biomarcadores com base em um perfil da população de células estaminais em questão a expressão do gene pode ser utilizada para a imagem los por imuno-histoquímica. Embora experimentalmente simples, ele não dá dados funcionais, nem define se as células têm as propriedades fundamentais das células estaminais, a capacidade de auto-renovar ou se diferenciar em vários tipos de células diferentes. Em outra abordagem, as células são isoladas em either uma população pura ou heterogênea, colocados em cultura, e há renovação de auto e propriedades multipotenciais são avaliados utilizando a população de células vivas. Esta abordagem fornece dados funcionais, e pode ser usado para provar inequivocamente "stemness" nestas condições in vitro experimentais particulares. No entanto, a dificuldade de manter estas células em cultura tem dificultado esta segunda abordagem funcional. Na verdade, a incapacidade de crescer NSCs de outras áreas do cérebro deixou a impressão de que há apenas alguns nichos especializados onde residem.

O método aqui apresentado permite a cultura de NSC de muitas áreas diferentes do sistema nervoso central. Esta técnica baseia-se nosso trabalho que elucidou uma via de transdução de sinal de grande importância para controlar o número de NSC tanto in vitro como in vivo. Os fatores incluídos neste protocolo foram selecionados com base em extensos estudos de transdução de sinal, Demonstrando que eles promovem o crescimento NSC através de um fator comum a transcrição Hes3. Os nossos estudos anteriores mostram que esta combinação particular produziu um aumento ainda maior em números NSC quando comparado ao usá-los individualmente. A escolha de qual suporte farmacológico é adicionado à cultura deve ser considerada no contexto da biologia a ser estudado. Por exemplo, enquanto ambos Ang2 e Dll4 ter um impacto positivo sobre o crescimento NSC, eles têm efeitos opostos sobre a formação de vasos ^22,23. Através de mais de otimização das condições de cultivo, novos biomarcadores adicionais além Hes3 provavelmente será identificado e expandir o número reconhecido de NSC no cérebro adulto ainda mais. Isto é exemplificado pela nossa observação de que as distinções entre a população de células Hes3 + a partir de diferentes áreas do cérebro que pode ser feito. Por exemplo, as células Hes3 + da espinal-medula, como aqueles a partir do SVZ e ACA, mostram um aumento de várias vezes o seu número quando cultivadas com estesfatores. Além disso, as células Hes3 + de todas estas regiões podem gerar eficientemente neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. No entanto, a expressão do gene e a morfologia dos tipos de células diferenciadas não é idêntica. Biomarcadores adicionais que distinguem entre os diferentes tipos de células Hes3 + será uma adição bem-vinda para o campo. O método aqui apresentado para permitir a produção eficiente de culturas NSC pode ser usado como uma ferramenta para atingir esse objectivo.

Tal como o NSC marcadores nestina e Sox2, o factor de transcrição Hes3 identifica uma população de células que, após isolamento pode ser propagada in vitro, bem como diferenciadas em tipos de células principais que constituem o sistema nervoso, neurónios, astrócitos, oligodendrócitos e ^11. No entanto, ao contrário destes marcadores mais comumente usados, Hes3 também identifica NSCs quiescentes; como conseqüência, muitas células Hes3 + não incorporam indicadores de mitose ⁽³ H-timidina ou BrdU) sob homeostático cCONDIÇÕES (e assim ter evitado técnicas de detecção clássicos). A aplicação do protocolo descrito aqui foi fundamental na descoberta desta população NSC. O número destas células em cultura aumenta quando tratados com factores produzidos a partir do endotélio vascular, incluindo a Delta4 Notch ligando, e Angiopoetin2, consistente com a sua localização perivascular in vivo ^24.

Tendo o pronto acesso a estas células isoladas a partir do cérebro adulto permite a experimentação para examinar como as células respondem ao nível de transdução de sinal de vários factores, e proporciona algumas indicações de previsão de como as células respondem in vivo. Olhando para além da medicina regenerativa, demonstramos que as condições de cultura descritos aqui têm relevância para a pesquisa do câncer também. Eles representar melhor o ambiente que as células-tronco cancerosas isoladas de glioblastoma multiforme experiência enquanto no paciente, permitindo o estudo of vias de sinalização que podem ser manipulados para se opor a um crescimento ^{de 30.} A ampla aplicação desta técnica poderia ter implicações significativas para vários aspectos da investigação e da medicina.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit