In vitro onderzoek naar de MexAB Efflux Pomp Van Pseudomonas aeruginosa

Summary

We presenteren een protocol voor het in vitro onderzoek van effluxpompen van Pseudomonas aeruginosa. Dit protocol maakt het genereren van een sterke, reversibele en afstembare proton gradiënt in het liposoom membraan en dus moet aanpasbaar aan elke membraaneiwit bekrachtigd door protomotive kracht.

Abstract

Er is een opkomende wetenschappelijke behoefte aan betrouwbare instrumenten voor het membraan eiwit transport. We presenteren een methode leidt tot de bereiding van efflux pompen van de Gram-negatieve bacteriën Pseudomonas aeruginosa in een biomimetische omgeving die zorgt voor een nauwkeurige onderzoek hun activiteiten vervoermiddelen. Drie voorwaarden zijn vervuld: compartimentering in een lipide-omgeving, gebruik van een relevante index voor het vervoer, en het genereren van een proton gradiënt. Het membraan eiwit transporter wordt opgelost in liposomen samen met bacteriorhodopsin, een licht-geactiveerde proton pomp die een proton gradiënt die robuust en omkeerbaar en afstembare genereert. De activiteit van het eiwit wordt afgeleid uit de pH variaties die binnen het liposoom met pyranin, een pH-afhankelijke fluorescente probe. We beschrijven een stap-voor-stap procedure waarbij membraan eiwitzuivering, liposomen, eiwit reconstitutie en vervoer eennalyse worden aangepakt. Hoewel ze specifiek ontworpen voor RND transporter, kan de beschreven methoden eventueel worden aangepast voor gebruik met andere membraaneiwit transporter bekrachtigd door een proton gradiënt.

Introduction

Integrale membraaneiwitten bevatten tot 30% van de genen gecodeerd in eukaryote genomen. Ze delen een centrale rol, zoals gate houden (receptoren), het transport van voedingsstoffen, ionen of schadelijke stoffen (vervoerders) of het handhaven van de permeabiliteit over membraan dubbellagen (kanalen) onder alle levende cellen ^1. Efflux pompen hebben een centrale rol in de weerstand tegen antibiotica ^2. In Gram-negatieve bacteriën Pseudomonas aeruginosa, dat wordt beschermd door een buitenste membraan transporters georganiseerd tripartiete systemen waar MexB de efflux pomp in het binnenste membraan, werkt samen met Mexa, een periplasmatische eiwit en OprM een buitenste membraan kanaal. De binnenste cytoplasmatische membraan eiwit werkt als een energie-afhankelijke pomp met brede substraatspecificiteit. De buitenmembraan-eiwit fungeert als een porine terwijl de derde een in de periplasmatische ruimte en wordt beschouwd als het gehele complex stabiliseren 3. Hieronder richten we ons op het ontwerp van een functionele assay voor de Mexa MexB samenstel.

Structurele gegevens heeft verzameld in de afgelopen 5 jaar door de röntgenbron bepaling van het homologe eiwit AcrB van Escherichia coli ^4-7. Hoewel het duidelijk van belang te koppelen deze informatie met dynamische en kinetische data, het ontwerpen van een functionele test voor deze transporter is een echte uitdaging ^8. Inderdaad moet de membraaneiwitten worden onderhouden membraneuze omgeving en gesloten ruimten worden gedurende een vectoriële transport van het substraat te bereiken.

Reconstructie van membraaneiwitten in proteoliposomen is uitgebreid gepresenteerd en beoordeeld (zie Rigaud en Levy ^9). Dergelijke protocollen zorgen voor de bewaking van membraaneiwitten activiteit, bijvoorbeeld door de substraten over het liposoommembraan. In dit geval voort uit de een beperkingenESCHIKBAARHEID titreerbare substraten (fluorescente, radioactieve, enz.) en het feit dat heel vaak deze substraten zijn hydrofoob en hebben de neiging om membranen ongeacht de aanwezigheid van de transporteur steken. Als alternatief kan men de spectroscopische variaties van een rapportage kleurstof gevoelig voor chemische veranderingen die optreden als gevolg van transport volgen. Zoals hierboven vermeld, protonen energie transport via MexB. Vandaar dat een relevante optie is de spectroscopische variaties van een pH-gevoelig rapportage kleurstof pH schommelingen door proton aangedreven substraattransport volgen volgen. De keuze van een fluorescente kleurstof vermijdt kunstmatig effect vanwege de hydrofobe aard van het substraat.

Een bijkomend probleem is het genereren van een proton gradiënt. Meerdere protocollen is te vinden in de literatuur. Onder hen is het gebruik van valinomycine techniek wijdverbreid, maar we hebben aangetoond dat het vervelend te voeren ^10-11. Bovendien isniet reproduceerbaar en is niet omkeerbaar. We hebben toevlucht tot het gebruik van bacteriorhodopsin (BR), een door licht geactiveerde proton pomp Halobacter Salinarium een halofiel marien Gram-negatieve obligaat aërobe archaeon. Dit eiwit wordt coreconstituted in liposomen met MexB en bij belichting, BR pompen protonen in de liposomen en creëert daarmee de ApH (zure binnenkant) nodig voor het eiwit aan het substraat ^12-13 vervoeren.

Protocol

1. Eiwit productie en zuivering

1. Mexa, MexB van Pseudomonas aeruginosa
   1. Transformeer de plasmiden de Mexa en MexB genen in een E. coli productie stam (bijv. C43 DE3). Plaat op LB Agar medium aangevuld met de juiste antibiotica. Kies een kolonie van een O / N precultuur te enten. De volgende ochtend, beënt de voorkweek in 1 L LB en groeien bij 37 ° C onder schudden (240 rpm).
   2. Zodra de cellen de exponentiële fase bereikt (OD ₆₀₀ = 0,6-0,8) induceren met 1 mM IPTG. Voer inductie gedurende 2-3 uur bij 30 ° C onder roeren.
   3. Centrifugeer cellen (9000 g gedurende 20 min) en resuspendeer in 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, 150 mM NaCl.
   4. Verstoren cellen met behulp van een Franse pers (10.000 psi, 4 pas). Gooi gebroken cellen en insluitingslichaampjes door centrifugeren bij 9000 xg gedurende 20 minuten.
   5. Pellet membranen 1 uur bij 100.000 xg en resuspend elke pellet in 30 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol 20% (w / v), 10 mM imidazool, 500 mM NaCl.
   6. Bepaal het totale membraan eiwitconcentratie met de BCA colorimetrische assay en oplosbaar membranen O / N met 2% dodecylmaltoside (DDM) in een eindvolume zodanig bepaald dat detergens: eiwit 1:1,5 (gew / gew).
   7. Ultracentrifuge bij 100.000 xg gedurende 1 uur aan niet oplosbaar en geaggregeerd materiaal weggooien.
   8. Incubeer het supernatant gedurende 2 uur bij 4 ° C met een nikkel hars (Mexa zuivering) of kobalt hars (MexB zuivering) geëquilibreerd met Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 5% glycerol (w / v), 10 mM imidazool, NaCl 500 mM, DDM 0.2%.
   9. Giet de hars in een lege kolom. Verzamel de Flow Through.
   10. Was de hars met 50 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol 20% (w / v), 10 mM imidazool, 500 mM NaCl, 0,2% DDM, daarna met 25 ml Bis-Tris 10 mM pH 6, glycerol 5% (w / v), 10 mM imidazool, 500 mM NaCl, 0,2% DDM.
   11. Elueer het pprotein met 20 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, 5% glycerol (w / v), 300 mM imidazool, 500 mM NaCl, 0,2% DDM.
   12. Concentreer het eiwit met een ultrafiltratie-inrichting tot 3 ml en belasting op een ontzoutingskolom geëquilibreerd met een imidazool-vrije buffer. Vlak voor reconstitutie (zie hieronder), ultracentrifuge de opgeloste eiwitten (100.000 g gedurende 20 min) om zich te ontdoen van lipiden en eiwitten unsolubilized. Concentraat vervolgens de proteïne opnieuw 0,3 ml.
2. Bacteriorhodopsin van Halobacter Salinarium
   1. Groeien Halobacter Salinarium cellen onder belichting bij 37 ° C gedurende 10 dagen in een vloeibaar kweekmedium dat 4 M NaCl, 150 mM _MgSO4, 10 mM citraat, 30 mM KCl, gistextract 5 g / L, pepton en 5 g / L.
   2. Verstoren cellen door dialyseren tegen gedemineraliseerd water.
   3. Zuiver het purperen membraan op een 30-40% (w / v) sucrose gradiënt (100.000 xg gedurende 17 uur).
   4. Oplosbaar membraan suspensie met 2% octylglucOside gedurende 24 uur bij 37 ° C (volume voor het oplosbaar om het membraan te resuspenderen in een 2:1 (w / w) detergens: eiwitverhouding). Schat de concentratie van opgeloste BR met ε (570 nm) = 54.000 ^M-1 cm ^-1. Vlak voor reconstitutie (zie hieronder), ultracentrifuge het opgeloste BR (100.000 xg gedurende 20 min) om zich te ontdoen van lipiden en eiwitten unsolubilized.
      Opmerking: De natieve membranen natuurlijk verrijkte BR dus geen verdere zuivering nodig.

2. Bereiding van proteoliposomen

1. Liposoomvorming: Put 400 gl DOPC opgelost in chloroform (25 mg / ml) in een bekerglas en voeg 1,5 mg cholesterol opgeslagen als een poeder. Droog ze net voor manipulatie onder een stoom van stikstof of vacuüm ten minste 1 uur in een glazen beker. De DOPC: cholesterol molaire verhouding 3,3:1.
   1. Nadat ze gedroogd, hydrateren de lipiden met 1 ml 25 mM HEPES pH 7,K ₂ SO ₄ 100 mM, 2 mM _MgCl2, 2 mM pyranine. De suspensie moet troebel lijken in dit stadium.
   2. Verwarm de oplossing gedurende 10 min bij 37 ° C. Sonificeer 10 min bij 40 W met 30 seconden puls, 30 sec pauze cycli bij kamertemperatuur. De schorsing moet duidelijk blijken in dit stadium.
   3. Om een ​​monodisperse populatie van liposomen te verkrijgen, voeren twee cycli van extrusie en voor elke cyclus, passeren de liposoomsuspensie door het filter minstens 11x. Voor de eerste cyclus gebruikt een poriegrootte van 200 nm en de tweede cyclus, gebruikt een poriegrootte van 100 nm. Dynamische Lichtverstrooiing metingen in deze stap worden uitgevoerd om de homogeniteit van de suspensie controleren.
2. Eiwit incorporatie
   Principe: membraaneiwitten kunnen worden gereconstitueerd in liposomen dankzij de solubiliserende effecten van detergentia. Wasmiddel-oplosbaar liposomen worden geïncubeerd met detergens gesolubiliseerde membraan eiwit en vorming van de proteoliposomes wordt veroorzaakt door een snelle eliminatie van het wasmiddel met polystyreen parels ^9.
   1. Voeg 28 mg Triton X-100 (0,56% eind) en geïncubeerd O / N bij 4 ° C (het oplossen temperatuur kan worden aangepast aan het eiwit worden onderzocht).
   2. Voeg de detergens gesolubiliseerde eiwit (BR, MexB en Mexa) om het opgeloste liposomen en incubeer 15 minuten bij 4 ° C. Voeg de eiwitten aan het opgeloste liposoomsuspensie in de volgende verhoudingen (gewicht / gewicht): lipiden / MexB = 20, MexB / Mexa = 2,5 en lipiden / BR = 30.
   3. Voeg polystyreen beads een 30:1 kralen: detergens verhouding (w / w, gezien het totale gewicht van het wasmiddel, zoals detergens met de gezuiverde eiwitten) en incubeer 5 uur in het donker (vanwege de BR) bij kamertemperatuur onder zachtjes roeren. Voorafgaand aan deze procedure activeert de biobeads met methanol en ethanol incubatie en uitgebreid wassen met water.
   4. Zuiver het proteoliposomen eiwit en gratis substraten met behulp van een PD-10ontzoutingskolom geëquilibreerd met 25 mM HEPES pH 7, K ₂ SO ₄ 100 mM _MgCl2 en 2 mM.
   5. Bewaar de proteoliposomen bij 18 ° C in het donker gedurende 2-3 weken.
3. Beoordeling van de reconstructie werkzaamheid op sucrosegradiënt.
   Om te controleren dat zowel de MexB en de BR zijn gereconstitueerd in liposomen, zuiveren de proteoliposome schorsing op een discontinue sucrosegradiënt.
   1. Voorzichtig vestigen de proteoliposomen op vijf lagen gradiënt van sucrose (60%, 20%, 10%, 5% en 2,5%, w / v).
   2. Ultracentrifuge voor 17 uur bij 100.000 xg (met minimale versnelling en vertraging tarieven).
   3. Zorgvuldig verzamelen verschillende gradiënt fracties (met name de interfaces tussen elke laag sucrose) en analyseren op SDS-PAGE (10%) met Coomassie kleuring en Western blotting. Geaggregeerde eiwitten worden gevonden op de bodem van de buis, terwijl nonincorporated, detergens gesolubiliseerde eiwitten gevonden bovenaande buis. Proteoliposomen en liposomen zijn te vinden op sucrose interfaces die overeenkomen met hun intrinsieke dichtheid. Lege liposomen worden verder hersteld in de helling dan de proteoliposomen.

3. Fluorescentiemeting

1. Voer fluorescentie metingen bij 25,0 ° C met een spectrofluorometer waardoor dual-golflengte metingen (Xe-lamp, 150 W). Afwisselende periodes verlichting (BR met excitatie / emissie golflengte van 550 nm / 550 nm te activeren) en fluorescentie metingen met excitatie / emissie golflengte van 455 nm / 509 nm 2 seconden ingedrukt om de pyranine fluorescentie meten. Stel de excitatie en emissie bandbreedtes tot 5 nm. Voer de metingen in de aanwezigheid van 50 nM valinomycine de vorming van een omgekeerde membraanpotentiaal ΔΨ voorkomen.
   Opmerking: Inderdaad, omdat de BR pompen protonen er meer positieve ladingen binnenin het liposoom dan buiten. Deze kostengradiënt kan worden weggegooid met valinomycine, een selectieve K ⁺ ionofoor. Eenmaal toegevoegd aan de liposomen suspensie valinomycine, een hydrofoob molecuul, wordt ingevoegd in de liposoommembraan, passief transport K ^+, en dus verdwijnen de membraanpotentiaal ΔΨ.

Results

De test bestaat uit het toezicht pyranine fluorescentie als een functie van tijd, terwijl een proton gradiënt gegenereerd. Daartoe worden monsters alternatief onderworpen aan verlichting (vandaar proton pompen door de BR wordt geactiveerd) en vervolgens te meten fluorescentie met behulp van de excitatie en emissie golflengten van pyranine (λ _ex = 455 nm en λ _em = 509 nm).

Figuur 1 toont een representatief controle verkregen met de test in afwezigheid van Mexa / MexB verifiëren dat het proton gradiënt gegenereerd door de BR is omkeerbaar. Na een cyclus van verzuring worden proteoliposomen in het donker gedurende 45 minuten bewaard zodat de BR stopt pompen protonen (protonen diffunderen langzaam en passief in lipide bilagen na hun concentratiegradiënt). Na deze herstelperiode activering van BR mogelijk, eenvoudigweg door opnieuw belichten van dezelfde suspensie.

Figuur 2overeen met een werkelijke meting transport. Een negatieve controle met eiwit bevattende liposomen blijkt dat, zoals verwacht, de pH constant bij belichting (Figuren 2A en 2B, oranje cirkels). Echter, proteoliposomen bevatten BR in hun membranen hebben proton pomp, waardoor de pH in de liposomen afneemt en een stabiele gradiënt gebouwd (Figuren 2A en 2B, paarse vierkanten). Grijze driehoeken en rode diamant (figuur 2A) vertegenwoordigt pH binnenkant van proteoliposomen die BR en MexB, in aanwezigheid of in afwezigheid van Hoechst 33342, respectievelijk. We zien een substraat-zelfstandige activiteit waar het proton gradiënt slechts gedeeltelijk wordt opgenomen door MexB contra-vervoer. Wij schrijven deze waarneming aan een basale activiteit van MexB.

Om het effect van Mexa op de activiteit van MexB testen, werd Mexa toegevoegd reconstitutie eerst in afwezigheid van substraat ( Figuur 2B, blauwe diamanten). Opnieuw wordt het proton gradiënt gegenereerd door de BR slechts gedeeltelijk afgevoerd. De werkelijke meting transport gerealiseerd op hetzelfde monster. Eerst moeten de protongradiënt worden geïnitialiseerd en het substraat moet worden toegevoegd in de suspensie teneinde de bindingsplaats in het proteïne te bereiken. Daartoe de suspensie wordt geïncubeerd in het donker in aanwezigheid van het substraat gedurende 45 minuten. Bij daaropvolgende belichting, kan men zien dat de proton gradiënt gegenereerd door de BR nu volledig opgenomen door MexAB (Figuur 2B, groen driehoeken), als gevolg van substraattransport door de pomp.

. Figuur 1 omkeerbaarheid van het proton gradiënt gebouwd door BR verlichting: pyranine fluorescence BR proteoliposomen gemeten als functie van de tijd. Van 0-15 min, BR pompen protonen als gevolg van licht activering. Van 15-60 min, worden proteoliposomen geïncubeerd in het donker, in deze tijd, protonen passief uit te gaan van de liposomen totdat de intravesicular pH en extravesicular pH gelijk. Van 60-75 min, BR is nog steeds functioneel en pompen protonen bij belichting.

. Figuur 2 Transport test: pyranine fluorescentie, omgezet in de overeenkomstige pH variaties, als functie van de tijd A) pH in controle liposomen (oranje cirkels), pH binnenkant van proteoliposomen die BR in het membraan (paarse vierkanten) pH binnen. van proteoliposomen die BR en MexB in het membraan zonder Hoechst 33342 (rodiamonds); pH binnenkant van proteoliposomen met BR en MexB in het membraan met Hoechst 33342 (grijze driehoekjes) B) pH binnenkant van controle liposomen (oranje cirkels);. pH binnenkant van proteoliposomen met BR in het membraan (paarse vierkanten); pH binnen van proteoliposomen met BR, MexB en Mexa in het membraan zonder Hoechst 33342 (Blue Diamonds), pH binnenkant van proteoliposomen met BR, MexB en Mexa in het membraan met Hoechst 33342 (groene driehoeken).

Discussion

We beschrijven een oplosprocedure ontworpen voor het testen membraaneiwit transport. Eenmaal vastgesteld, het eiwit reconstitutieprocedure tot metingen die zeer reproduceerbaar. Echter, de precieze voorwaarden voor het reconstitueren van het eiwit variëren van een eiwit aan het andere. Veel zorg moet worden genomen in het optimaliseren van de volgende parameters: i) de kwaliteit van de zuivering (zuiverheid en afwezigheid van geaggregeerde materiaal), ii) de doelmatigheid van het wasmiddel solubiliserend stap (als dat mogelijk is, moet laag cmc reinigingsmiddel de voorkeur omdat ze makkelijker te krijgen dump), iii) desorptie van het detergens (is het bijvoorbeeld mogelijk het gebruik van polystyreen kralen met een dialyse stap combineren maar kan de snelheid van desorptie, een kritische parameter voor de verdere activiteit van het eiwit beïnvloeden, zie ref [ 9]), iv) lipide bereiding (de chemische aard van het lipide, de lipide eiwitverhouding, de aanwezigheid van extra amphiphiles zijn kritische parameters die moeten worden aangepast en geoptimaliseerd). Naast temperatuur en incubatietijd van invloed op al deze kwesties.

Kwaliteitscontrole is dus primordiaal bij elke stap van de reconstitutie procedure. Vanuit dit oogpunt lichtverstrooiing is een zeer geschikte techniek omdat het snelle, niet-destructieve en het vereist slechts 20 pl monster in een concentratie in het micromolaire bereik. Zodra de proteoliposomen gevormd, sucrose gradiënt is ook van groot nut, omdat het de weg opent naar systematische controle van de reconstitutie: kwalitatieve (het eiwit inderdaad ingebed in het liposoom membraan) en kwantitatieve (hoeveel eiwit in een liposoom). De laatste zou worden aangepakt door nauwkeurig meten van het eiwit en lipide concentraties.

De test is niet afhankelijk van de titratie van het substraat zelf en vermijdt ongemakkelijke overwegingen over mogelijke artefacten passieve diffusie van het molecuul door hydrofobe afscherming in de membranen. De assay maakt gebruik van eigenschappen van pyranine als een betrouwbare en kwantitatieve probe voor controle pH-veranderingen. Onze resultaten zijn in overeenstemming met resultaten verkregen met een andere procedure waarbij protongradiënt vorming werd uitgevoerd met valinomycine ^10, maar het kan een meer robuuste en reproduceerbare gradiënt ^11. Bovendien kan de protongradiënt nauwkeurig afgesteld eenvoudigweg door het variëren van de concentratie van de buffer (voor verdere details zie Verchere et al.. ^12).

In de procedure een controlemeting wordt eerst uitgevoerd in afwezigheid van substraat (dit geeft toegang tot de passieve activiteit van het eiwit). De werkelijke membraaneiwit transporter-activiteit wordt vervolgens gemeten nadat het substraat toegevoegd in dezelfde cuvet. Dit is echt een actief omdat het experiment kan worden beschouwd als een echte, niet dubbelzinnig, substraat-geïnduceerde uitkomst.

ent "> Het protocol kan worden aangepast aan high-medium throughput (bijvoorbeeld 96-wells metingen) automatisering, omdat de verlichting van het monster triggers de reactie. Automatisering en parallellisatie zou bestaan ​​bij de voorbereiding van een grote partij proteoliposome, en in de verstrekking porties in een 96 -wells plaat. substraten (en ook remmers) zou dan worden toegevoegd en na incubatie in het donker gedurende 45 minuten de plaat zou worden blootgesteld aan verlichting / pyranine fluorescentie meetcycli op een microplaat lezer.

Voor aanvullende informatie over het protocol, wordt de lezer uitgenodigd om Verchere et al. lezen. ^12,13

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850375C
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8667
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Triton X-100	Sigma Aldrich	93427
Valinomycin	Invitrogen	V-1644
Pyranine (8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid)	Invitrogen	H-348
DDM (n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside)	Affymetrix	D310LA
Extruder kit (extruder, Hamilton gas-tight syringes)	Avanti Polar Lipids	610000
Biobeads SM-2 Adsorbents	Bio-Rad	152-3920
Econo-Pac Chromatography empty column	Biorad	732-1010
Desalting columns	Bio-Rad	54805
Dynamic light scattering instrument	Wyatt Technology	DynaPro NanoStar
Fluorometer JASCO FP-6200	JASCO	6816-J002A