生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

サマリー

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。

要約

脳室下帯（SVZ）は、出生後の脳内の主要な神経性のニッチの一つです。ここで、神経前駆細胞は増殖し、嗅球（OB）に向かって吻側細胞移動（RMS）に沿って移動することができる神経芽細胞を生じさせる。この長距離移動は、OBにおける新生ニューロンのその後の成熟に必要であるが、このプロセスを制御する分子メカニズムは未だ不明であるされている。神経芽細胞の運動性を制御するシグナル伝達経路を調査すると、神経発生における基本的なステップを理解するのに役立つだけでなく、治療上の再生能力を持っている、損傷、脳卒中、または変性の影響を受けた脳の部位を対象とし、これらの神経芽細胞の能力を与えられたことだけではなく。

本稿では、我々はin vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよびマウスのRMSにおける神経芽細胞の遊走のその後のタイムラプスイメージングのための詳細なプロトコルを記述します。出生後のエレクトロポレーションを効率的にSVZ前駆をトランスフェクトすることができる今度は、RMSに沿って移行する神経芽細胞を生成する細胞が、。急性脳スライス培養での共焦点スピニングディスクタイムラプス顕微鏡を用いて、神経芽細胞の遊走は、密接に、生体内の条件に似た環境で監視することができます。また、神経芽細胞の運動性を追跡し、定量的に分析することができる。一例として、我々は、RMSに沿って移行する神経芽細胞を標識し、可視化するために、GFP発現プラスミドのin vivo出生後のエレクトロポレーションを使用する方法について説明します。 loxPシステムを用いたコンディショナルノックアウトマウスのshRNAまたはCREリコンビナーゼ発現プラスミドのエレクトロポレーションはまた、目的の遺伝子を標的化するために使用することができる。急性脳切片培養物の薬理学的操作は、神経芽細胞遊走における異なるシグナル伝達分子の役割を調べるために行うことができる。タイムラプスイメージングと生体内エレクトロポレーションに結合させることにより、我々は、神経芽細胞の運動性を制御する分子機構を理解し、開発に貢献したいと考えてい小説のMENTは、脳の修復を促進することに近づく。

概要

哺乳動物の脳では、新しいニューロン（神経新生）を生成する、2つの領域、側脳室および海馬¹の歯状回における下帯の脳室下帯（SVZ）を中心に、出生後に発生します。近年では集まったかなりの証拠は、海馬や嗅球メモリ機能^1-3出生後の神経新生の重要な役割をサポートしています。重要なのは、出生後の神経新生はまた、治療のため神経変性疾患との関係の可能性、および脳^4-6で負傷部位に移動する神経芽細胞の能力を保持している。

脳室下帯（SVZ）は最近、重要な神経性のニッチとして浮上している。 SVZ由来の神経芽細胞は、この出生後の脳の^1,7,8の中で最も長い移行プロセス作り、吻側渡り鳥ストリーム（RMS）を介して嗅球（OB）に向かって移動。哺乳類SVZ / RMS / OBシステムになっていますこのような増殖、遊走及び分化^1,8などの神経発生における様々なステップを、研究するための有用なモデル。多くの増殖因子および細胞外の合図は、RMSに沿って、SVZニューロン新生と移動を調節するが、細胞内の分子メカニズムは今のところ、完全に^1,9を理解しているからである。 RMSに沿って適切な移行が新生ニューロン¹⁰のその後の成熟のために重要である。さらに、いくつかの研究は、SVZ由来の神経芽細胞は、脳損傷部位^4-6,11-13にRMS....

プロトコル

この手順では、英国内務省の規制（動物科学手続法、1986）に準拠しています。科学者たちは、彼らの機関や国の動物規制機関によって確立され、承認されたガイドラインに従う必要があります。

1。出生後のエレクトロポレーション

1.1。ガラス管は、DNAソリューションとエレクトロポの調製

1. DNA注入用のプルガラスキャピラリー（0.86ミリメートル：1.5ミリメートル、ID OD）を準備します。 （サッターP-97キャピラリープラーの指標設定は、次のとおりです。熱283; 50を引いて、速度90、タイム50）。約2μLの容量に対応したキャピラリーにマークを作る。
2. 850ミリ秒間隔（100 V、50ミリ秒のONパルスは、850ミリ秒、パルス5をOFFパルス）で、100 Vで5矩形パルス、50ミリ秒/パルスにエレクトロの電圧を設定します。
3. 1〜2μgの/μLの最終濃度になるように、高純度（OD 280分の260> 1.80）エンドトキシンフリーのプラスミドDNAを希釈エンドトキシンフリーのトリス-EDTA緩衝液またはPBSで。それは、DNA溶液（首尾注射した場合に染料が心室に広がる必要があります）に0.1％ファストグリーンを追加することをお勧めします。
4. 5〜7ミリの電極を用意し、電極ゲルと加熱パッドを温める。

結果

SVZ由来の神経芽細胞遊走の標識は、通常、4〜8日に成功し、エレクトロポレーション（ 図1B）の後に、RMSに沿って観察することができる。長い時間点も選択することができますが、それらのほとんどは、OBを入力してするので、少ない細胞は、RMSに記載されています。神経芽細胞は、約2〜3週間後にエレクトロポレーション（図示せず）のOBでの成熟顆粒細胞の典型的な形態や機能の取得を開始。 〜1時間培養した後、エレクトロポ仔マウスからの脳切片を確実にまで3-4時間にわたり画像化することができる。以前に報告されているよう^に23,26、神経芽細胞を定量（ 図4）トラッキングセルを用いて分析することができる、複雑な移行の動力学（ 図3及びビデオ1）を表示することができる。

ディスカッション

RMSに沿って神経前駆細胞の効率的な移行は、機能的なニューロン¹⁰に彼らのその後の成熟を ​​保証します。 OBに向けた神経前駆細胞の顕著な流れは、人間の初期の段階で表示され、出生後早期人間の脳の発達²⁷に重要な役割を果たしている可能性が高い。さらに、これらの細胞は傷害および神経変性^4,28の影響を受けた脳の部位を標的とすることができます。リアルタイムで神経芽細胞動態に遺伝子操作の影響を監視することができることは、完全に神経芽細胞の移動が案内され、規制されているかを理解することが不可欠となります。

ここでは、急性脳スライス培養の経時共焦点スピニングディスク顕微鏡でインビボ出生後エレクトロポレーションを結合することによってSVZ由来の神経芽細胞遊走をモニターするためのプロトコルを記載している。具体的には、神経前駆細胞を移行するSVZにおいて、プラスミドENCをエレクトロポレーションによって標識することができるかを示しているGFPをoding。研究の目的に応じて、プラスミドのいくつかのタイプ（

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ミリセル	ミリポア	PICM0RG50
35 mm ガラス底培養皿	MatTek	P35G-0-14-C
Gey's バランス培地	Sigma	G9779-500ML
グルコース、45%	Sigma	G8769-100ML
HEPES	ΣH3375-25G
ペン/溶連菌	GIBCO	15140-122
FCS	GIBCO	10109-163
B27 supplement	Invitrogen Life Technologies	17504044
L-Glutamine	Invitrogen Life Technologies	>25030-081
DMEM (フェノールレッドフリー)	GIBCO	31053-028
Fast Green	Sigma	F7252-5G
注射用ガラス毛細管	ハーバード装置	30-0057
アスピレーターチューブ	シグマ	A5177
サッター P-97 キャピラリープーラー	サッター装置	P-97
ECM830 矩形波エレクトロポレーター	ハーバード装置	45-0052
プラチナピンセット 7 mm	ハーバード装置	45-0488
フットスイッチ モデル 1250F	ハーバード 装置	45-0211
電極用ゲル	Cefar Compex	6602048
Isoflurane	Merial	AP/DRUGS/220/96
Vibratome	Leica	VT1000S
Glue	Roti coll	Roti coll 1
UltraViEW VoX スピニング ディスク システム	Perkin Elmer		浜松製作所搭載のカスタマイズセットアップ(複数のレーザー光源を使用可能)
OVOCITYソフトウェア Volocityソフトウェア	Perkin Elmer		取得・定量・可視化モジュール
顕微鏡用環境チャンバー	ソレント・サイエンティフィック		カスタムメイド
Ti-E倒立顕微鏡	ニコン		CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA 対物レンズは、このホワイトペーパーで説明するアプリケーションに最適です

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