교양 방광 상피 세포 간 인간 호중구 이주의 정량 평가

요약

우리는 uropathogenic 대장균 방광 감염 동안 급성 염증 반응의 중요 성분을 모방 체외 모델을 개발 하였다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 세균 감염이나 화학 유인 물질에 대한 응답으로, 투과 지원에서 배양, 방광 상피를 통해 인간의 호중구 이주의 양적 평가를 할 수 있습니다.

초록

염증의 사이트에 주변에서 면역 세포의 모집은 점막 표면에서의 선천성 면역 반응에 필수적인 단계입니다. 방광의 감염시, 다형 핵 백혈구 (PMN, 호중구)는 혈류에서 마이그레이션 및 방광 상피 세포를 통과. 호중구 응답이없는 상태에서 감염을 해결하지 않으면 방광 방어 PMN의 중요성을 보여줍니다. 방광 상피 uropathogenic 대장균 (UPEC)의 정착을 촉진하기 위하여, 요로 감염 (요로 감염)의 대부분의 원인 물질은, 부분적으로 정의 된 다양한 메커니즘을 사용하여 급성 염증 반응을 저해. 추가 호스트 및 세균성 병원체 사이의 상호 작용을 조사하기 위해, 우리는 UPEC에 타고난 면역 반응의 이러한 측면의 체외 모델을 개발했다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석에서, 보이든 챔버의 변형, 배양 방광 epithelial 세포 투과성 지원의 아래쪽에 합류로 성장하고 있습니다. PMN 인간 정맥 혈액으로부터 격리되어 방광 상피 세포층의 측저 측에인가된다. 세균 감염이나 화학 유인 물질 분자에 대한 응답으로 생리학 관련 기저 첨단으로 방향을 나타내는 PMN 마이그레이션은 혈구를 사용하여 열거됩니다. 이 모델은 UPEC 및 진핵 세포 사이의 상호 작용을 조사 할뿐만 아니라 PMN 의해 방광 상피의 순회를위한 분자 요구를 심문하는 데 사용될 수있다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 모델은 방광에 UPEC에 대한 초기 염증 반응에 대한 우리의 이해를 증진 할 것이다.

서론

몸 전체 세포의 이동은 종종 긴 거리에 걸쳐, 성장과 발달, 상처 치유 및 면역 반응에 필요합니다. 세포 이동은 복잡하고 신호 폭포와 골격 구성 요소의 재 배열 등 다양한 프로세스의 조정을 필요로한다. 세포는 정의 화학 그라데이션 (화성)으로 무작위로 (chemokinesis)를 이동뿐만 아니라 수 있습니다. 대부분의 기술은 체외에서 세포의 이동을 연구하기 위해 개발되었다. 가장 오래되고 가장 일반적인 방법, 보이든 챔버, 화학 주성 물질이 바닥 챔버와 그 세포에 배치 수직 두 개의 챔버 시스템의 구성은 상단 챔버 ^(1)에 배치됩니다. 두 개의 챔버를 분리 정의 된 크기의 기공을 가진 투과 필터를 통해 세포의 이동, 감시된다. 그 밖의 기술은 Zigmond 챔버 ⁽²⁾ 및 던 챔버 포함한 세포 이동을 조사하기 위해 개발되었다^3. 이러한 집단적인 접근 방식은 다양한 세포 유형의 운동으로 상당한 통찰력을 수득했다.

chemokinesis 및 주 화성의 기본 원리를 질의 이외에,이 챔버 분석법은 세포 외 기질 성분과 모두 내피와 상피 세포층을 통한 세포 이동의 조사를 용이하게했다. 다른 기술을 통해 두 챔버 시스템의 장점은 다공성 멤브레인이 콜라겐 또는 피브리노겐과 같은....

프로토콜

1. 5637 방광 상피 세포를 배양

층류 조직 문화 후드 UV 조사 준비 및 70 % 에탄올로 닦여에서 다음 단계를 수행합니다.

1. 10 % 소 태아 혈청 (FBS) [칭했다 RPMI +]를 함유하는 RPMI-1640 배지를 준비 필터 수욕 0.22 ㎛의 세공 크기 필터를 사용하여 살균하고, 온난 한 37 ° C.
2. 5637 세포의 cryovial을 해동 (미국 유형 문화 수집 HTB-9, 방광 암에서 파생 된) 37 ° C의 물을 욕조에. 빠르게 20 ㎖ RPMI +를 포함하는 75cm ² 조직 문화 플라스크에 해동 세포를 전송합니다.
3. 세포가 약 95 %의 합류 (플라스크 당 ~ 6 × 10 ⁶ 세포), 약 5 일 때까지 5 % CO _2와 가습 분위기에서 37 ° C에서 플라스크를 품어.
4. 5637 세포를 배양하는 방법 :
   1. 플라스크에서 매체를 제거합니다. 10 ㎖ 둘 베코의 인산 완충 살린로 세포를 씻어실온에서 전자 (DPBS).
   2. 6 ㎖의 따뜻한 (37 ° C) 0.05 % 트립신, 플라스크에 0.02 %의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가하고 15 분 동....

결과

transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 다양한 자극 (그림 1B)에 대한 응답에서 배양 방광 상피 세포 층에 걸쳐 인간의 PMN 이동의 정량적 인 평가를 가능하게한다. 프로토콜은 간단하지만, PMN 이주 영향 결과적으로 본 분석의 재현성에 영향을 미칠 수있는 변수의 개수가있다. 기술 및 생물 복제물 사이의 변동성을 감소시키는 투과성 지지체와 PMN을 준비하는 동안의 대책이되어야한다. 예를 들어, 충분히 합류 5637 세포층을 함유에만 투과성 지지체는 실험에 사용한다. 5637 세포의 합류는 액체 불 투과성을 측정하는 기능 분석을 사용하여 평가된다. 상부 리저버에 첨가 매체 투과성지지 걸쳐 평형화되면, 5637 세포는 실험을하기에 충분히 합류 않는다. 상부 리저버에서 볼륨이 유지되는 경우, 투과성수 지원 PMN 마이그레이션을 평가하기 위해 사용될 수있다. 우리는 세포의 합류에 소폭 상승이 시스템에 transepithelial 전기 저항을 측정하고,이 방법을 선택하면, 치료는 달.......

토론

배양 방광 상피 세포 라인과 갓 고립 된 인간의 PMN을 사용하여, 우리는 transuroepithelial 호중구 이주의 체외 모델을 설립했다. 이 모델은 요로 감염 (UTI) 동안 선천성 면역 반응, 일반적으로 UPEC ^(9)에 의해 발생하는 매우 흔한 세균 감염의 복잡성을 해부하기 시작있는 수단이되었습니다. 방광이나 방광염의 감염 동안, 방광 루멘 PMN 모집 세균 통관 ^(10)을 위해 필수적입니다. 염증 반응의 얼굴에 발판을 설정하려면, UPEC는 UPEC 면역 압력 ^6,11의 부재에서 방광 상피 세포에 침입 할 수있는 기간을 연장 방광에 PMN의 도착을 지연. 이 표현형, 초기 시점에서 UPEC로 PMN 이동의 억제는 transuroepithelial PMN 마이그레이션 우리의 체외 모델에서 관찰된다. 비병원성 E. 감염 대장균 MG1655의 이끌어uropathogenic E. 감.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트랜스웰 인서트 (i.e.  투과성 지지대)	Corning	3472	6.5 mm, 3 μ m pore, polyester membrane insert
BD Vacutainer Blood Collection Tubes	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	sodium heparin이 포함된 16 mm x 100 mm x 10 ml 녹색 캡 튜브
BD Safety-Lok 혈액 수집 및 주입 세트	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing
BD Vacutainer one-use, 쌓을 수 없는 홀더	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS 밀도 원심분리 솔루션	GE Healthcare	17-1440-02
초저 부착 플레이트	Corning	3473	24-well, 투명 평면 바닥
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	DMSO에서 10mM
재조합 인간 CXCL8/IL-8	. D Systems	208-IL	은 PBS에서 100 &mu로 재구성되었습니다. g/ml

은 R&로 재구성되었습니다