يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل عيوب العضلات الهيكلية في يرقات أسماك الزرد عن طريق الانكسار الثنائي ومقايسات استجابة الهروب باللمس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أصبحت أسماك الزرد (Danio rerio) أداة فعالة بشكل خاص لنمذجة الأمراض البشرية التي تؤثر على عضلات الهيكل العظمي ، بما في ذلك ضمور العضلات1-3 ، والاعتلال العضلي الخلقي4،5 ، والاضطرابات في التجميع السارمي6،7 ، بسبب الحفظ الجيني والهيكلي العالي مع الثدييات8. يمكن تقييم الفوضى العضلية وضعف القاطرة بسرعة في أسماك الزرد خلال الأيام القليلة الأولى بعد الإخصاب. فحصان للمساعدة في توصيف عيوب العضلات الهيكلية في أسماك الزرد هما الانكسار الثنائي (الهيكلي) واستجابة الهروب التي تثيرها اللمس (سلوكية).
Birefringence هي خاصية فيزيائية يتم فيها تدوير الضوء أثناء مروره عبر المادة المرتبة ، مثل المصفوفة الزائفة البلورية من تسييم العضلات9. إنه نهج بسيط وغير جراحي لتقييم سلامة العضلات في يرقات سمك الزرد الشفافة في وقت مبكر من النمو. تبدو أسماك الزرد البرية ذات العضلات الهيكلية عالية التنظيم مشرقة جدا وسط خلفية مظلمة عند تصورها بين مرشحين ضوئيين مستقطبين ، في حين أن طفرات العضلات لها أنماط انكسار ثنائية خاصة بالاضطراب العضلي الأساسي الذي تصوغه. نمذجة ضمور العضلات ، وهي أمراض تتميز بتنكس الألياف العضلية متبوعة بجولات متكررة من التجديد ، تظهر بقعا داكنة تنكسية في عضلات الهيكل العظمي تحت الضوء المستقطب. لا ترتبط الاعتلالات العضلية غير الضمور بالنخر أو التغيرات التجديدية ، ولكنها تؤدي إلى ألياف عضلية غير منظمة وضعف عضلات الهيكل العظمي. عادة ما تظهر أسماك الزرد العضلية انخفاضا عاما في الانكسار الثنائي ، مما يعكس عدم تنظيم القشر العضلي.
يتضمن اختبار الهروب الذي يتم استحضاره باللمس مراقبة سلوك السباحة للجنين استجابة للتحفيز اللمسي10-12. بالمقارنة مع اليرقات البرية ، تظهر اليرقات الطافرة في كثير من الأحيان تقلصا ضعيفا في الهروب ، تليها السباحة البطيئة أو أي نوع آخر من الحركة الضعيفة التي تفشل في دفع اليرقات أكثر من مسافة قصيرة12. تتمثل ميزة هذه المقايسات في أنه يمكن مراقبة تطور المرض في نفس النوع من الأسماك في الجسم الحي لعدة أيام ، وأنه يمكن تحليل أعداد كبيرة من الأسماك في وقت قصير بالنسبة للفقاريات الأعلى.
البروتوكول
1. تحليل في الجسم الحي لبنية العضلات الهيكلية عن طريق الانكسار الثنائي
- قم بإعداد أقفاص التزاوج التي تفصل الذكور (الذكور) عن الإناث من خط (خطوط) سمكة الزرد المرغوبة في وقت متأخر من بعد الظهر بعد الرضاعة.
- يميز الإناث من خلال بطنهن الأكبر ولونهن الأزرق / الأبيض الطفيف ، والذكور من خلال شكل أجسامهم النحيف وألوانها الوردية / الصفراء. قد
- يكون النجاح مع الصلبان الزوجية (ذكر وأنثى واحدة) حوالي 50٪ فقط. للحصول على معدل نجاح أعلى ، قم بتزاوج ذكر واحد مع 2-3 إناث.
- قم بإزالة فواصل الأقفاص في صباح اليوم التالي بعد وقت قصير من بداية الضوء والسماح للأسماك بالتكاثر دون إزعاج.
- اجمع البيض باستخدام مصفاة عند ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن استخدام الانكسار المزدوج كاختبار فعال وغير جراحي لتسليط الضوء على حالة التنظيم الليفي العضلي في أجنة سمك الزيبرفيش الحية. يتم عرض أمثلة على سمك الزيبرفيش من النوع البري، وكذلك أسماك زيبرفيش ذات تعبير جيني منخفض للجينات الضرورية لتطور العضلات الهيكلية ووظائفها. تُظهر أسماك الزيبرفيش من النوع البري عند عمر 5 dpf عضلات هيكلية ذات انكسار مزدوج عالٍ تحت الضوء المستقطب بسبب المصفوفة المنظمة للخيوط العضلية (Figures 2A-B). وفي المقابل، يُظهر جنين من نفس العمر متماثل الزيجوت لطفرة ممرضة في جين الدستروغليكان .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تصنف الاضطرابات العصبية العضلية الأولية تقليديا على أنها عمليات ضمور أو غير ضمورية. يتميز الحثل العضلي بتنكس الألياف العضلية متبوعا بجولات متكررة من التجديد ، مما يؤدي في النهاية إلى عملية المرحلة النهائية التي تجسدها التليف واستبدالها بالأنسجة الدهنية14. على النقيض من ذلك ، لا ترتبط الاعتلالات العضلية غير الضمورية بالنخر أو التغيرات المتجددة ، ولكنها تؤدي إلى الألياف العضلية غير المنظمة وضعف عضلات الهيكل العظمي بشكل عام.
ظهرت نماذج أسماك الزرد في السنوات الأخيرة كمورد ذو قيمة هائلة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر بهزاد مقدم زاده على مساعدته الرائعة في القياس الكمي للصور الانكسارية. تم تمويل هذا العمل من قبل جمعية الحثل العضلي بالولايات المتحدة الأمريكية (MDA201302) والمعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض العضلات والعظام والجلد (R01 AR044345) ، بالإضافة إلى دعم سخي من A Foundation Building Strength و Cure CMD ومؤسسة AUism الخيرية. يتم دعم VAG من قبل K01 AR062601 من المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض العضلات والعظام والجلد ، ويتم دعم LLS بواسطة F31 NS081928 من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أطباق Tricaine | Sigma | A5040 | |
| Petri | Fischer Scientific | 0875711Z | |
| ملقط | Fischer Scientific | 100189-588 | |
| دبوس حشرات | فيشر Scientific | S67375 | |
| عدسات مستقطبة | كاميرا ريتز | Quantaray Tristar Optics C-PL 72mm | |
| حاضنة | فيشر حاضنة Isotemp العلمية | موديل 630D | |
| مجهر | نيكون إنسترومنتس: Inc. | SMZ 1500 | |
| Diagnostic Instruments Inc. | التصوير SPOT RT3 | ||
| Diagnostic Instruments Inc. | SPOT 5.1 متقدم |
المراجع
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
- Gupta, V., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
