近年、生細胞ベースのアッセイは、表面とコンフォメーション抗原に対する抗体を検出するために首尾よく使用されている。ここでは、患者の大規模コホートの分析を可能にするフローサイトメトリーのハイスループット流を用いた方法を記載している。新規な抗体の検出は、免疫媒介性障害の診断および治療を改善する。
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方法論記事
ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパミン-2受容体に対する抗体を検出する
この記事について
サマリー
要約
近年、表面と神経伝達に関与コンフォメーションのタンパク質に対する抗体は、小児および成人における自己免疫CNS疾患で検出されている。これらの抗体は、診断および治療を導くために使用されてきた。細胞ベースのアッセイは、患者の血清中の抗体の検出を改善している。次いで、それらを蛍光標識二次抗体、続いて、希釈した患者血清と共にインキュベートし、真核細胞上の脳の抗原の表面発現に基づいている。洗浄後、二次抗体の結合を、フローサイトメトリーによって分析する。当社グループは、確実に特定の神経伝達物質受容体に対する抗体を検出するために、生きた細胞ベースのアッセイメトリーの高スループット·フローを開発しました。このフローサイトメトリー法が効率的で、単純で定量的であり、ハイスループットサンプラシステムの使用を容易に短期間でアッセイするために大きな患者コホートを可能にする。さらに、このようなセルベース回答が容易に中枢神経系及び末梢の両方から、多くの異なる抗原性標的に対する抗体を検出するように適合させることができる。追加の新規抗体のバイオマーカーを発見することは、迅速かつ正確な診断を可能にし、免疫介在性障害の治療を改善するであろう。
概要
近年、中枢神経系（CNS）自己免疫疾患の形態が同定されている。なお、これらの疾患が関連しており、自己抗体の存在によって定義されることが示されている。これらの抗体は、神経伝達を1,2に関わる神経細胞の受容体やシナプスのタンパク質に結合する。異なる抗原は、例えば、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDAR）3-5、γ-アミノ酪酸B受容体（GABAのB）受容体6、α-アミノ-3 -ヒドロキシ-5 -メチル-4 -として、検出されたイソキサゾール酸（AMPA）受容体7、電位依存性カリウムチャネル（VGKC）関連タンパク質：ロイシンリッチ神経膠活性化1タンパク質（LGL-1）およびコンタクチン関連タンパク質2（capsr2）8,9、グルタミン酸受容体5,10 、およびドーパミン2受容体（D2R）11。過去には、（主に脳炎と呼ばれる）これらの自己免疫CNS障害は、多くの場合、診断未確定と未処理だった。これらの新規抗体のバイオマーカー、 例えばNMDAR抗体又はD2R抗体は実質的に診断や意識を改善しているし、患者のための治療の選択肢を開いている。実際、免疫療法による早期治療が改善された結果11,12と関連している。
例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびウェ....
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プロトコル
1。たpIRES2-EGFPベクターのエンコーディングD2RまたはNMDARを構築するための戦略をサブクローニング
- 人間D2RまたはNMDARサブユニット1（NR1）の完全長cDNAクローンを得る。
- このように同時発現される抗原およびGFPの両方を可能にする高感度緑色蛍光タンパク質内部リボソーム侵入部位（IRES）の制御下で（GFP）レポーターを有する膜貫通タンパク質の発現に適しているたpIRES2-EGFPのような発現ベクターを選択する別途、細胞。
- たpIRES2-EGFPベクター内のヒトcDNAをサブクローニング。
- のcDNAをサブクローニングするために、（例えば、人間のD2RのcDNAのためのNheIおよびXhoIのために）適切な制限酵素を使用しています。
- ライゲーションカットcDNAは、制限されたたpIRES2-EGFPベクター内に挿入します。
- 配列は、ベクターが正しい順序が含まれているかどうかを確認するたpIRES2-EGFP D2RまたはNMDARベクトルを連結した。
- トランスフェクション後の使用のためにたpIRES2-EGFP D2RまたはNMDARベクトルを浄化し、増幅する。
- 4.5グラム/ LのD....
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結果
生きHEK293 D2R +とHEK293 CTL細胞は、高スループットサンプラーを使用して、フローサイトメーターで得た。分析の間、細胞は、前方散乱（大きさ）および側方散乱（粒度）パラメータ（ 図1Aおよび1D）に基づいてゲートした。トランスフェクトされたHEK293細胞は、細胞質において、レポーター分子、GFPを発現し、そして非トランスフェクト細胞を、分析（ 図1B及び1E）から除外した。 GFP +ゲート内に、AF647結合抗ヒトIgG二次抗体の結合に関連付けられたMFIは、（ 図1C及び1F）を測定した。ヒト血清を分析するとき、バックグラウンド蛍光を除去するために、ΔMFIはHEK293 D2R +細胞のMFI（ 図1G）からのCTL HEK293 細胞のMFIを差し.......
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ディスカッション
本論文では、高スループットのサンプラーを使用して、特定の細胞表面の神経タンパク質を標的とする抗体を検出するために、生きた細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーの新しいアプリケーションを記述します。この技術を用いて、自己免疫CNS疾患に罹患した患者のサブグループは、NMDARの表面又はD2Rに表面血清抗体を有することを報告している。
生細胞ベースのアッセイサイトメトリこのハイスループットフローを使用して、最適な抗体検出のための基本的な手順としては、1）健康なトランスフェクトされた細胞の高い収率を得ること、2）目的の抗原の高い細胞表面発現を確認すること、3）抗体の閾値を確立すること陽性コントロール、4のコホートを用いて）、データの再現性を確認した。
健康な細胞の文化は、この技術の成功の基本である。 HEK293細胞は、それらの培養の容易さ、高いトランスフェクション効率、およびニューロンの発現の欠如のためによく知られているタンパク質は、それらが一般的に特定のニューロン4,5,8-10の抗原に対する抗体を検出.......
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開示事項
利益相反：特許は、自己抗体のターゲットとしてD2Rを主張FBとRCD（シドニー大学）によって提出されている。
謝辞
この作品は、オーストラリア国立保健医療研究評議会、スター科学財団（オーストラリア）、トゥレット症候群協会（米国）によってサポートされていました、トリッシュ多発性硬化症研究財団および多発性硬化症の研究オーストラリア、この説明財団（オーストラリア）、レベッカL.クーパー医学研究財団（オーストラリア）。我々は我々の研究のためのサンプルを提供し、すべての患者や家族に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| pIRES2-EGFPベクター | Clontech | 6029-1 | |
| ヒトHA-ドーパミン-2受容体 (D2R) cDNA | ミズーリ州 S&T cDNAリソースセンター | DRD020TN00 | |
| NMDAR (NR1) cDNA | A. Vincent教授からの寄贈 (英国オックスフォード) | ||
| モノクローナル精製マウス抗ヒトNR1抗体(クローン:54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| マウス精製モノクローナル抗DRD2 IgG(クローン:1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647ロバ抗マウスIgG(H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647ヤギ抗ヒトIgG(H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| ダルベッコModified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-グルコース、L-グルタミン、110 mg/L ピルビン酸ナトリウム | Invitrogen | 11995-065 | |
| ウシ胎児血清 | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% 塩化ナトリウム | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | PolysciencesInc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | ||
| プラスミド プラス Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| 機器名/ソフトウェア | 会社番号 カタログ番号 | モデル/バージョン | |
| ハイスループットサンプラーシステム付きフローサイトメーター | BD Biosciences | BDLSRII HTS付き | |
| 倒立顕微鏡 | オリンパス | CKX41 (水銀ランプ、U-RFLT50電源付き) | |
| 電動マルチチャンネルピペット(15-300 μl) | エッペンドルフ | 613-2240P | 12チャンネル Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml ポリプロピレン円錐管 | BD Biosciences | 352070 | |
| 6 ウェルプレート | BD Biosciences | 353046 | |
| 組織培養フラスコ (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney プラスチック包装 | PM-992 | |
| V-bottom 96-wellプレート | コーニング | 651180 | |
参考文献
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS:....
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