Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

Summary

Dettagli Questo protocollo un metodo per isolare le cellule presentanti l'antigene da timo umano attraverso diverse fasi di digestione enzimatica del tessuto seguita dalla densità centrifugazione della sospensione di cellule singole e smistamento finalmente magnetico e / o FACS delle popolazioni cellulari di interesse.

Abstract

In questo protocollo forniamo un metodo per isolare le cellule dendritiche (DC) e cellule epiteliali (TEC) dal timo umano. DC e TEC sono i principali cellule presentanti l'antigene (APC) tipi trovato in un timo normale ed è ben stabilito che essi svolgono ruoli distinti durante la selezione del timo. Queste cellule sono localizzate in microambienti distinti nel timo e ogni tipo APC rappresenta soltanto una frazione minore di cellule. Per capire meglio la biologia di questi tipi cellulari, caratterizzazione di queste popolazioni cellulari è altamente auspicabile, ma a causa della loro bassa frequenza, l'isolamento di uno qualsiasi di questi tipi cellulari richiede una procedura efficiente e riproducibile. Dettagli Questo protocollo un metodo per ottenere cellule adatte per la caratterizzazione di diverse proprietà cellulari. Tessuto timico è interrotta meccanicamente e dopo diverse fasi di digestione enzimatica, la sospensione cellulare risultante è arricchito con un passo centrifugazione densità Percoll. Per l'isolamento di DC mieloidi (CD11c <sup> +), le cellule della frazione a bassa densità (LDF) sono immunoselected da cell sorting magnetico. Arricchimento delle popolazioni TEC (MTEC, CTEC) si ottiene l'esaurimento delle emopoietiche (CD45 ^hi), le cellule dalla frazione di cellule Percoll a bassa densità che consente loro successivo isolamento tramite fluorescenza delle cellule attivate (FACS) utilizzando marcatori cellulari specifici. Le cellule isolate possono essere utilizzati per diverse applicazioni a valle.

Introduction

Il timo è l'organo in cui avviene lo sviluppo delle cellule T. La sua dimensione relativa e assoluta diminuisce con l'età, quando viene successivamente sostituito da grasso, anche se l'attività del timo può ancora essere rilevata in età avanzata. La sua importanza per la risposta immunitaria è stata dimostrata nei primi anni del 1960 ^1.

Il repertorio di cellule T è sagomata attraverso l'interazione di recettori delle cellule T con complessi peptide-MHC su diversi tipi di timica APC, che forniscono sopravvivenza o morte spunti per sviluppare cellule T, risultando in un repertorio di cellule T e funzionale gran parte auto-tolerant ^2.

Circa il 98% delle cellule nel timo umano stanno sviluppando cellule T denominate timociti. Il restante 2% è costituito da un certo numero di diversi tipi di cellule, tra cui una varietà di TEC (corticale, midollare, sottocapsulare), mieloidi e DC plasmacitoidi (MDC, PDC), macrofagi, cellule B, cellule T a ricircolo maturi, granulociti, fibroblasts, cellule endoteliali e cellule epiteliali molto rare attraverso una espressione fenotipo simile a quello di cellule di altri tessuti come i muscoli, neuroni e epitelio respiratorio (Figura 1). Di questi, TEC e DC sono i principali tipi APC trovato in un timo normale. Negli ultimi anni, la purificazione di questi tipi di APC per la cultura e profiling molecolare ha guadagnato sempre più interesse. A causa della loro bassa frequenza, l'isolamento di uno qualsiasi di questi tipi di cellule per l'analisi dettagliata richiede una procedura efficiente, riproducibile e conveniente. Il metodo qui presentato è una modifica da studi pubblicati in precedenza ^3,4.

Come con qualsiasi altro tessuto, estrazione cella dal timo può essere ottenuto enzimaticamente disaggregando cellula-cellula e reti di interazione cellula-matrice, in modo da ottenere una sospensione di cellule singole. Ci sono alcuni parametri come la buona efficienza di dissociazione, il rendimento delle cellule, vitalità cellulare e la conservazione delle cellule smarcatori urface che sono cruciali e devono essere ottimizzati per l'isolamento di successo di queste popolazioni di cellule rare.

In questo protocollo, isolamento di DC e sottoinsiemi TEC viene eseguita facendo una cella singola sospensione del tessuto tramite rottura meccanica e digestione enzimatica. Usiamo Collagenase A da Clostridium histolyticum, che ha un rapporto equilibrato di diverse attività enzimatiche, per abbattere il collagene nativo che tiene il tessuto insieme. DNasi I è incluso nella soluzione enzimatica di ridurre l'aggregazione delle cellule a causa di DNA libero da cellule morte (timociti sono molto sensibili). Forniamo anche un approccio alternativo al tipico tessuto digestione enzimatica comporta il trattamento dei tessuti meccanica ed enzimatica assistito da un dissociatore tessuto. La sospensione singola cella viene quindi sottoposto ad una singola densità centrifugazione Percoll per l'arricchimento della frazione a bassa densità (LDF) di cellule. Da questa frazione di cellule, DC può essere isolato mediante colorazione fo marcatori DC-superficie (cioè CD11c ⁺⁾ e usando la separazione magnetica o cella fluorescenza-attivato (FACS). A differenza delle cellule linfoidi comprendenti la stragrande maggioranza delle cellule nel timo, TEC non esprimono CD45 ad alti livelli, ma sono positivi per l'adesione delle cellule epiteliali molecola EpCAM. CTEC può essere distinto dal TEC midollare mediante l'espressione di un antigene ancora indefinito riconosciuto dalla CDR-2 (corticale dendritico reticolociti-2) anticorpo ^4,5 e espressione EpCAM leggermente inferiore. Il differenziale co-espressione di EpCAM e CDR2 permette l'isolamento efficiente di questi sottoinsiemi TEC via cellulare ad alta velocità smistamento ^6.

Il protocollo qui presentato è ottimizzato per tessuto timico umano. La durata della procedura dipende dalla quantità di tessuto e la capacità dello sperimentatore così come la velocità del cell sorter, se viene utilizzato FACS ordinamento. Normalmente, il protocollo per l'isolamento di CC può essere completato entro 5-6 Hr e per l'isolamento di TCE in 8-10 ore. L'isolamento della DC e sottoinsiemi TEC dal tessuto timico è momento delicato. Il più veloce la procedura di isolamento, migliore la condizione delle cellule. Infine, le cellule isolate possono essere utilizzati per ulteriori indagini come studi comparativi di mRNA e l'espressione della proteina, esperimenti di PCR, isolamento delle proteine, profiling molecolare (cioè transcriptomics, analisi micro RNA) e coltura cellulare ^6.

Dichiarazione Etica

Al fine di poter lavorare con il tessuto del timo umano il ricercatore deve ottenere l'approvazione del comitato etico locale o autorità responsabili, nonché un consenso informato scritto del donatore (o di solito i suoi genitori, poiché il tessuto è di solito ottenuto da minorenni bambini). Inoltre, tutti i tessuti umani devono essere trattati come dovrebbero essere adottate misure potenzialmente infettivi ed appropriate, come ad esempio lavorare con i guanti, ecc.

Protocol

1. Preparazione di strumenti, enzimatici Solutions, e tamponi

Effettuare le seguenti operazioni di preparazione prima di iniziare la procedura.

1. Strumenti
   Pulito, asciutto e sterilizzare in autoclave i seguenti strumenti e li mantiene in confezione sterile fino al momento dell'uso.
   1. Piccole forbici affilate punte né curve o diritte per tagliare il tessuto del timo. Piccole pinze curve con punte zigrinate per la manipolazione del tessuto.
   2. 50 ml Oak Ridge centrifuga Tubi, PC, per la centrifugazione passo Percoll densità.
2. Soluzioni enzimatiche
   Preparare la collagenasi / DNasi I Enzyme mescolare (2 mg collagenasi / ml e 0,1 mg DNasi I / ml) come segue:
   1. Sciogliere 500 mg di liofilizzato collagenasi A (Roche) in 250 ml di RPMI 1640 normale (senza FCS) per ottenere una soluzione di 2 mg / ml collagenasi. Collagenase è abbastanza difficile da sciogliere, per cui si consiglia di lasciare un po 'di tempo su un rullo-shaker a RT.
   2. Sciogliere 100 mg DNasi I (Roche) in10 ml di acqua distillata sterile. 2,5 ml aliquote possono essere conservati a -20 ° C. Aggiungere 2,5 ml della soluzione di DNasi I 10 mg nella soluzione di 2 mg collagenasi A.
   3. Filtro sterile il mix Collagenase / DNasi utilizzando un'unità filtrante Stericup (0,22 micron). Conservare in 10-20 ml aliquote a -20 ° C fino all'utilizzo.
3. Tamponi e soluzioni
   1. 1.5 soluzione stock M NaCl: Sciogliere NaCl in acqua distillata sterile ad una concentrazione finale di 1,5 M. Filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron e conservare a temperatura ambiente.
   2. Tampone 10x MACS: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-free)} contenente il 5% di BSA e 20 mM EDTA. Filtro sterile la soluzione con un filtro da 0,22 micron e conservare a 4 ° C. Prima di usare preparare una soluzione 1x diluendo lo stock 10x a 1x a freddo sterile 1x PBS.
   3. FACS tampone: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +-free)} contenente BSA 1% e il 0,02% NaN _3.
   4. FACS tampone per l'ordinamento delle cellule: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg

2. Preparazione del tessuto

Il trattamento del tessuto deve essere eseguita utilizzando reagenti sterili e lavorare in una cappa a flusso laminare. Prima dell'inizio della procedura, preparare i seguenti reagenti e attrezzature:

1. 1. Riscaldare la seguente per RT: terreno RPMI 1640 completo (RPMI 1640, il 10% di siero di feto di vitello, 1% pen / strep), RPMI 1640 pianura, Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} privo di PBS e 2x soluzione enzimatica Collagenase / DNasi.
   2. Incubatore termico caldo con unità di rotazione a 37 ° C e fresco angolo fisso rotore della centrifuga a 4 ° C.
   3. Preparare una scatola con ghiaccio.

Nota: la durata di questa fase dipende dalle condizioni e dimensioni del tessuto. Circa 20-30 minuti è il tempo ragionevole necessario per un pezzo di medie dimensioni di tissue in buone condizioni (~ 5 cm di larghezza).

2. Collocare il tessuto in una capsula di Petri contenente PBS sterile e risciacquare eventuali residui di sangue.
   1. Aggiungi PBS fresco per evitare che il tessuto di essiccazione e con pinze e forbici pulire il tessuto da coaguli di sangue, il tessuto connettivo e grasso e qualsiasi parte che non sembra in buona salute.
   2. Fare attenzione a rimuovere il tessuto necrotico che aumenterà la quantità di detriti.
   3. Dopo la pulizia, pesare tessuto per riferimento.
   4. Tagliare il tessuto in circa 1 cm ³ parti / blocchi. Aggiungere abbastanza PBS per coprire il tessuto.

Nota: Per la riproducibilità dei risultati, il tessuto deve essere tagliato in pezzi di dimensioni uniformi.

3. Utilizzando il retro di una siringa sterile (10-20 ml) applicare pressione (non troppo intensa o prolungata) sui pezzi tessuto timico. Questa procedura rimuoverà la maggior parte dei timociti, riducendo così il volume del tessuto per essere digerito tardi. Eseguire questo passaggio su ghiaccio e lavorare velocemente.
4. La soluzione diventerà visibilmente nuvoloso come timociti vengono rilasciati. Mescolare il piatto delicatamente e poi con l'aiuto di una pipetta da 5 ml o un aspiratore vetro rimuovere il supernatante contenente i timociti facendo attenzione a non aspirare accidentalmente i pezzi di tessuto.

Tip: Una sterile coltura cellulare raschietto può essere utilizzato per concentrare tutti i pezzi di tessuto su un lato del piatto muovere il piatto (45 ° angolo) e aspirare il surnatante. Sostituire con PBS fresco e ripetere la procedura fino a quando il surnatante è relativamente trasparente. Eseguire ultimo lavaggio con RPMI pianura.

5. Tritare pezzi di tessuto con forbici affilate (il più finemente possibile, i frammenti dovrebbero essere di almeno 2-4 mm). I frammenti dovrebbero essere abbastanza piccolo da entrare in una pipetta da 5 ml.

3. Preparazione della sospensione singola cellula da Timo Tissue

Qui,sono descritti due approcci alternativi per questo passaggio. Il primo approccio descrive un tipico digestione enzimatica di tessuto (sezione 3.1), mentre la seconda prevede il trattamento del tessuto meccanica ed enzimatica assistito da un dissociatore tessuto (sezione 3.2).

Questo protocollo è ottimizzato per il trattamento di campioni di tessuto pesano 5 g. Per i campioni di tessuto grandi o più piccoli, regolare i volumi degli enzimi di conseguenza.

3.1 Tipica digestione enzimatica del tessuto per ottenere una sospensione di cellule singole

1. Mettere purè di tessuto in provette da 50 ml con soluzione di 10 ml di collagenasi / DNasi per 5 g di tessuto. Aggiungi RPMI semplice per ottenere un volume totale di 20 ml.

Nota: in una provetta da 50 ml digerire fino a 10 g di tessuto. Regolare il volume enzima di conseguenza.

2. Incubare la sospensione tessuto per 40 min a 37 ° C sotto lenta rotazione in un incubatore termica.

Nota:

3. La soluzione enzimatica diventerà nuvoloso come cellule vengono rilasciati in esso. Al termine della digestione, tubo centrifugare a 110 xg per 2 minuti per sedimentare frammenti di tessuto.
4. Raccogliere il surnatante da questo round digestione. Sedimentare la sospensione cellulare per 10 min a 400 x g. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 10-50 ml di RPMI completo a seconda delle dimensioni del pellet.
5. Tenere sospensione di cellule in 37 ° C incubatore con il tappo allentato.
6. Se si desiderano numero di cellule più grandi, la fase di digestione può essere ripetuta con i frammenti di tessuto rimanenti e la prima e la seconda digerire pool. Inoltre, se TEC deve essere isolato, due turni di digestione devono essere eseguiti.
7. Diluire una aliquota della sospensione di cellule in blu trypan (1:10-1:100) e contare le cellule vitali mediante un emocitometro. Mantenere le cellule a 37 ° C in incubatore fino al momento di procedere alla centrifugazione densità Percoll (sezione 4). Isolamento successivo di sottoinsiemi DC (sezione 5) verrà effettuata da tali cellule.

Nota: tessuti timici possono variare nella loro composizione, in particolare con l'età, che influisce sull'efficienza digestione e la generazione di una cella singola sospensione.

9. Per il successivo isolamento delle cellule epiteliali del timo (TCE) è necessario un terzo round di digestione enzimatica. Risospendere residui di tessuto in 10 ml di soluzione di Collagenase / DNasi fresco più 10 ml di RPMI pianura e aggiungere tripsina / EDTA (1:50 dal 2,5% stock) nella soluzione.
10. Incubare a 37 ° C per 40 min con lieve rotazione. Durante gli ultimi 10 - 15 min di incubazione aggiungere FCS (1:5) per neutralizzare l'attività della tripsina.
11. Centrifugare a 110 xg per 2 minuti a temperatura ambiente per sedimentare i frammenti di tessuto.

12. Raccogliere il surnatante cellulare ed eliminare i frammenti di tessuto sedimentate.
13. Centrifugare il surnatante cellulare a 400 xg per 10 min. Aspirare il surnatante e risospendere pellet di cellule in RPMI completo.

Suggerimento: pellet cellulari sono abbastanza sciolto, quindi fare attenzione quando scartando / aspirazione surnatante.

14. Contare le cellule vitali mediante un emocitometro. Mettere le cellule in un incubatore a 37 ° C fino procedere al Percoll separazione (sezione 4). Successivamente pre-arricchimento di cellule TEC da deplezione delle cellule CD45 ^hi verrà effettuata da tali cellule (sezione 6).

3.2 trattamento del tessuto meccanica ed enzimatica assistito da un dissociatore tessuto

7,8.

1. Trasferimento 5 g di pezzi di tessuto macinate (passo 2.5) in una provetta C contenente 10 ml di soluzione Collagenase / DNasi.
2. Adattare il tubo C sul dissociatore tessuti e m_spleen_02 esecuzione del programma (10 sec). Ripetere questo programma 4-5x (40-50 sec).
3. Incubare con lieve rotazione per 20 min a 37 ° C.
4. Centrifugare a 110 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
5. Raccogliere il surnatante e procedere come al punto 3.1.4. Aggiungere 10 ml di soluzione di collagenasi / DNasi fresca.
6. Adattare il tubo C sul dissociatore tessuti e m_spleen_01 esecuzione del programma (56 sec).
7. Incubare a 37 ° C per 20 min con lieve rotazione.
8. Centrifugare a 110 xg per 2 minuti a temperatura ambiente.
9. Raccoltesupernatante delle cellule T e sedimentare la sospensione cellulare per 10 min a 400 x g. Procedere come al punto 3.1.4.
10. Come descritto in 3.1.9 è necessario un terzo round di digestione per il successivo isolamento di cellule epiteliali del timo (TEC). Per questo, risospendere residui di tessuto in 10 ml di soluzione Collagenase / DNasi fresco, più tripsina / EDTA (1:50 diluizione del magazzino 2,5%)
11. Incubare a 37 ° C per altri 20 minuti con lieve rotazione. Aggiungi FCS (1,5) e incubare per altri 10 min.

Nota: Usando questo approccio, dopo questo ultimo digestione passo il tessuto è di solito completamente dissociato e non frammenti di tessuto non digerite vengono osservati.

12. Procedere come nei passaggi 3.1.11-3.1.14.

4. Arricchimento della LDF di Cellule con separazione Percoll densità

Dopo digestione enzimatica del tessuto, in totale timici sospensioni di cellule singole sono sottoposti ad una singola densità centrifugat Percollion passo per arricchire le cellule LDF. La LDF di cellule altamente arricchito per APC. Sia DC e TEC vengono rilevati in questa frazione di cellule.

1. Utilizzare sospensione singola cella ottenuta dal 1 ^° e 2 ^° digerisce per isolamento mDC (cellule pool, vedere il punto 3.1.8) o 3 ^° digest (per l'isolamento TEC) (3.1.14). Sospensione singola cella centrifuga ottenuta da ciascuna fase di digestione a 400 xg per 10 min.
2. Preparare una soluzione di Percoll con una densità finale di 1,07 g / ml durante questa fase di lavaggio (vedi esempio nella tabella di seguito).

   Preparazione della soluzione Percoll ad una densità finale di 1,07 g / ml (ρ = 1,07)
   Tubo No.	1	2	3	4
   Diluito Percoll (ρ = 1.130) (ml)	2.96	5.92	8.88	11.84
   1.5 M NaCl (ml)	0.6	1.20	1.8	2.4
   H 2 O distillata (ml)	2.44	4.88	7.32	9.76
   Volume di diluizione di lavoro finale	6 ml	12 ml	18 ml	24 ml

3. Il numero di tubi Percoll dipende dai numeri cellulari determinate nelle fasi 3.1.8 e / o 3.1.14. Unire le soluzioni sterili e mescolare accuratamente. Per l'isolamento ottimale, 0,6-1 x 10 ⁹ celle possono essere caricati per provetta di Percoll. Unire le soluzioni sterili e mescolare accuratamente.

Tip: Percoll è fotosensibile ed inoltre deve essere mantenuto freddo. Preparare prima la miscela contenente NaCl e H ₂ O (RT) e aggiungere diluito Percoll ultimo, appena prima di risospendere le cellule in soluzione Percoll.

tenda "> Nota: densità di Percoll può variare tra i diversi fornitori e lotti Se la densità della soluzione diluita Percoll non è uguale a 1,130 g / ml, utilizzare le istruzioni fornite dal produttore per calcolare gli importi esatti di Percoll e H ₂ O necessaria per ottenere una densità finale di 1,07 g / ml.

4. Risospendere fino a 1 x 10 ⁹ cellule in 6 ml di soluzione Percoll preparata (ρ = 1,07), mescolare quanto basta per ottenere una sospensione omogenea, e il trasferimento di un tappo a vite in policarbonato provetta da centrifuga da 50 ml Oak Ridge.
5. Strato accuratamente 30 ml di RPMI completi al tubo con una pipetta in cima alla soluzione sospensione Percoll / cella. Caricare il supporto lentamente, in modo che rimanga in cima alla sospensione e fare attenzione a non disturbare lo strato.
6. Pesare i tubi per assicurarsi che essi hanno pesi uguali in modo che siano bilanciata durante la centrifugazione. Se non lo sono, aggiungere più accuratamente mezzo al tubo più leggero (sotto stcondizioni erile).
7. Trasferire accuratamente le provette per centrifuga pre-raffreddato con un rotore ad angolo fisso, e centrifugare a 3500 xg per 35 min, a 4 ° C con il freno off. Assicurarsi che la temperatura della centrifuga in non superiore a 4 ° C.
8. Rimuovere provette dalla centrifuga e accuratamente raccogliere l'arricchito APC, trovato all'interfase tra Percoll e medio (frazione a bassa densità) da ciascuna provetta sterile utilizzando una pipetta Pasteur. Trasferire le cellule in una provetta da 50 ml contenente freddo RPMI completo. Riempire il tubo in modo da diluire la restante Percoll.
9. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 300 xg a 4 ° C. Gettare il surnatante e lavare ripetere.
10. Risospendere il pellet di cellule in terreno e determinare il numero di cellule (utilizzando trypan blu e un emocitometro). Nella nostra esperienza, la percentuale delle cellule LDF è circa 2-20% della sospensione di cellule singole totale ottenuto dopo digestione enzimatica. Un tipico yield di cellule arricchite a bassa densità (da un giovane del timo, range anni 1 giorno-2) è 1x10 ⁸ cellule per 1 x 10 ^9, che rappresenta un 10% del totale delle singole cellule sospensione cellulare.

Nota: In questa fase, è possibile osservare che le cellule aggregate in sospensione (soprattutto con campioni provenienti da bambini di età più avanzata). Grumi di cellule sono un'indicazione di morte cellulare e di conseguenza dal rilascio di DNA dalle cellule morenti che possono attaccare le cellule insieme. In tal caso, aggiungere DNasi I nel campione (50 mcg / ml) e incubare per un massimo di 20 min a temperatura ambiente (capovolgere delicatamente ogni 5 min) per digerire le molecole di DNA libero.

5. Isolamento di timica mDC

Dopo arricchimento APC (tramite separazione Percoll), MDC può essere efficacemente isolato dal LDF seguito del primo e secondo ciclo di digestioni enzimatiche. Il protocollo che segue è una versione modificata di separazione cellulare magnetica per l'isolamento di mDC (CD11c

1. Centrifugare APC arricchito cellule isolate dalla sospensione singola cella ottenuta dal pooled prima e seconda digestione enzimatica a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere il pellet cellulare in tampone MACS 100 microlitri per 10 ⁷ cellule.
2. Aggiungere 5 ml di anticorpo CD11c-PE per 10 ⁷ cellule.

Nota: esperimenti di titolazione sono raccomandati per ottenere risultati ottimali.

3. Mescolare bene e incubare per 15 min a 4 ° C, al riparo dalla luce.
4. Lavare le cellule aggiungendo 1-2 ml di tampone MACS per 10 ⁷ cellule e centrifugare a 300 xg per 10 min.
5. Aspirare il surnatante e risospendere completamente fino a 10 ⁷ cellule in 80 ml ​​di tampone MACS.
6. Aggiungere 20 microlitri anti-PE microsfere per 10 ⁷ cellule.
7. Mescolare bene (non Vortex) e incubare per 15 minuti a 4 ° C al riparo dalla luce.
8. Ripetere come al punto 5.4. Risospendere fino a 10 ⁸ cellule in 500 microlitri di tampone.
9. Se necessario, sospensione cellulare filtro con un filtro 40 micron cella per rimuovere i detriti cellulari e aggregati che possono ostruire il flusso della colonna.
10. Utilizzare una colonna LS poiché sospensioni di cellule del timo fluire meglio attraverso le colonne LS. Preparare colonna LS seguendo le istruzioni del produttore. Sospensione cellulare Pipettare lentamente nella colonna evitando bolle generazione. Utilizzare una colonna per ogni 1 x 10 ⁸ cellule.
11. Lavare colonna seguendo le istruzioni del produttore. Rimuovere colonna da magnete e metterlo in una sterile 12 ml tondi tubo di polipropilene fondo. Aggiungere 3 ml MACS tampone nella colonna e raccogliere le cellule marcate magneticamente inserendo e saldamente spingendo lo stantuffo nella colonna.
12. Raccogliere la frazione eluita rappresenta il CD11c ⁺ MDC e centrifugare a 400 xg per 6 min.
13. Determinare il numero di cellulare e confermare la purezza del populati cella selezionatail da citometria a flusso. Indicatori suggeriti includono CD45, CD11c, e HLA-DR.

Nota: CD11c ⁺ mDC può anche essere isolato con un sorter FACS.

6. Arricchimento di CD45 Cells ^{lo neg /} per l'ordinamento delle cellule di TEC

Per l'isolamento di TEC, le cellule possono essere pre-arricchiti da deplezione delle cellule CD45 ^hi utilizzando microsfere CD45, al fine di accelerare il loro isolamento attraverso l'ordinamento delle cellule.

Utilizzare sospensione singola cella ottenuta dalla digestione 3 ^° gradino (3.1.14) e successivamente separati da Percoll centrifugazione.

1. Sospensione cellulare centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere il pellet cellulare in 80 MACS microlitri di buffer per 10 ⁷ cellule.
2. Utilizzare microsfere CD45 a 1/3 della quantità raccomandata (6,7 ml) per 10 ⁷ cellule.

Nota: Utilizzando un importo inferioredelle microsfere che pre-arricchiamo cellule sia per ^lo CD45 e CD45 delle cellule ^neg. La titolazione è raccomandato per ottenere risultati ottimali.

3. Mescolare bene muovendo delicatamente il tubo (non Vortex) e incubare per 15 minuti a 4 ° C.
4. Lavare le microsfere non associate con l'aggiunta di 10 ml di tampone MACS e centrifugare per 10 minuti a 300 xg a 4 ° C. Aspirare il surnatante completamente.
5. Risospendere fino a 10 ⁸ cellule in 500 microlitri di tampone.
6. Se necessario, sospensione cellulare filtro con un filtro 70 micron cella per rimuovere i detriti cellulari e aggregati che possono ostruire il flusso della colonna.
7. Utilizzare una colonna LS poiché sospensioni di cellule del timo fluire meglio attraverso le colonne LS. Preparare colonna LS seguendo le istruzioni del produttore. Sospensione cellulare Pipettare lentamente nella colonna evitando bolle generazione. Utilizzare una colonna per ogni 10 ⁸ celle.
8. Raccogliere le cellule senza etichetta (flow-through e lavaggi) contenentila frazione di cellule ^{lo / neg} CD45 e lavare colonna seguendo le istruzioni del produttore.
9. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere il pellet di cellule in tampone FACS sterile per determinare il numero di cellule e procedere alle macchie per selezione cellulare.

7. Celle macchia per l'ordinamento delle cellule Fluorescence Activated

1. Esegui FcR bloccando prima della colorazione delle cellule, al fine di ridurre legame di anticorpi non specifico. Incubare sospensione cellulare con pool soluzione di immunoglobuline umane per 15 minuti a RT. Questi reagenti sono disponibili in commercio (ad esempio Gammunex soluzione al 10%).
2. Lavare le cellule aggiungendo freddo buffer di FACS sterile. Centrifugare a 400 xg per 6 minuti a 4 ° C.
3. Gettare il surnatante e risospendere le cellule in freddo buffer di FACS sterile. Preparare 5 campioni secondo il seguente esempio:
   

   * Scc; controllo del singolo colore

   Incubare le cellule con anticorpi per 30 min, su ghiaccio al buio.
   Lavare due volte con tampone FACS delle cellule mediante centrifugazione a 400 xg per 6 minuti a 4 ° C.
   Regolare la concentrazione cellulare del campione da ordinare a 1 x10 ⁷ cellule / ml (o alla concentrazione consigliata dal stabilimento di selezione cella) mediante FACS sterili buffer per cell sorting (cioè senza NaN _3).
   Passare campione cellulare attraverso un colino 70 micron cella per eliminare eventuali grumi di cellule che potrebbero ostruire il citometro di cernita.
   Risospendere campioni di controllo in 200-400 ml di tampone. Tenere le provette su ghiaccio e al riparo dalla luce.
   Preparare le provette di raccolta con il mezzo.

   Note:

   • Eseguire titolazione degli anticorpi per la colorazione ottimale.
   • In un campione selezionare, fino a 50 x 10 ⁶ cellule possono essere colorati in un volume totale di reazione di500 microlitri.
   • Eseguire la colorazione del campione da ordinare in 5 ml Falcon polistirolo tubi circolari. I singoli controlli colore possono essere colorati in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti.
   • Poiché sottoinsiemi TEC sono popolazioni rare, è consigliabile utilizzare un altro indicatore positivo (ad alta frequenza) per ogni fluorocromo per facilitare la determinazione delle impostazioni FACS corretta e per assicurarsi di avere un adeguato risarcimento se la scelta di fluorocromi richiede un risarcimento. Cellule dalla frazione CD45 ⁺ possono essere colorati con marcatori quali CD45, CD3 o CD8 per i diversi fluorocromi e dopo colorazione CD45 ⁺ cellule non colorate possono essere aggiunte al campione.

   8. Isolamento dei TEC da Fluorescence ordinamento cellulare Attivato

   Sottoinsiemi TEC possono essere ordinati dalla frazione ^{lo / neg} CD45 come EpCAM ^hi CDR2 ^- (MTEC) o carcinomi ^lo CDR2 ⁺ (CTEC).

   1. Eseguire l'arguzia del campioneh le cellule non colorate e regolare l'avanti e scatter laterale in modo da mettere la popolazione di interesse in scala. Regolare la tensione su ogni rivelatore in modo che le cellule sono visibili ma situato nella porzione mano sinistra dell'istogramma.
   2. Eseguire ogni campione macchiato singolo e regolare la compensazione per ogni colore.
   3. Dopo aver regolato la tensione e il risarcimento per i controlli colorate senza macchia e singole eseguire l'esempio da ordinare e strumenti di uso gating per definire la popolazione di interesse. Utilizzare una vasta avanti e cancello scatter laterale per garantire l'inclusione di tutte le dimensioni di cellule stromali, escludendo detriti cellulari.
   4. Sul terreno dot con CD45-Pacific Blue contro cancello Forward Scatter sulle cellule CD45 e CD45 ^{basse neg.}
   5. Applicare questo porta ad un EpCAM contro CDR2 dot plot e determinare di gating popolazioni da ordinare.
   6. Una volta che cancelli sono stati determinati, selezionare le porte che contengono le popolazioni di interesse e iniziare ordinamento.

   Nota: durante l'ordinamento per impedire alle cellule di attaccarsi alle pareti del tubo di raccolta, il tubo può essere pre-rivestito riempiendola con 50% FCS in PBS e incubate a temperatura ambiente per 30 min. Scartare la soluzione di rivestimento prima di aggiungere il supporto di raccolta.

   Representative Results

   Come materiale di partenza in questo protocollo usiamo tessuto del timo rimosso dalla portata dei bambini sottoposti a chirurgia cardiovascolare correttiva (Dipartimento di Chirurgia Toracica e Cardiovascolare, Clinica universitaria di Tubinga) ottenuti dopo consenso informato e secondo le linee guida istituzionali. Questo materiale di scarto può variare notevolmente di dimensioni 2-30 grammi. Il numero di MDC e sottoinsiemi TEC (CTEC e Mtec) che si ottengono dipende dalla dimensione e l'età del campione di tessuto timo utilizzato per l'isolamento.

   La Figura 2 mostra una piuttosto grande pezzo di tessuto (~ 9 cm) ottenuto da un bambino di sei anni. Un primo passo importante preparativa in questo protocollo è la pulizia del tessuto da parti indesiderate (indicate dalle frecce bianche).

   Tessuto del timo è stato trattato come descritto nelle sezioni 2 e 3.1 del protocollo per ottenere una sospensione singola cellula che è stato separato utilizzando un unico densità di Percoll centrifugazione step Mentre la sospensione singola cella contiene il 3% circa + cellule HLA-DR (Figura 3A), dopo centrifugazione Percoll questa percentuale è aumentata nella frazione a bassa densità (LDF), contenente cellule di grandi dimensioni, al 15-40% mentre la frazione ad alta densità (HDF) che consiste principalmente di piccole dimensioni uniformi timociti contiene praticamente senza tali cellule (Figura 3B). La frazione di interesse (LDF), contenente arricchito APC è stato successivamente raccolto e lavato per raccogliere le cellule per uso in successive fasi di isolamento.

   Mentre timica mDC può essere identificato mediante l'espressione di un certo numero di marcatori di superficie, comprese CD11c9, 10, pDC esprimono marcatori come BDCA-2, BDCA-4, CD45RA e CD123 ^11,12. Dopo arricchimento delle cellule LDF, entrambi i tipi di cellule costituiscono 2-10% di questa frazione, consentendo loro isolamento efficiente anche in numero maggiore, sia per separazione cellulare magnetica o flusso di classificare CD11c ⁺ o BDCA-4 ⁺⁶ celle.

   La figura 4 mostra l'isolamento efficiente di CD11c ⁺ celle utilizzando il protocollo separazione cellulare magnetica modificato descritto nel capitolo 5. Dopo l'isolamento, la purezza del CD11c ⁺ DC è stata del 93% come da immunocolorazione delle cellule isolate. In media, il recupero di isolati CD11c ⁺ DC è di 5 x 10 ⁵ -5 x 10 ⁶ mDC per 10 ⁹ cellule del timo totali. Tabella 1 mostra i dati ottenuti da diversi campioni individuali timo di diversa età e il peso del tessuto con una gamma di ingresso singolo sospensioni cellulari così come il numero totale LDF e la successiva CD11c ⁺ resa e la purezza.

   Nella frazione arricchita APC, solo circa il 0,5% delle cellule sono CD45 ^lo EpCAM ⁺ o CD45 ^neg EpCAM ^+. CTEC e MTEC possono essere ordinati da CD45 ^{lo / neg} cellule stromali arricchite tripsina-digerito come EpCAM ^l o CDR2 ⁺ e EpCAM ^hi CDR2 ^- rispettivamente come mostrato in Figura 5.

   
   Figura 1. Uno schema semplificato di organizzazione e composizione del timo umano cellulare. Il timo è costituito da timociti, a diversi stadi di maturazione, e una rete cellulare eterogenea denominato stroma timico formando l'ambiente timica. I principali tipi di cellule dello stroma timica sono, cellule MDC e PDC epiteliali (suddivise in due categorie principali in base alla loro localizzazione all'interno del lobulo: corticale e midollare) e macrofagi Abbreviazioni: DC, cellule dendritiche, MDC, mieloidi cellule dendritiche;. pDC, cellule dendritiche plasmacitoidi; Mφ, macrofagi, mono, monociti, CTEC, cellule epiteliali corticali; MTEC, cellule epiteliali midollari.

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   Figura 2. Prima fase preparativa del tessuto per unicellulare preparazione. Punto frecce per le parti di tessuto indesiderabili che devono essere eliminati prima dell'esecuzione del protocollo.

   
   Figura 3. Purificazione di timo analisi APC. FACS delle diverse fasi della procedura di purificazione. Sospensioni di cellule singole di tessuto del timo sono stati ottenuti dalla rottura meccanica e digestioni enzimatiche seriali e APC arricchiti (cellule LDF) per separazione Percoll densità. Le cellule prima (A) e dopo (B) la separazione Percoll densità sono state colorate con anticorpi HLA-DR-PE per verificare l'arricchimento APC. Gamma Percentuale di + cellule HLA-DR tipicamente osservate è indicat ed.

   
   Figura 4. Isolamento di CD11c ⁺ mDC. Tessuto del timo è stato digerito con Collagenase A / DNasi I per creare una sospensione singola cella. CD11c ⁺ mDC rappresentano solo una frazione minore della sospensione singola cella (0,6%). Dopo arricchimento delle cellule LDF tramite separazione Percoll densità la percentuale di cellule CD11c ⁺ aumenta a ~ 9%. Le cellule LDF sono stati etichettati con anticorpi CD11c-PE e successivamente isolate utilizzando biglie magnetiche (anti-PE). Rianalisi della CD11c ⁺ popolazione direttamente dopo la separazione cellulare magnetica da FACS indicato 93% di purezza. Clicca qui per ingrandire la figura .

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   Figura 5. Arricchimento di cellule CD45 ^{lo / neg} e successiva cernita dei sottoinsiemi TEC.) Un rappresentante dot plots mostrano percentuali di CD45 negative / cellule stromali del timo basse in totale sospensioni di cellule singole, prima e dopo la separazione Percoll densità (9% e 16,2%, rispettivamente). B) Le cellule LDF è stato impoverito di cellule CD45 ^hi utilizzando sfere magnetiche ei sottoinsiemi TEC ordinati dalla frazione impoverito come EpCAM ^hi CDR2 ^- (MTEC) o carcinomi ^lo CDR2 ⁺ (CTEC).

   Campione	Tipo di campione Anticorpo	Numero di cellulare	Volume totale
   1. senza macchia	controllo		1 x 10 6	50 microlitri
   2.scc *-Pacific Blue	controllo	CD45-Pacific Blue	1 x 10 6	50 microlitri
   3. SCC-APC	controllo	CD3-APC	1 x 10 6	50 microlitri
   4.scc-Alexa 488	controllo	CD8-Alexa 488	1 x 10 6	50 microlitri
   5. Ordinamento delle cellule	analita	CD45-Pacific Blue EpCAM-APC CDR2-Alexa 488	10 x 10 6 - 50 x 10 6	500 microlitri 10 x 10 6 microlitri cells/100

   Frequenze CD11c + MDC, i rendimenti cellulari e purezza di diversi donatori
   Donatore	Età	Peso Tissue	Cellule totali per campione	LDF cellule per campione	CD11c+%	CD11c + isolato per campione	CD11c + purezza
   1	5 giorni	7 g	1,45 x 10 9	9.5 x10 7	12.6	2,4 x 10 6	89%
   2	3 anni	15 g	2 x 10 9	6.5 x10 7	4.3	1,9 x 10 6	81%
   3	21 giorni	9 g	2,6 x 10 9	22 x10 7	10.3	3,6 x 10 6	93%
   4	6 anni	13 g	1,4 x 10 9	25,4 x10 7	4.2	5,7 x 10 6	82%
   5	5 giorni	6,5 g	1,3 x 10 9	16,2 x10 7	6	2,9 x 10 6	91%
   6	39 giorni	3 g	0,6 x 10 9	8 x10 7	3.4	1,3 x 10 6	80%

   Tabella 1. Numeri del totale cellule in sospensione di cellule singole rilasciate dopo due turni di digestione così come i rendimenti di cellule LDF dopo la separazione Percoll sono indicati per isolamenti effettuati in campioni timo di sei individui di diversa età e il peso del tessuto. Frequenze delle mDC sono stati determinati mediante citometria a flusso basato sull'espressione CD11c in cellule LDF totali (APC arricchito). Resa e purezza di ⁺ cellule CD11c dopo la separazione perla magnetica sono indicati per ogni singolo donatore.

Discussion

Il protocollo qui descritto è una modifica del protocollo pubblicato da Gotter et al ^4. Fasi critiche nel protocollo sono la condizione e la preparazione iniziale del tessuto e la separazione densità Percoll. Si consiglia vivamente di trattare il tessuto il più presto possibile dopo la raccolta. È importante lavorare velocemente ma accuratamente durante la pulizia e il taglio del tessuto. Durante il lavaggio timociti descritto al punto 2.3, è fondamentale trovare il giusto equilibrio quando si applica pressione con la parte posteriore dello stantuffo della siringa sui pezzi di tessuto come pressione troppo accentuata e prolungata può danneggiare le cellule stromali. La stratificazione del mezzo in cima alla soluzione di sospensione Percoll / cellulare senza causare perturbazioni può anche richiedere una certa pratica. Dopo centrifugazione, è importante raccogliere tutte le celle di frazione a bassa densità più rapidamente possibile dallo strato Percoll con una quantità minima di soluzione di Percoll.

Ilproduzioni di cellule totali e numeri APC relativi possono essere molto variabile (vedi Tabella 1) e dipenderà dal donatore (soprattutto per quanto riguarda l'età) e le competenze preparative dello sperimentatore. Per una breve panoramica, sospensioni cellulari possono essere colorati con HLA-DR e / o di altri marcatori seguendo diverse fasi del protocollo come desiderato. Tutti gli anticorpi utilizzati per l'analisi fenotipica dovrebbero essere titolati per ottenere risultati ottimali.

A causa della relativamente bassa abbondanza di tipi di APC nel timo rispetto a thymoctyes, grandi pezzi di timo potrebbero essere necessari se si desiderano più alto numero di cellule isolate.

Se un dissociatore tessuto è disponibile in laboratorio, questo sarà notevolmente accelerare il trattamento dei tessuti, ma entrambe le varianti qui descritte funzionano altrettanto bene. Un problema relativamente frequente potrebbe essere aggregazione delle cellule, specialmente durante i passaggi tra la separazione Percoll e MACS / FACS ordinamento. In questo caso, una breve DNasi I digestion come descritto nel protocollo di solito risolvere il problema. Poiché tessuto del timo viene successivamente sostituito da tessuto grasso durante l'invecchiamento, thymi da donatori anziani potrebbe contenere alcuni grassi, che nuotare sulla parte superiore del tubo dopo centrifugazione le sospensioni di cellule singole ottenuti dai diversi mineralizzazione. In tal caso, il grasso deve essere rimosso con una pipetta prima di continuare il protocollo. Per ottenere risultati ottimali, nonché ragioni di economia ci consigli per titolare non solo gli anticorpi ma anche le microsfere anti-PE (sezioni 5 e 6). Per l'isolamento di TEC da topo timo, miscele enzimatiche alternative sono state descritte che permettono di migliorare TEC rendimento ^8,13, ma non li hanno testato con i tessuti umani.

In linea di principio, altre cellule APC e stromali del timo come cellule B e pDC possono anche essere isolati dalle cellule (LDF seguenti collagenasi / DNasi digestione e Percoll) mediante FACS / MACS smistamento se i rispettivi marcatori sono noti. Ad esempio, per pDC, BDCA-2, BDCA-4 e CD123 sono stati descritti come marcatori ^6,14. Se si desidera analisi o l'isolamento di sottopopolazioni di timociti, si consiglia di utilizzare le cellule rilasciate dalla spremitura (punto 2.3), dal momento che sono abbastanza puri e sono stati sottoposti a manipolazione minima.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
RPMI 1640	PAA	E15-842
Dulbecco's PBS	PAA	H15-002
Fetal Bovine Serum-Gold	PAA	A15-151
Bovine Serum Albumin	PAA	K41-001
Collagenase A	Roche	10 103 586 001
DNase I, grade II bovine pancreatic	Roche	10 104 159 001
Trypsin-EDTA 10x in PBS	PAA	L11-001	stock conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit	Molecular Probes	A-10235
anti-human CDR2 (purified)	Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany		labeled with Alexa Fluor 488
anti-human CD45 (Pacific Blue)	Biolegend	304022
anti-human EpCAM (APC)	Miltenyi Biotec	130-091-254
anti-human CD11c (PE)	Miltenyi Biotec	130-092-411
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
anti-CD45 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-801
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	for tissue dissociator
Percoll (density 1.130 g/ml)	GE Healthcare, Life Sciences	17-0891-01
Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free)	GIBCO	10977-035
Gamunex 10%	Tajecris-Biotherapeutics	G120052	1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells
0.22 μm filter	Millex GS	SLGS033SS	Syringe driven
Stericup filter unit	Millipore	SCGPU05RE	Pump driven
50 ml PC oak ridge centrifuge tubes	Nalgene	3118-0050	50 ml
50 ml PP conical tubes	Becton Dickinson	352070
12 mm x 75 mm 5 ml test tubes	Becton Dickinson	352058	FACS stainings
Cell strainer 70 μm	Becton Dickinson	352350
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)	Becton Dickinson
Sorvall Evolution R6 (rotor)	Kendro
Rotator REAX 2	Heidolph
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093 235	tissue dissociator