Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

Summary

Dit protocol detailleert een methode voor het isoleren van antigen-presenterende cellen uit humane thymus via verschillende stappen enzymatische afbraak van het weefsel, gevolgd door centrifugatie van de enkele celsuspensie en tenslotte magnetische en / of FACS sorteren van celpopulaties plaats.

Abstract

In dit protocol bieden wij een methode om dendritische cellen (DC) en epitheelcellen (TEC) isoleren van de humane thymus. DC en TEC zijn de belangrijkste antigeen presenterende cel (APC) soorten gevonden in een normale thymus en het is bekend dat ze verschillende rollen spelen tijdens de thymus selectie. Deze cellen zijn gelokaliseerd in verschillende micro-omgevingen in de thymus en elke soort APC maakt slechts een kleine populatie van cellen. Om verder inzicht in de biologie van deze celtypen karakterisatie van deze celpopulaties is zeer wenselijk maar door hun lage frequentie, isolatie van een van deze celtypen vereist een efficiënte en reproduceerbare werkwijze. Dit protocol detailleert een methode die geschikt zijn voor karakterisatie van diverse cellulaire eigenschappen te verkrijgen. Thymusweefsel mechanisch verstoord en na verschillende stappen van enzymatische digestie, wordt het resulterende celsuspensie verrijkt met een Percoll dichtheid centrifugatie stap. Voor isolatie van myeloïde DC (CD 11 c <sup> +), cellen van de lage-dichtheid-fractie (LDF) worden immunoselected door magnetische celsortering. Verrijking van TEC populaties (MTES, Ctec) wordt bereikt door depletie van hematopoietische (CD45 ^hi cellen) van de lage-dichtheid Percoll celfractie waardoor hun verdere isolering via fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met specifieke cel markers. De geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen.

Introduction

De thymus is het orgaan waarin T cel ontwikkeling optreedt. De relatieve en absolute omvang afneemt met de leeftijd als het achtereenvolgens wordt vervangen door vet hoewel thymus activiteit nog kan worden gedetecteerd in de ouderdom. Het belang van de immuunrespons aangetoond in de vroege jaren 1960 ^1.

De T-cel repertoire wordt gevormd door de interactie van T-celreceptoren met peptide-MHC complexen op verschillende soorten thymus APC, die leven of dood cues de ontwikkeling T-cellen, wat resulteert in een functioneel en grotendeels zelfverdraagzaam T cel repertoire ^2.

Ongeveer 98% van de....

Protocol

1. Voorbereiding van gereedschap, Enzyme Solutions, en Buffers

Voer de volgende voorbereidende stappen voor het begin van het protocol.

1. Gereedschap
   Schone, droge en autoclaaf de volgende hulpprogramma's en bewaar ze in een steriele verpakking tot het gebruik.
   1. Kleine scherpe schaar met ofwel gebogen of rechte tips voor het snijden van de thymus weefsel. Kleine gebogen pincet met gekartelde tips voor het omgaan met het weefsel.
   2. 50 ml Oak Ridge Centrifugeglazen, PC, voor de Percoll dichtheid centrifugeren stap.
2. Enzymoplossingen
   Bereid de collagenase / DNase I enzym mix (2 mg....

Results

Als uitgangsmateriaal in dit protocol gebruiken wij thymus weefsel verwijderd uit kinderen die corrigerende cardiovasculaire chirurgie (Ministerie van Borst en Cardiovasculaire Chirurgie, universiteitskliniek Tübingen) verkregen na geïnformeerde toestemming en onder institutionele richtlijnen. Deze afgedankte materiaal kan sterk variëren in grootte 2-30 g of meer. Het aantal mDC en TEC subsets (Ctec en MTES) die worden verkregen afhankelijk van de grootte en de leeftijd van de thymus weefselmonster gebruikt voor isolati.......

Discussion

De hier beschreven protocol is een modificatie van het protocol gepubliceerd door Gotter c.s. ^4. Kritische stappen in het protocol zijn de initiële toestand en voorbereiding van de weefsels alsmede de Percoll dichtheid scheiding. We raden aan het weefsel zo snel mogelijk na verzameling te verwerken. Het is belangrijk om snel maar grondig werken bij het schoonmaken en snijden van het weefsel. Tijdens de thymocyt wassen in stap 2.3 beschreven, is het cruciaal om de juiste balans te vinden bij het uitoe.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
RPMI 1640	PAA	E15-842
Dulbecco's PBS	PAA	H15-002
Fetal Bovine Serum-Gold	PAA	A15-151
Bovine Serum Albumin	PAA	K41-001
Collagenase A	Roche	10 103 586 001
DNase I, grade II bovine pancreatic	Roche	10 104 159 001
Trypsin-EDTA 10x in PBS	PAA	L11-001	stock conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit	Molecular Probes	A-10235
anti-human CDR2 (purified)	Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany		labeled with Alexa Fluor 488
anti-human CD45 (Pacific Blue)	Biolegend	304022
anti-human EpCAM (APC)	Miltenyi Biotec	130-091-254
anti-human CD11c (PE)	Miltenyi Biotec	130-092-411
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
anti-CD45 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-801
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	for tissue dissociator
Percoll (density 1.130 g/ml)	GE Healthcare, Life Sciences	17-0891-01
Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free)	GIBCO	10977-035
Gamunex 10%	Tajecris-Biotherapeutics	G120052	1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells
0.22 μm filter	Millex GS	SLGS033SS	Syringe driven
Stericup filter unit	Millipore	SCGPU05RE	Pump driven
50 ml PC oak ridge centrifuge tubes	Nalgene	3118-0050	50 ml
50 ml PP conical tubes	Becton Dickinson	352070
12 mm x 75 mm 5 ml test tubes	Becton Dickinson	352058	FACS stainings
Cell strainer 70 μm	Becton Dickinson	352350
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)	Becton Dickinson
Sorvall Evolution R6 (rotor)	Kendro
Rotator REAX 2	Heidolph
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093 235	tissue dissociator