Summary
نحن تصف الإجراء التدريجي لخلق الضغط الزائد وتضخم البطين الأيسر في فئران ويستار بواسطة انقباض الشريان الأبهر الصاعد باستخدام مقطع معدنية صغيرة. ويستخدم هذا النموذج على نطاق واسع لدراسة التغييرات إعادة عرض خلال تضخم القلب وتحديد وتقييم استراتيجيات الانحدار من هذه التغييرات.
Abstract
تصاعدي انقباض الشريان الأبهر هو النموذج الأكثر شيوعا والجراحية الناجحة لخلق ضغط الزائد الناجم عن تضخم القلب وقصور في القلب. هنا، نحن تصف إجراء العمليات الجراحية مفصلة لخلق الضغط الزائد وتضخم القلب في الفئران عن طريق انقباض الشريان الأبهر الصاعد باستخدام مقطع معدنية صغيرة. بعد التخدير، ومدخل أنبوب القصبة الهوائية عن طريق إدخال قنية من خلال شق منتصف الطريق الذي تم بين حلقتين غضروف القصبة الهوائية. ثم يتم إجراء شق الجلد على مستوى الفضاء الوربية الثانية على جدار الصدر الأيسر ويتم مسح طبقات العضلات لتحديد موقع جزء من الشريان الأورطي تصاعدي. وقلص الأبهر الصاعد إلى 50-60٪ من قطرها الأصلية عن طريق تطبيق مقطع التيتانيوم صغيرة الحجم. بعد انقباض الشريان الأبهر، ويقترب من أضلاعه الثاني والثالث مع خيوط البرولين. أعيد إنشاء تتم إزالة قنية القصبة الهوائية التنفس مرة واحدة عفوية. ولا يسمح للحيوان لاسترداد سن لوحة التدفئة عن طريق خفض تدريجيا التخدير. يتم تحديد شدة الضغط الزائد التي أنشأتها انقباض الشريان الأبهر الصاعد عن طريق تسجيل التدرج الضغط باستخدام العابرة للالصدري ثنائية الأبعاد دوبلر-ضربات القلب. عموما هذا البروتوكول هو مفيد لدراسة الأحداث وإعادة عرض خصائص مقلص للقلب خلال ظهور تدريجي وتطور من تضخم القلب الى القلب معاوض مرحلة الفشل.
Introduction
نماذج حيوانية صغيرة هي الأدوات الأكثر تفضيلا لدراسة التغيرات المزمنة في تطوير تضخم القلب وانتقاله إلى فشل القلب. نماذج فشل القلب عن طريق الأساليب الجراحية وقد وضعت أصلا في الفئران حيث أن هذه الحيوانات هي الأكثر مناسبة لعمليات جراحية في الصدر مفتوحة، ضربات القلب وتقييم المعلمات الدورة الدموية. كما أنها توفر العينات بعد الوفاة كافية للأنسجة، والدراسات الخلوية المستوى الجزيئي 1. انقباض في الشريان الأبهر الصاعد هو واحد من النماذج الجراحية الأكثر شيوعا ونجاحا لخلق فشل القلب الضغط الزائد 2، 3. يناسب هذا النموذج جيدا لدراسة الأحداث إعادة عرض الخلوية الخلوية ودون وخصائص مقلص للقلب خلال الانتقال من تضخم إلى فشل القلب 4.
والميزة الرئيسية لهذا النموذج هو ظهور تدريجي للضغط الزائد على القلب 5، </ سوب> 6. هذا النموذج هو ذات الصلة سريريا بسبب التقدم بطيء ولكنه ثابت في الفترة من تعويض تضخم القلب إلى مرحلة امعاوض وأخيرا إلى مرحلة فشل القلب. تتأثر مدة لتطور تضخم القلب إلى فشل القلب والتغيرات الفسيولوجية المرتبطة أساسا من درجة تضيق أنتجت 7. تصاعدي انقباض الشريان الأبهر يمكن القيام بها بطريقتين، إما باستخدام الخيوط الجراحية أو عن طريق تطبيق مقاطع معدنية 8، 9. والميزة الرئيسية لاستخدام مقطع معدني لانقباض الشريان الأبهر هو أن العمليات الجراحية هي أقل تعقيدا. في هذا الأسلوب واحد لديه لتحديد موقع فوق صمامي الأبهر الصاعد وإدراج القصاصة حول الشريان الأورطي للحصول على المستوى المطلوب من انقباض. A ضام الصدر ليس من الضروري في هذا الإجراء. النطاقات الأبهر عن طريق خياطة يتطلب المزيد من التلاعب الجراحية لوضع إبرة قياس بجانب الأبهر الصاعد وخياطة حوله لتنتج المستوى المطلوب من انقباض الشريان الأبهر. والأسلوب الأخير هو أكثر تستغرق وقتا طويلا بالمقارنة مع استخدام مقاطع معدنية لانقباض الشريان الأبهر. الأسلوب هو موضح في هذا الفيديو يوضح الإجراء الجراحي لانقباض الشريان الأبهر الصاعد في الفئران التي يسمح بإنشاء الضغط زائد تضخم البطين الأيسر نموذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت التجارب على الحيوانات بعد الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات المؤسسية الحيوان. وتم إيواء فئران ويستار تحت الظلام 12 ساعة لدورة ضوء، درجة حرارة الغرفة ثابتة (24 ± 2 درجة مئوية) مع الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية (وفقا للمبادئ التوجيهية CPCSEA).
1) العناية والتخدير قبل العملية
- الحفاظ على الفئران (حوالي 200 غرام من وزن الجسم) تحت مظلة المضادات الحيوية 24 ساعة قبل الجراحة بالإدارة أموكسيسيلين شفويا (الجرعة: 500 ملغ / لتر من الماء).
- تعقيم جميع الأدوات الجراحية (مثل مقص، ملقط، مقطع قضيب، والإبر خياطة الجروح، وحامل إبرة) بواسطة التعقيم في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 15 دقيقة.
- استخدام وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان نحو 37 درجة مئوية لتجنب الانخفاض السريع في معدل ضربات القلب.
- الحرص على تجنب الجفاف الحيوان قبل وأثناء الجراحة.
- تخدير الفئران في غرفة الاستقراء مع 3٪ isoflurane ومختلطة مع0.5-1.0 لتر / دقيقة 100٪ من الأكسجين؛ الحفاظ على التخدير مع 1.5٪ isoflurane و.
- تحقق منعكس دواسة لتأكيد التخدير ناجحة.
2) إعداد الموقع الجراحية
- الحفاظ على الفئران على رأس درجة الحرارة التي تسيطر عليها سادة التدفئة في موقف ضعيف.
- ضع الشريط المطاطي على الأسنان الأمامية والفئران للحفاظ على الحيوانات في الموقف مع الحفاظ على التخدير مع مخروط الأنف.
- إزالة الفراء من العنق والصدر غادر المنطقة من الفئران (ويفضل استخدام ماكينة حلاقة كهربائية).
- تطهير موقع الجراحية مع محلول البوفيدون اليود ثم مع 70٪ الكحول الإيثيلي.
- استخدام ثنى العقيمة لفضح فقط موقع الجراحية أثناء إجراء الجراحة.
ملاحظة: كما خيارا إضافيا لرعاية الحيوان، 0.25٪ Bupivicaine معرف (2.5 ملغ / كلغ) يمكن إدراجها قبل شقها في كل موقع شق لتخدير موضعي / التسكين.
3) تنبيب الرغامي في الجرذ
- إجراء شق صغير في الجلد موازية إلى القصبة الهوائية باستخدام شفرة جراحية معقمة وفصل بعناية الأنسجة الكامنة من أجل فضح القصبة الهوائية.
- تطبيق التعادل 4-0 من الحرير خيوط الجروح تحت القصبة الهوائية ورفع بلطف التعادل التصاعدي.
- جعل شق منتصف الطريق بين حلقتين الغضروف وإدراج قنية القصبة الهوائية إلى القصبة الهوائية من الفئران.
- توصيل قنية القصبة الهوائية لجهاز التنفس الصناعي القوارض للحفاظ على معدل التنفس من 50 الأنفاس / دقيقة، حجم المد والجزر من 1.70 مل والوقت الالهام من 0.60 ثانية (للفأر مع 200 غرام من وزن الجسم).
4) انقباض تصاعديا الأبهر
- بعد استشعار موقف الأضلاع مع الأصابع، وجعل شق الجلد من حوالي 2 سم على جدار الصدر غادر بين الأضلاع الثانية والثالثة.
- فصل طبقة العضلات الوربية بعد طبقة، وجعل شق حوالي 1.5 سم طويلة بين الأضلاع الثانية والثالثة. (العناية ينبغي أن يكون اتخاذن لتجنب أي إصابة الرئتين في حين جعل شق بين الضلوع)
- سحب الأضلاع وتحديد موقع جزء تصاعدي من الشريان الأورطي.
- وضع مقطع التيتانيوم صغيرة الحجم حول الأبهر الصاعد مع مساعدة من قضيب حيث تشنجا الشريان الأورطي إلى 50-60٪ من القطر الأصلي.
- بعد انقباض الشريان الأبهر، تقريب الأضلاع الثانية والثالثة مع 3.0 البرولين في نمط خياطة توقف. في وقت واحد، وقفة التنفس الصناعي لمدة 2-4 ثانية من أجل إعادة تضخيم الرئتين.
- Appose طبقات العضلات مع 3.0 الغرز البرولين والجلد مع 4.0 الغرز الحرير في نمط خياطة توقف. الغرز للامتصاص غير الاصطناعية يمكن استخدامها بدلا من الحرير لخياطة الجلد.
- إزالة القصبة الهوائية قنية من الفئران وإعادة تأسيس التنفس مرة واحدة عفوية.
- إغلاق الفتحة القصبة الهوائية مع 3.0 الغرز البرولين وطبقة الجلد مع 4.0 الغرز الحرير.
- السماح للحيوان لاسترداد على رانه التدفئة وسادة من خلال خفض تدريجيا التخدير والتنفس الصناعي بمساعدة التنفس.
- في الحيوانات صورية السيطرة العمر المتطابقة، نفذ القصبة الهوائية وبضع الصدر دون انقباض الشريان الأبهر الصاعد.
5) العناية اللاحقة للعمليات الجراحية
- تطهير المنطقة الجراحية مع محلول البوفيدون اليود.
- كما تسكين بعد العملية، وضخ ترامادول داخل peritoneally (10 ملغ / كغ من وزن الجسم / يوم) لمدة 1 أسبوع.
- حقن معقمة العادي المالحة داخل peritoneally إذا ظهرت علامات الجفاف بعد الجراحة (حوالي 1 مل).
- إدارة الأموكسيسيلين شفويا، مختلطة مع مياه الشرب، لمدة سبعة أيام (الجرعة: 500 ملغ / لتر من الماء).
- إزالة أي خيوط الحرير المتبقية من الجلد آخر 10 أيام من الجراحة تحت التخدير عن طريق الاستنشاق.
6) إقرار انقباض الناجح تصاعديا الأبهر
- إجراء عبر الصدر ثنائية الأبعاد دوبلر-ضربات القلب لتحديد intenSITY من الضغط الزائد تنتجها انقباض الشريان الأبهر الصاعد.
- تخدير الفئران أسبوع واحد بعد الجراحة كما هو موضح سابقا (الخطوة 1.5)
- وضع محول بالموجات فوق الصوتية في الموضع القصية فوق لتسجيل التدرج الضغط عبر جزء ضيق من الشريان الأبهر الصاعد.
ملاحظة: سوف الفئران مع التدرج الضغط من حوالي 60 ملم من الزئبق في موقع ضيق الأبهر تطوير تضخم القلب الحاد بحوالي 8-10 أسابيع بعد الجراحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في تجاربنا ونحن قادرون على تحقيق أكثر من 80٪ معدلات البقاء على قيد الحياة. تم تأكيد فعالية انقباض الشريان الأبهر عن طريق إجراء تخطيط صدى القلب دوبلر. الفئران (ن = 6) مع التدرج الضغط من حوالي 60 ملم من الزئبق في موقع ضيق الشريان الأبهر لوحظت لمدة 8 أسابيع وضحى لتحليل لتطوير تضخم القلب (الشكل 1). بعد 8 أسابيع بعد الجراحة كشف تقييم تخطيط صدى القلب زيادة كبيرة في البطين الأيسر المعلمات مثل سمك بين البطين الحاجز، البطين الأيسر الخلفي سمك الجدار وانخفاض في الجهة اليسرى القطر الداخلي البطين الانبساطي في الدولة، في الحيوانات التي خضعت لانقباض الشريان الأبهر، مقارنة صورية تعمل ضوابط (الجدول 1، الشكل 2). وقد لوحظت زيادة كبيرة في الوزن القلب / جسم نسب الوزن والوزن البطين / جسم نسب الوزن اليسرى في الفئران مع انقباض الشريان الأبهر (الجدول 2، الشكل 3). هذه البياناتتشير إلى أن الفئران 8 أسابيع بعد الجراحة مع انقباض الشريان الأبهر تطوير مستوى كبير من تضخم القلب، مقارنة صورية تعمل الضوابط.
الشكل 1. مخطط صدى القلب في الفئران التي تمثل التدرج الضغط عبر الأبهر الصاعد. أأ) ومخطط صدى القلب ممثل من الفئران مع انقباض الشريان الأورطي وجود التدرج الضغط من 63.0 ملم من الزئبق وأب يمثل لون دوبلر صدى للموقع عبر الشريان الأورطي حيث تم قياس ضغط التدرج. با) وممثل عن مخطط صدى القلب صورية تعمل السيطرة الفئران وجود التدرج الضغط من 2.86 ملم من الزئبق وب ب يمثل لون دوبلر صدى للموقع عبر الشريان الأورطي حيث كان التدرج الضغط التدبير د. هذه الزيادة في ضغط التدرج يشير النطاقات ناجحة من الشريان الأورطي في الفئران التي خضعت جزئية الأبهر الصاعد انقباض.
الشكل 2 مخطط صدى القلب M-الوضع من البطين الأيسر في الفئران مع انقباض الشريان الأبهر (A) والسيطرة الفئران (B) التي تصور أبعاد البطين الأيسر في وقت التضحية 8 أسابيع بعد الجراحة IVST = أمور سمك البطين الحاجز؛ LVPWT = البطين الأيسر الخلفي سمك الجدار؛ LVID = اليسار القطر الداخلي البطين في انبساط. في الفئران مع انقباض الشريان الأبهر زيادة كبيرة في أمور سمك البطين الحاجز، يمكن ملاحظة البطين الأيسر الخلفي سمك الجدار وانخفاض في البطين الأيسر القطر الداخلي في الدولة الانبساطي.
الرقم 3. صور قلوب كل من الفئران التي خضعت لانقباض الشريان الأبهر (A) وصورية تعمل مكافحة الفئران (B) 8 أسابيع بعد الجراحة. الفأر مع انقباض الشريان الأبهر لديه تضخم القلب كبيرة مقارنة صورية تعمل السيطرة.
الجدول 1 M-وضع المعلمات تخطيط صدى القلب من البطين الأيسر في القلب في وقت التضحية، 8 أسابيع بعد الجراحة IVST = أمور سمك البطين الحاجز.؛ LVPWT = البطين الأيسر الخلفي سمك الجدار؛ LVID = اليسار القطر الداخلي البطين الانبساطي في الدولة؛ AAC = تصاعدي انقباض الشريان الأبهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من النماذج الجراحية للتحريض الضغط الزائد وكذلك تضخم القلب وقصور في القلب. في الحيوانات الصغيرة، وضعت Lorell وزملاؤه نموذج وصفناها هنا وأنها ذكرت حدوث تضخم القلب معاوض 8 أسابيع بعد ربط الشريان الأبهر 5. التغيرات القلبية التقدم تدريجيا إلى حالة امعاوض ومن ثم يؤدي إلى فشل القلب. الميزة الرئيسية لهذا النموذج هو ظهور تدريجي للزيادة في ضغط البطين الأيسر وبالتالي مماثلة للحالات السريرية في ارتفاع ضغط الدم المزمن. وإنما هو أيضا نموذج حيواني مناسبة لدراسة فشل القلب الأيسر يرتبط ارتفاع ضغط الدم الرئوي 10.
النماذج الحيوانية الأخرى لقصور القلب الضغط الزائد، مثل داهل الفئران حساسة، الفئران والجرذان ارتفاع ضغط الدم بشكل عفوي مع انقباض الشريان الأورطي البطني، وأيضا تطوير الزائد الضغط المزمن. أنها، مع ذلك، تأخذ فترات زمنية ممتدة للتقدم ومدمج تضخم القلب إلى قصور في القلب. تكلفة صيانة فئران التجارب ولذلك أيضا أعلى 1. deAlmeida والزملاء العاملين انقباض الشريان الأبهر عرضية لإحداث تضخم البطين الأيسر في الفئران 11. والأسلوب الذي ينطوي القص وسيطة وتراجع من القص، وبالتالي هو أكثر تحديا.
ضمان تغيير سريع التخدير من مخروط الأنف إلى التنبيب الرغامي قبل بضع الصدر ومن التنبيب الرغامي للمخروط الأنف بعد الإجراءات المنطوق. أسلوب بديل للتنبيب القصبة الهوائية في الفئران عن طريق استخدام أنبوب البولي ايثيلين لالتنبيب الرغامي بدلا من القصبة الهوائية. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب مهارة كافية. ينبغي توخي الحذر لتجنب أي إصابة الرئتين في حين جعل شق بين الضلوع. تطبيق مقاطع التيتانيوم كافية لإنتاج انقباض الشريان الأبهر الحرجة للإجهاد البطين الأيسر، ولكن غير كافية لإنتاج فشل البطين الأيسر الحاد وعوذمة ulmonary. استخدام خيوط البرولين لتقريب الأضلاع هو أمر حاسم لاسترداد ناجحة للحيوان. خلال التقريب بين الضلوع، وقفة التنفس الصناعي لمدة 2-4 ثانية من أجل إعادة تضخيم الرئتين.
كان لدينا وفيات المنطوق 20٪ فقط في الحيوانات ولم تكن هناك مضاعفات ما بعد الجراحة. تقنية وصفنا هنا هو بالتالي أداة فعالة ومناسبة لدراسة التغيرات الفسيولوجية المرضية المزمنة في تضخم القلب وقصور القلب التدريجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
المؤلفين الاعتراف قسم التكنولوجيا الحيوية، وحكومة الهند للحصول على الدعم المالي لهذا المشروع. وأيد أجيت كومار GS مع كبار زمالة بحثية من مجلس البحوث الصناعية، حكومة الهند وBinil راج مع كبار زمالة بحثية من المجلس الهندي للأبحاث الطبية، وحكومة الهند العلمية و.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Weinberg, E. O., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis. Circulation. 90, 1410-1422 (1994).
- Schunkert, H., et al. Increased rat cardiac angiotensin converting enzyme activity and mRNA expression in pressure overload left ventricular hypertrophy. Effects on coronary resistance, contractility, and relaxation. J Clin Invest. 86, 1913-1920 (1990).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91, 2642-2654 (1995).
- Miyamoto, M. I., et al. Adenoviral gene transfer of SERCA2a improves left-ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 793-798 (2000).
- Kagaya, Y., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K., Barry, W. H., Lorell, B. H. Long-term angiotensin-converting enzyme inhibition with fosinopril improves depressed responsiveness to Ca2+ in myocytes from aortic-banded rats. Circulation. 94, 2915-2922 (1996).
- Del Monte, F., Butler, K., Boecker, W., Gwathmey, J. K., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Turcani, M., Rupp, H. Heart failure development in rats with ascending aortic constriction and angiotensin-converting enzyme inhibition. Br J Pharmacol. 130, 1671-1677 (2000).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circ Res. 106, 1103-1116 (2010).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).
