Summary
该视频演示了一个简单而可靠的战略准备内皮细胞从内10-12天的胚胎前脑的纯培养物，并将成为研究主要集中在脑血管的许多方面非常有用。
Abstract
胚胎脑内皮细胞可以作为血管生成和血管神经发育和相互作用的研究中的重要工具。胚胎前脑，脑膜及脑室周围两个血管网络，在空间上是独特的，有着不同的起源和增长模式。从软脑膜和脑室周围血管网内皮细胞具有独特的基因表达和功能。在这里，我们提出了一个一步一步的协议进行分离，培养，和验证从胚胎前脑（端脑）的脑室周围血管网（PVECs）内皮细胞的纯种群。在这种方法中，端脑缺乏从胚胎第15天的小鼠获得软脑膜膜被剁碎，用胶原酶消化/分散酶，和分散机械成单细胞悬液。 PVECs从细胞悬液，用积极的选择与anti-CD-31/PECAM-1抗体结合到微珠使用强磁性纯化分离方法。纯化的细胞在胶原1涂布的培养皿在内皮细胞培养基中培养，直到它们变得汇合，并进一步传代培养。 PVECs本协议展览鹅卵石和梭形表型获得，如通过可视化相衬光学显微镜和荧光显微镜。建立与血管内皮细胞标记PVEC文化的纯洁性。在我们的手中，这种方法可靠，一致得到PVECs纯人群。该协议将有利于研究旨在获得机械见解脑血管，了解PVEC的相互作用，并与神经细胞类型的交叉谈判，并拥有巨大的潜力，治疗性血管生成。
Introduction
血管生成，神经发生和神经细胞迁移是在中枢神经系统（CNS）的开发，修复和再生的关键事件。几个雅致的研究表明，内皮细胞通过可溶性因子释放和通过直接接触刺激神经细胞的增殖，反之亦然。我们发现它奇怪的是，在这些研究大部分1-3中，虽然神经祖细胞/神经干细胞是从胚胎中分离脑，它们被共培养从成年脑，其它成体组织来源的，或与内皮细胞系内皮细胞。这可能部分是由于从胚胎脑分离和培养内皮细胞纯人口相关的技术困难。但是，血管生成，神经发生和神经元迁移是发生在幅度更健壮的胚胎大脑的命令比在正常成人大脑并发事件。该embryoni的脑室周围血管网Ç前脑（端脑）来源于位于基底节原基内的容器中，并在从腹侧的有序梯度的形式开发由胚胎11天（E11）4,5至背端脑。脑室周围血管网的血管丛这是基于出身，解剖部位，生长模式和发育调控从4,5软脑膜血管显着。脑室周围血管生成渐变的传播方向的端脑的横向神经源性梯度相匹配。在端脑，脑室周围血管梯度和GABA神经元迁移的梯度沿切线方向重叠空间，以及6。关于时机，血管生成梯度提前神经源性梯度和GABA神经元梯度由大约一天。因此，脑室周围内皮细胞在空间上和时间上很好地提供关键线索，以支持端脑和神经神经细胞迁移4,6。因此，利用胚胎脑室周围内皮细胞共培养的实验与神经元祖细胞和/或神经元会为研究神经血管的相互作用和开发新的途径治疗神经退行性疾病或缺血/创伤性脑损伤的一个更有利的模式。
我们强调除去脑膜膜的重要性，不仅限制上皮细胞污染，而且分开的软脑膜血管内皮细胞，其分子和从脑室周围血管网4,6（称为PVECs从软脑膜内皮区分）的内皮细胞的功能不同的。在这里，我们描述了我们经常使用在我们的实验室获得了丰富而纯净的PVECs产量的方法。这些内皮细胞是从胚胎前脑从单一的定时怀孕的小鼠中分离制得。它们可以被扩大，传代培养，并冷冻下成功地供将来使用。
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Protocol
1。试剂和溶液的制备
- 35毫米培养皿中涂：胶原蛋白1型溶液是作为在20mM醋酸（〜100 mg蛋白质/瓶）的水溶液。稀释的胶原溶液适当体积的0.01％用无菌组织培养级水的工作浓度。外套菜用1毫升3-4小时胶原溶液在室温（RT）或37℃，或隔夜在2-8°C。从涂层菜除去多余的溶液，并允许它干通宵。添加介质冲洗前用组织培养级水或PBS的菜。包被的培养皿可以被存储在4℃下一个月。
- 准备完整的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）。补充的DMEM培养基（500ml）中，用10％FBS和抗生素 - 抗真菌剂溶液（1倍浓度; 1 ml/100毫升）。完全DMEM可以储存在4℃下2个月。
- 制备的等分试样（50ml）中的DMEM与DNA酶I（0.001毫克/毫升），（简称为DMEM-DNA酶I）。
- 制备的DMEM另一等份（10毫升）用胶原酶和分散酶（1毫克/毫升）（简称DMEM-collagenase/dispase）。
- 制备内皮细胞培养基（ECCM，500毫升）中，补充有EGF（5微克），ECGS（100mg）和5微升的抗生素 - 抗真菌剂溶液。 ECCM可以储存在4℃下2个月。
- 使用前Prewarm所有媒体。
- 制备纯化缓冲液：PBS，pH 7.2的含有0.5％BSA和2mM EDTA中。保留缓冲区冷（2-8℃）。
2。去除胚胎端脑和夹层
使用实验动物的所有实验都是由麦克林医院的动物护理和使用委员会批准，并符合实验动物的护理和使用美国国立卫生研究院的指导方针。
- 使用定时怀孕CD1小鼠（胚胎15天）。阴道塞发现之日被认为是0天胚胎（E0）。 CD1水坝通常会产生较大的窝，使胚胎10-12S是从怀孕坝预期。
- 对于子宫切开术，麻醉孕鼠腹腔注射氯胺酮（100毫克/千克）/甲苯噻嗪（5毫克/千克）。对于小鼠约20-30克，交付0.3 10毫升/千克氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉的溶液，并确保疼痛，并在麻醉剂的腹膜内注射窘迫是最小的。用手克制为注射剂。
- 由脚趾捏检查深度麻醉。从深度麻醉小鼠的胚胎取出。取出后立即从母亲斩首每个胚胎。将胚胎头在无菌培养皿中冰冷的PBS。
- 2013版：通过直接安乐死与麻醉剂过量（130毫克/千克戊巴比妥，IP），安乐死，这是与动物的安乐死AVMA准则相一致的方法，按照子宫切除术。
- 在立体显微镜，从头部取出大脑细微尖剪刀和细镊子。注：一个高品质的解剖离子是必不可少的成功从胚胎脑取出软脑膜膜。这是通过实践来实现。细镊子和剪刀微尖也很关键工具，获得良好的解剖。
- 使用镊子，以获得有关大脑和微尖剪刀牢牢把握剥开软脑膜膜。取出脑和后脑和隔离端脑。所有的胚胎软脑膜转移无端脑为35 mm培养皿用2毫升的PBS在冰。
3。细胞分离
- 百果端脑到1-2毫米的碎片用手术刀刀片和在含2 ml完全DMEM的15毫升猎鹰管收集组织。
- 轻轻但彻底分离组织与1毫升吸管，直到团块消失，乳白色混悬液的实现。
- 离心分离细胞在800-1000×g离心5分钟，在室温。
- 小心地取下的DMEM-DNA酶一，上清，重悬沉淀轻轻分离的CELLS再次用1ml移液器和离心机在800-1000×g离心5分钟，在室温。
- 重悬沉淀在温暖的完全DMEM。通过无菌70μm的尼龙网过滤细胞。过滤收集细胞，并保持在冰上。
- 收集的细胞的部分保留在网和在RT下1-2分钟，使用DMEM-collagenase/dispase（2毫升）进一步消化。在DMEM-DNA酶I通过离心800-1000×g离心5分钟，在室温洗涤细胞3倍。汇集这些细胞收集在步骤3.5中的过滤单元。用完全DMEM洗一次细胞总数。继续进行以确定细胞数量和磁性标签的步骤。注：获得磁标记之前的单细胞悬浮液是重要的。
4。磁性标签
- 这个协议显示10 7个细胞的磁性标记。为细胞数低于10 7，使用相同的试剂量和细胞数大于10 7，扩展所有试剂体积和总体积相应地（ 例如 2×10 7细胞总数，使用所有显示的试剂量两次）。保持在冰中的所有试剂和细胞。
- 确定与血球细胞数。
- 离心细胞悬浮液在300×g下在室温下10分钟。吸上清完全。
- 加90μl/107细胞的纯化缓冲液将细胞沉淀，接着用10微升CD31微珠的。由制造商提供的微珠偶联单克隆抗小鼠CD31抗体。
- 拌匀，静置在冰箱15分钟。注意：较高的温度和/或磁标记中较长的孵育时间可能会导致非特异性结合。
- 通过在300×g离心10分钟，加入1-2 ml/10 7细胞的纯化缓冲液和离心洗细胞。于500μl纯化缓冲取出上清，重悬细胞。进行到磁性分离或纯化步骤。
5。浦rification
- 放置MS柱中的MACS分离器的磁场。
- 冲洗柱，用500微升的纯化缓冲液中。
- 应用细胞悬液上柱。装入电池的适当数量的MS柱为较高的细胞数可能会阻塞列。注意：每个MS柱可容纳2×10 7个细胞的最大数目，以更高的细胞数，使用更多的列。
- 收集并丢弃流过含有未标记细胞。
- 用500μL的纯化缓冲液3次洗柱。在洗涤步骤，确保该列水库是将后续的纯化缓冲液分装前空。
- 从MACS分离器除去柱，并将其放置在15毫升猎鹰管。
- 柱塞沿与MS列提供。移液管加入1ml净化缓冲到MS柱，并立即冲洗掉磁标记的细胞紧紧推柱塞压入列。
- CEL板LS在35毫米培养皿中预先涂有胶原蛋白1型和在培养箱设定为37℃，用95％O 2和5％CO 2培养细胞中ECCM。
- 改变介质每四天。使用PVECs用于实验或传代培养后10-12天，当菜是融合。
6。光伏精英的亚文化
- 取出ECCM和冲洗PVECS的单层用1-2毫升无菌PBS。
- 轻轻地加入1.5毫升0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液以覆盖细胞单层。
- 返回菜的孵化器。在5-7分钟，将细胞分离从盘的表面上。
- 后的细胞脱离，马上添加胰蛋白酶抑制剂的等体积的和磨碎几次。
- 细胞转移到无菌的15毫升猎鹰管。离心管中，在500×g离心5分钟。
- 去除上清，重悬沉淀于1毫升预热抗干扰的。
- 种子细胞扩大培养，IM老化或其他实验。
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Representative Results
从1-12天PVECs的表型特征示出由相位对比光学显微镜（ 图2）。连接到第1天秀形态的细胞分裂（ 图2A）的特性菜的细胞。间5-8天，从鹅卵石PVECs过渡到梭形形态典型为内皮细胞和更类似于其在体内的状态（ 图2B和2C）。通过12天的PVEC文化达到充分融合（ 图2D）。 PVECs可以很容易地传代培养，扩大殖民地（ 图2E-G）。建立与内皮细胞标志物内皮细胞培养的纯度-凝集素B4，CD-31/PECAM-1，血管性假血友病因子（vWF）和VE-cadherin和决心继代培养（ 图2H-K）之后是一个百分之百。
PVECs的高倍率影像从CD1胚胎以及准备拉杆2-GFP胚胎4（它的内皮细胞表达GFP）所示（ 图3）。除常见的鹅卵石和梭形形态（ 图3A-C），多边形的形态有细长的过程中还观察到凝集素B4-标记和Tie2-的GFP +已经PVECs（ 图3D和3E）。在我们的一些胶原包被的培养皿（在无基质胶的），PVECs形成格子图案类似的体内脑室周围血管网（ 图3F）的独特特征。这反映PVECs的高血管生成潜力。进行血管发生测定法，其中PVECs（2×10 4个细胞）加入到涂有基质胶基质的培养皿。 PVECs显示，在18小时（ 图3G）强大的管形成。这些结果提供了强有力的证据表明，该系统可作为一种体外内皮细胞的模型。 PVECs隔离从CD1胚可以迅速地标记有量子点纳米晶体（ 图3H），提供稳定的强烈荧光入活细胞的细胞质中，并可以用于活PVECs的长期研究，包括迁移，活力，形态，细胞功能测定法如以及在体内实验。 PVECs可以转染细胞示踪样细胞光质膜-RFP，BacMam 2.0（ 图3I）按照生产商的对细胞形态的活细胞成像实验清晰的可视化指示。
我们培养PVECs不仅在ECCM，也可在大鼠脑血管内皮细胞生长培养基（RBECGM）和DMEM F12培养基中。两个相位对比（ 图4A，4C和4E）和植物凝集素B4标记的PVECs在ECCM（ 图4A和4B），RBECGM（图4C培养的图像（ 图4B，4D和4F）和
图1。的PVEC隔离示意图。用于隔离和p的协议从胚胎端脑PVECs的urification被概括为一个模式。 点击这里查看大图 。
图2。 PVECs的表型特征。（AG）PVEC文化在电镀后不同时间点相位对比图像。 （ 一 ）第1天PVEC文化。细胞连接与显示分割形态。 （ 二）第5天PVEC文化和（C）从鹅卵石8日过渡到纺锤形的形态。 （ 四）PVEC文化交汇获得第12天。在继代培养后第1天（E）PVECs，（F）5日（G B4（H），血管性血友病因子（I），CD31/PECAM（J）和VE-钙粘蛋白（K）：用内皮细胞标志物PVECs的（HJ）免疫标记。比例尺：A，100微米（适用于北京），K 50微米。 点击这里查看大图 。
图3。的PVECs的形态。（AE）高倍率影像凝集素B4标记和Tie2-GFP + VE PVECs显示具有修长的长扩展（D，E），鹅卵石和梭形形态（AC）以及多边形的形态。 （<STRONG> F）PVECs显示高血管生成潜力培养皿即使没有基底膜的。 （G）PVECs显示强大的管形成在基底膜上的血管生成实验。 （H）PVECs标示有量子点纳米晶体。 （ 一）PVECs转染细胞光质膜-RFP，BacMam 2.0。比例尺：A，50微米，B，15微米（适用CE），女，100微米（适用于G，H），我 ，50微米。 点击这里查看大图 。
图4。 PVECs在不同的文化传媒节目形态变异成长。（
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Discussion
PVEC的比成年人的大脑内皮细胞和内皮细胞的其他组织来源的研究侧重于神经血管互动更加生理有关，也有治疗潜力。对于PVEC的准备，关键是开始与清扫工作速度快，实现了良好的生存能力，因为死细胞可以非特异性结合CD31微珠。此外，如果单细胞悬浮液之前不与磁性标签的步骤实现的，这将导致故障，因为细胞团块会堵塞柱子。这种方法的一个优点是，没有必要对孵育，用胰蛋白酶对从磁珠分离细胞，在其它基于磁珠的分离方法为乳油制剂4,7中使用的耗时且通常难以步骤。另外，这种隔离技术不需要大量的胚胎脑组织。 PVEC的可以一致地编制基准与APPR使用一个单一的定时怀孕的鼠标oximately 12天，传代培养，并在各种体外和体内实验中使用。
PVECs分离后的纯度在90％以上，但PVECs的传代培养后的纯度为100％。除了内皮细胞，PECAM-1的单核细胞/巨噬细胞的表面上发现。小胶质细胞，当与产后或成人脑8的中枢神经系统的巨噬细胞群是但是非常低的胚胎小鼠大脑。单核细胞/小胶质细胞需要培养基中添加10％胎牛血清和特异性生长因子的增长，他们会消亡，最终在抗干扰和PVECs的继代培养后，将不会持续太久。当需要隔离（例如，测试基因表达）后，立即100％纯PVECs，我们使用荧光激活细胞分选（FACS）方法。 PVECs然后从Tie2GFP胚胎中分离出（在此仅内皮细胞表达GFP）和由双FACS分析严格排序。排序的内皮细胞的纯度都确保了采集细胞L细胞是双阳性的GFP和CD31/PECAM-1 6。
文化也密切在隔离的第一周观察到污染的周细胞样的细胞类型。自周细胞的细胞形状不规则的，绝不会形成融合单层不像内皮细胞组成梭形或多角形，接触的细胞生长为菌落，它们是容易的，如果存在来识别。如果周细胞污染被检测到，胰蛋白酶（0.05％）的低浓度随后又迅速胰蛋白酶消化步骤（2-3分钟）用于PVECs的传代培养。周细胞需要延长胰酶消化时间（7-10分钟），并会保持连接。此外，胰酶消化周细胞的电镀效率（如果有的话）非常差。这些步骤消除周细胞的污染，并确保传代培养PVECs是纯粹的。
在抗干扰介质是含有氢化可的松低血清培养基，肝素和2％胎牛血清并补充有表皮生长因子（EGF）和血管内皮细胞生长添加物（ECGS）。在ECCM成长PVECs呈纺锤状形态一致。大鼠脑ECGM含有10％胎牛血清，生长因子和血管内皮生长因子。在这种培养基上生长PVECs具有非常细长的形态和需要较长时间才能达到汇合。在DMEM-F12培养基是补充有10％胎牛血清，GlutaMAX的细胞和内皮细胞生长补充和它诱导比其他媒体更扩散。虽然在此培养基上生长PVECs表现出非常快速的增长，达到汇合在4天内，他们的形态持平或仅多边形。我们生长在抗干扰PVECs最多三个通道没有表型和功能丧失。因此，ECCM是，我们更喜欢PVEC培养的培养基。
PVECs通过此协议与共同培养神经元前体很可能会刺激神经发生和神经细胞迁移到发不是从成人的大脑或从其他来源的内皮细胞R-更大的范围和可能用于帮助中风，创伤性脑损伤或神经退行性病变神经功能恢复的价值。移植在成人大脑的神经前体常常被报道来搪塞，并无法迁移到需要新的神经细胞区域。这个问题是占到缺乏基材，以促进像放射状胶质指南9神经细胞迁移的。脉管系统越来越多地被赞赏为神经细胞迁移6,10,11基板。 PVECs可能为这些停滞神经元前体在移植部位的解决方案。 PVECs和神经元到受损的大脑区域Coimplantation可促进神经元的迁移指导下由内皮细胞，并有助于实现功能的恢复。内皮细胞迁移神经元的紧密联系也使得他们非常适合提供生长因子和形态发生素直接和选择性进入迁移神经元。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由国家联盟研究精神分裂症与抑郁症（NARSAD）青年研究者奖和国家卫生研究所授予R01NS073635到AV支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
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