Summary
Este video muestra una estrategia fácil y confiable para la preparación de cultivos puros de células endoteliales del cerebro anterior embrionario dentro de 10 a 12 días y será útil para la investigación se centró en muchos aspectos de la angiogénesis cerebral.
Abstract
Células endoteliales cerebrales embrionarias pueden servir como una herramienta importante en el estudio de la angiogénesis y el desarrollo neuro-vascular y las interacciones. Las dos redes vasculares del cerebro anterior embrionario, pial y periventricular, son espacialmente distintivo y tienen diferentes orígenes y patrones de crecimiento. Las células endoteliales de las redes vasculares pial y periventriculares tienen perfiles de expresión de genes únicos y funciones. Aquí se presenta un protocolo paso a paso para el aislamiento, la cultura, y la verificación de las poblaciones puras de células endoteliales de la red vascular periventricular (PVECs) del cerebro anterior embrionario (telencéfalo). En este enfoque, telencéfalo desprovisto de membrana de la pía madre obtenido a partir de día embrionario 15 ratones se pica, se digirió con colagenasa / dispasa, y se dispersa mecánicamente en una suspensión de células individuales. PVECs se purificaron a partir de la suspensión celular utilizando selección positiva con el anticuerpo conjugado con microperlas anti-CD-31/PECAM-1 usando un fuerte magnéticamétodo de separación. Las células purificadas se cultivan en placas de cultivo de colágeno 1 recubiertas en medio de cultivo de células endoteliales hasta que se vuelven confluentes y más subcultivado. PVECs obtiene con este protocolo de adoquines de exposiciones y fenotipos en forma de huso, como se visualiza mediante microscopía óptica de contraste de fases y microscopía de fluorescencia. Pureza de los cultivos PVEC se estableció con marcadores de células endoteliales. En nuestras manos, este método produce de forma fiable y consistente poblaciones puras de PVECs. Este protocolo se beneficiarán los estudios dirigidos a la obtención de conocimientos sobre mecánica en angiogénesis cerebro anterior, la comprensión de las interacciones PVEC y cruzadas las conversaciones con los tipos de células neuronales y tiene un enorme potencial para angiogénesis terapéutica.
Introduction
La angiogénesis, la neurogénesis y la migración neuronal son eventos críticos en el sistema nervioso central (SNC) el desarrollo, la reparación y la regeneración. Varios estudios elegantes han demostrado que las células endoteliales estimula la proliferación neuronal y viceversa a través de la liberación de factores solubles y por contacto directo. Encontramos curioso que en la mayoría de estos estudios 1-3, mientras que progenitoras neuronales células madre neurales / están aislados del cerebro embrionario, que se co-cultivaron con células endoteliales del cerebro adulto, otras fuentes de tejidos adultos, o con líneas de células endoteliales. Esto podría ser en parte debido a las dificultades técnicas asociadas con el aislamiento y el cultivo de poblaciones puras de células endoteliales del cerebro embrionario. Sin embargo, la angiogénesis, la neurogénesis, y la migración neuronal son eventos concurrentes que ocurren en órdenes de magnitud más robusto en el cerebro embrionario que en el cerebro adulto normal. La red vascular periventricular del embryonic cerebro anterior (telencéfalo) se origina a partir de un recipiente situado en el primordio ganglios basales y se desarrolla en la forma de un gradiente ordenada de ventral a dorsal telencéfalo por día embrionario 11 (E11) de 4,5. Este plexo de vasos de la red vascular periventricular son distintos de los buques de pial basada en orígenes, localización anatómica, patrones de crecimiento y regulación del desarrollo 4,5. La dirección de propagación de la pendiente de la angiogénesis periventricular coincide con el gradiente transversal neurogenetic telencephalic. Dentro del telencéfalo, el gradiente de la angiogénesis periventricular y el gradiente de las neuronas GABA que migran tangencialmente superpone espacialmente y 6. Con respecto a la sincronización, el gradiente de la angiogénesis es antes de la pendiente y de la neurona de GABA gradiente neurogenético en aproximadamente un día. Así, las células endoteliales periventriculares son espacial y temporalmente en buena posición para proporcionar señales vitales para ayudar en la neurogénesis y telencephalic4,6 migración neuronal. Por lo tanto, el uso de células endoteliales periventriculares embrionarias en experimentos de cocultivo con células progenitoras y / o neuronas neuronales proporcionaría un modelo más favorable para el estudio de interacciones neurovasculares y el desarrollo de nuevas vías para el tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa o una lesión cerebral isquémica / traumática.
Hacemos hincapié en la importancia de eliminar la membrana pial, no sólo para limitar la contaminación de las células epiteliales, sino también para separar las células endoteliales pial que son molecularmente y funcionalmente distinta de las células endoteliales de la red vascular periventricular 4,6 (PVECs denominados de distinguir de pial EC) . Aquí se describe el método que utilizamos habitualmente en nuestro laboratorio para obtener un rendimiento rica y pura de PVECs. Estas células endoteliales se preparan a partir de prosencéfalos embrionarios aislados a partir de un solo ratón temporizado-embarazada. Se pueden expandir, subcultivaron, y congelaron con éxito para su uso futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de los reactivos y soluciones
- El recubrimiento de 35 mm de placa de cultivo: Colágeno Tipo 1 solución se suministra como una solución acuosa en 20 mM de ácido acético (~ proteína de 100 mg / vial). Diluir un volumen apropiado de solución de colágeno a una concentración de trabajo de 0,01% usando agua de calidad de cultivo de tejido estéril. Platos capa con 1 ml de solución de colágeno durante 3-4 horas a temperatura ambiente (RT) o 37 ° C, o durante la noche a 2-8 º C. Retire el exceso de solución de la placa recubierta y deje que se seque durante la noche. Enjuague el recipiente con agua de calidad de cultivo de tejidos o PBS antes de la adición de medios de comunicación. Placas revestidas se pueden almacenar a 4 ° C durante un mes.
- Preparar medio Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM). Complementar la DMEM (500 ml) con 10% de FBS y solución de antibiótico-antimicótico (concentración 1x; 1 ml/100 ml). DMEM completo se puede almacenar a 4 ° C durante dos meses.
- Prepare una parte alícuota (50 ml) de DMEM con DNasa I (0,001 mg / ml), (a que se refiere como DMEM-DNasa I).
- Preparar otra alícuota (10 ml) de DMEM con colagenasa y dispasa (1 mg / ml) (referido como DMEM-collagenase/dispase).
- Preparar endotelial medio de cultivo celular (ECCM, 500 ml), suplementado con EGF (5 g), DE ECG (100 mg) y 5 l de solución de antibiótico-antimicótico. ECCM se puede almacenar a 4 ° C durante dos meses.
- Precalentar todos los medios de comunicación antes de su uso.
- Preparar tampón de purificación: PBS, pH 7.2 con 0.5% BSA y 2 mM de EDTA. Mantener tampón frío (2-8 ° C).
2. La eliminación de los embriones y la disección de Telencéfalo
Todos los experimentos con animales de laboratorio han sido aprobados por los comités de cuidado y uso de animales de Hospital McLean y se ajustan a las directrices del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
- Utilice ratones CD1 embarazadas cronometrados (día embrionario 15). El día del descubrimiento tapón vaginal se considera el día embrionario 0 (E0). Presas CD1 generalmente producen camadas grandes, por lo que 10 a 12 embrioness se espera de una presa embarazada.
- Para histerotomía, anestesiar a los ratones embarazadas con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg). Para los ratones aproximadamente 20-30 g, entregar 0,3 ml de una solución anestésica 10 ml / kg de ketamina / xilazina y asegurarse de que el dolor y la angustia es mínima durante las inyecciones intraperitoneales de la anestesia. Utilice la restricción de mano para las inyecciones.
- Compruebe anestesia profunda por pizca dedo del pie. Retire los embriones de los ratones anestesiados profundamente. Decapita a cada embrión inmediatamente después de retirarlos de la madre. Coloque las cabezas de embriones en placas de Petri estériles en hielo frío PBS.
- Siga la histerectomía por eutanasia inmediata con sobredosis de anestesia (130 mg / kg de pentobarbital, IP), un método para la eutanasia, que es coherente con las Directrices AVMA de eutanasia de Animales: 2013 Edition.
- Bajo un microscopio estereoscópico, retire el cerebro de la cabeza con unas tijeras MicroTip finas y unas pinzas finas. Nota: Una disección de alta calidadion es esencial para eliminar con éxito la membrana de la pía madre del cerebro embrionario. Esto se logra mediante la práctica. Bellas pinzas y tijeras MicroTip también son herramientas clave para conseguir una buena disección.
- Utilice las pinzas para obtener un firme control sobre el cerebro y las tijeras MicroTip para despegar la membrana pial. Retire el mesencéfalo y metencephalon y aislar el telencéfalo. Traslado telencéfalo-pial libre de todos los embriones a una placa de cultivo de 35 mm con 2 ml de PBS en hielo.
3. El aislamiento de la célula
- Picar el telencéfalo en fragmentos de 1-2 mm con una hoja de bisturí y recoger el tejido en un tubo Falcon de 15 ml que contiene 2 ml de DMEM completo.
- Disociar el tejido suave pero completamente con una pipeta de 1 ml hasta grumos desaparecen y se consigue una suspensión lechosa.
- Centrifugar las células disociadas a 800-1.000 xg durante 5 min a TA.
- Retire con cuidado el sobrenadante y el sedimento se vuelve a suspender en DMEM-DNasa I. suavemente disociar la ceLLS de nuevo utilizando 1 ml de la pipeta y se centrifuga a 800-1.000 xg durante 5 min a TA.
- Resuspender el precipitado en caliente DMEM completo. Las células de filtro a través de una malla de nylon de 70 micras estéril. Recoger las células filtradas y mantenerse en hielo.
- Recoge las proporciones de células retenidas en la malla y digerir más con DMEM-collagenase/dispase (2 ml) durante 1-2 minutos a temperatura ambiente. Lavar las células 3 veces en DMEM-DNasa I a través de centrifugación a 800-1.000 xg durante 5 min a TA. Reunir estas células con las células filtradas recogidos en el paso 3.5. Lavar las células una vez con un total de DMEM completo. Procederá a determinar el número de células y medidas de etiquetado magnéticos. Nota: Es importante para obtener una suspensión de células individuales antes de su etiquetado magnético.
4. Etiquetado magnético
- Este protocolo muestra el etiquetado magnético de 10 7 células. Para el número de células inferior a 10 7, utilice el mismo volumen de reactivo y para el número de células mayor que 10 7, la escala de todos los volúmenes de reactivo y el volumen totalen consecuencia (por ejemplo, para 2 x 10 7 células totales, utilizar dos veces el volumen de todos los reactivos indicados). Mantenga todos los reactivos y las células en hielo.
- Determinar el número de células con un hemocitómetro.
- Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 10 min a TA. Aspirar el sobrenadante por completo.
- Añadir 90 μl/10 7 células de tampón de purificación para el sedimento de células seguido de 10 l de microperlas CD31. Los Microbeads proporcionadas por el fabricante se conjugan al anticuerpo monoclonal anti-CD31 de ratón.
- Mezclar bien e incubar durante 15 min en la nevera. Nota: Las temperaturas más altas y / o un mayor tiempo de incubación durante etiquetado magnética pueden dar lugar a la unión no específica.
- Lavar las células mediante la adición de 1-2 ml/10 7 células de tampón de purificación y centrifugar a 300 xg durante 10 min. Retire las células sobrenadante y resuspender en 500 l de tampón de purificación. Proceder a la separación magnética o etapa de purificación.
5. Purificación
- Colocar la columna de la EM en el campo magnético del separador MACS.
- Enjuague la columna con 500 l de tampón de purificación.
- Aplicar la suspensión celular en la columna. Carga número apropiado de células a la columna de MS como el número de células más alta puede obstruir la columna. Precaución: Cada columna MS puede acomodar a un número máximo de 2 x 10 7 celdas, para un número mayor de células, utilizar más columnas.
- Recoger y desechar de flujo continuo que contiene células no marcadas.
- Lavar la columna con 500 l de tampón de purificación tres veces. Durante las etapas de lavado, asegúrese de que el depósito de la columna esté vacía antes de la adición de alícuotas sucesivas tampón de purificación.
- Retire la columna del separador de MACS y colocarlo en un tubo Falcon de 15 ml.
- Un émbolo se suministra junto con la columna de la MS. Pipetear 1 ml de tampón de purificación en la columna de la MS y de inmediato a eliminar las células marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna.
- Cel Platels en una placa de cultivo de 35 mm recubierto previamente con colágeno de tipo 1 y crecer las células en ECCM en una incubadora a 37 ° C con 95% de O2 y 5% de CO 2.
- Cambiar el medio cada cuatro días. Utilice PVECs para experimentos o subcultura después de 10-12 días cuando el plato es confluente.
6. Subcultura de PV ECS
- Retire el CCME y enjuague la monocapa de PVECS con 1-2 ml de PBS estéril.
- Añadir con cuidado 1,5 ml de solución de tripsina-EDTA 0,25% para cubrir la monocapa de células.
- Devuelva el plato a la incubadora. Dentro de 5-7 minutos, las células se separará de la superficie del plato.
- Después las células se han separado, añadir inmediatamente un volumen igual de inhibidor de la tripsina y se tritura varias veces.
- Transferir las células a un tubo Falcon de 15 ml estéril. Centrifugar el tubo a 500 xg durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 ml de precalentado ECCM.
- Sembrar las células para la expansión de la cultura, el imenvejecimiento u otros ensayos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La caracterización fenotípica de PVECs de días 1-12 se muestra con contraste de fase microscopía de luz (Figura 2). Las células unidas a la placa en el día 1 muestran la morfología característica de la división celular (Figura 2A). Entre 5-8 días, PVECs transición de la piedra del adoquín de husillo morfología en forma típica de las células endoteliales y más afín a su estado in vivo (Figuras 2B y 2C). Durante el día 12 la cultura PVEC logre la plena confluencia (Figura 2D). PVECs pueden ser subcultivadas fácilmente para expandir la colonia (Figuras 2E-G). La pureza de los cultivos de células endoteliales se estableció con marcadores de células endoteliales - isolectina B4, CD-31/PECAM-1, factor von Willebrand (vWF) y VE-cadherina y se determinó que era un cien por ciento después del subcultivo (Figuras 2H-K).
Las imágenes de alta magnificación de PVECs preparan a partir de embriones de CD1, así como TieEmbriones de 2 GFP 4 (cuyas células endoteliales expresan GFP) se muestran (Figura 3). Además de la de adoquines común y en forma de huso morfologías (Figuras 3A-C), también se observaron morfologías poligonales con procesos delgados en isolectina B4-etiquetada y Tie2-GFP + ve PVECs (Figuras 3D y 3E). En algunos de nuestros platos de cultivo revestidos de colágeno (en ausencia de Matrigel), PVECs forman patrones de celosía se asemejan a la característica única de la red en vivo periventricular vascular (Figura 3F). Esto refleja el alto potencial angiogénico de PVECs. Un ensayo de angiogénesis se realizó en la que PVECs (2 x 10 4 células) se añadieron a placas de cultivo recubiertas con matriz de Matrigel. PVECs mostraron la formación del tubo robusto dentro de 18 horas (Figura 3G). Estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de que este sistema se puede utilizar como un modelo in vitro de células endoteliales en. PVECs aisladosa partir de embriones CD1 se pueden etiquetar rápidamente con nanocristales Qdot (Figura 3H) que proporcionan una intensa fluorescencia estable en el citoplasma de las células vivas y se pueden utilizar para los estudios a largo plazo de PVECs en vivo, incluyendo la migración, la movilidad, la morfología, los ensayos de función celular como así como en experimentos in vivo. PVECs pueden ser transfectadas con marcadores celulares como Luz de la celda membrana plasmática-RFP, BacMam 2.0 (Figura 3I) según las instrucciones del fabricante para la visualización clara de la morfología celular en los experimentos de imagen de células vivas.
Estamos cultivadas PVECs no sólo en ECCM, sino también en medio endotelial cerebral de rata crecimiento celular (RBECGM) y medio F12 de DMEM. Tanto contraste de fase (figuras 4A, 4C, y 4E) y B4 isolectina imágenes etiquetadas (Figuras 4B, 4D, y 4F) de PVECs cultivadas en ECCM (Figuras 4A y 4B), RBECGM (Figuras 4C y
Figura 1. Esquema de aislamiento PVEC. El protocolo utilizado para el aislamiento y Purification de PVECs del telencéfalo embrionario se resume en un esquema. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Caracterización fenotípica de PVECs. (AG) imágenes de contraste de fase de la cultura PVEC en diferentes momentos después de la siembra. (A) la cultura PVEC el día 1. Las células se han unido y mostrar morfologías división. (B) la cultura PVEC el día 5 y (C) en el día 8 de transición de adoquines al husillo forma morfología. (D) PVEC cultura alcanzado confluencia en el día 12. (E) PVECs después de subcultura en el día 1, (F) 5 días (G (HJ) Immunolabeling de PVECs utilizando marcadores de células endoteliales: isolectina B4 (H), factor de von Willebrand (I), CD31/PECAM (J) y VE-cadherina (K). Las barras de escala: A, 100 micras (se aplica BJ), K, 50 micras. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. Morfologías de PVECs. (AE) Imágenes de alta magnificación de isolectina B4-etiquetada y Tie2-GFP + ve PVECs muestran adoquines y en forma de huso morfología (AC), así como la morfología poligonal con extensiones largas delgadas (D, E). (<strong> F) PVECs muestran un alto potencial angiogénico en placa de cultivo, incluso en ausencia de Matrigel. (G) PVECs muestran la formación del tubo robusto en un ensayo de angiogénesis en Matrigel. (H) PVECs marcados con nanocristales Qdot. (I) PVECs transfectadas con Luz de la celda membrana plasmática-RFP, BacMam 2.0. Las barras de escala: A, 50 m, B, 15 micras (se aplica CE), F, 100 micras (se aplica G, H), I, 50 micras. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 4. PVECs cultivadas en diferentes medios de cultivo muestran variante morfología. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De PVEC son fisiológicamente más relevantes de adultos células endoteliales cerebrales y EC de otras fuentes de tejidos para estudios que se centran en las interacciones neurovasculares y también tienen un potencial terapéutico. Para la preparación PVEC, es principio fundamental con la disección que trabajar rápido para lograr una buena viabilidad ya que las células muertas se pueden unir de forma no específica a microperlas CD31. Además, si la suspensión de una sola célula no se consigue antes de la etapa de marcaje magnético, esto se traducirá en la solución de problemas ya que los agregados celulares se obstruir la columna. Una ventaja de este método es que no hay necesidad de incubación con tripsina para separar las células de las perlas magnéticas, un paso que consume tiempo y a menudo difícil utilizado en otros métodos de separación basados en perlas magnéticas para preparaciones de la CE 4,7. Además, esta técnica de aislamiento no requiere grandes cantidades de tejido de cerebro embrionario. PVEC de se pueden preparar de manera compatible con el uso de un solo ratón embarazada temporizado en aproximately 12 días, se subcultivaron, y utilizado en una amplia variedad de ensayos in vitro e in vivo.
La pureza de PVECs después del aislamiento es más del 90% pero la pureza de PVECs después del subcultivo es 100%. Además de las células endoteliales, se encuentra PECAM-1 en la superficie de monocitos / macrófagos. La microglía, la población de macrófagos del SNC sin embargo es muy bajo en el cerebro de ratón embrionario en comparación con posnatal o cerebro adulto 8. Los monocitos / microglia necesita el medio suplementado con 10% de suero bovino fetal y factores de crecimiento específicos para crecer, sino que se extinguen con el tiempo en el CCME y no durará después subcultura de PVECs. Cuando se necesitan 100% PVECs puros inmediatamente después de aislamiento (por ejemplo, para poner a prueba la expresión de genes), usamos células activadas por fluorescencia método de clasificación (FACS). PVECs A continuación se aíslan a partir de embriones Tie2GFP (en el que sólo las células endoteliales expresan GFP) y rigurosamente según el análisis FACS de doble. La pureza de los endotelios ordenadal células están garantizadas por colección de células que son doble positivas para GFP y CD31/PECAM-1 6.
Culturas también son observados de cerca en la primera semana de aislamiento para tipos de células contaminantes como pericitos. Dado que las células de pericitos son de forma irregular y nunca formar una monocapa confluente a diferencia de las células endoteliales que consisten en forma de huso o células poligonales, contactados que crecen como colonias, que son fáciles de reconocer si está presente. Si se detecta la contaminación de pericitos, una menor concentración de tripsina (0,05%) seguido por un procedimiento de tripsinización rápida (2-3 minutos) se utiliza para el subcultivo de PVECs. Pericitos requieren un tiempo prolongado tratamiento con tripsina (7-10 min) y permanecerán unidos. Además, la eficiencia de galvanoplastia de la pericitos tratadas con tripsina (si las hay) es muy pobre. Estos pasos eliminan la contaminación de pericitos y asegurar que PVECs subcultured son puros.
El medio ECCM es un medio de suero baja contiene hidrocortisona,heparina y 2% de suero fetal bovino y se complementa con el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y el Suplemento de Crecimiento Celular Endotelial (ECG). PVECs cultivadas en ECCM mostraron la morfología en forma de huso consistentemente. El ECGM cerebro de rata contiene 10% de suero bovino fetal, factores de crecimiento, y VEGF. PVECs crecen en este medio tienen morfologías muy alargadas y tardan más en alcanzar la confluencia. El medio DMEM-F12 se complementa con suero bovino fetal al 10%, GlutaMAX y suplemento de crecimiento de células endoteliales e induce la proliferación más que otros medios. Aunque PVECs crecen en este medio de comunicación mostraron un crecimiento muy rápido y de confluencia alcanzado en 4 días, sus morfologías eran planos o sólo poligonal. Hemos crecido PVECs en CCME para un máximo de tres pasajes sin pérdida de fenotipo y función. Por lo tanto, ECCM es el medio que preferimos para la cultura PVEC.
PVECs cocultured con precursores neuronales en este protocolo son propensos a estimular la neurogénesis y la migración neuronal a far-mayores extensiones que las células endoteliales de cerebro adulto o de otras fuentes y pueden ser útiles para ayudar a la recuperación de la función neurológica en el accidente cerebrovascular, lesión cerebral traumática o la neurodegeneración. Precursores neuronales trasplantadas en el cerebro adulto a menudo han sido reportados para detener y no migrar a regiones que requieren nuevas neuronas. Este problema se tiene en cuenta a la ausencia de sustratos que facilitan la migración neuronal como guías radiales gliales 9. Vasculatura es cada vez más apreciado como sustratos para la migración neuronal 6,10,11. PVECs pueden ofrecer una solución para estos precursores neuronales estancadas en los sitios de trasplante. Coimplantation de PVECs y las neuronas en las regiones cerebrales dañadas puede facilitar la migración de las neuronas guiada por las células endoteliales y ayudar a lograr la recuperación funcional. La estrecha asociación de las células endoteliales con neuronas que migran también las hace especialmente adecuado para ofrecer unos factores de crecimiento y los morfógenos directa y selectiva enla migración de las neuronas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión (NARSAD) Young Investigator Award y los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01NS073635 a AV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm Culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell Applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 305050-061 | |
| Tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soybean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Fluorescent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
