Summary
신경 가소성은 위장 (GI) 요로의 점점 인식하지만, 충분히 이해 기능입니다. 여기, 인간의 췌장 질환의 예에서, 우리는 형태 학적 및 기능적 수준에서 위장관의 신경 가소성 연구를위한 생체 외 신경 가소성의 분석을 제시한다.
Abstract
신경 가소성은 병적 인 조건에서 장용 신경계와 위장관 (GI) 신경 분포의 고유 기능입니다. 그러나 GI 장애의 신경 가소성의 병태 생리 학적 역할은 알려지지 않았다. 시뮬레이션 및 GI의 신경 가소성의 조절을 허용 새로운 실험 모델은 췌장암 (PCA)과 만성 췌장염 (CP)과 같은 특정 위장관 질환에서 신경 가소성의 기여의 강화 된 감사를 가능하게 할 수있다. 여기, 우리는 신생아 쥐의 척수 신경절 (DRG)와 myenteric 신경총 (MP) 신경 세포를 사용하여 생체 조건에서 췌장 신경 가소성의 시뮬레이션을위한 프로토콜을 제시한다. 이러한 이중 신경 세포의 접근 방식은 두 기관의 내장과 - 외인성 신경 가소성의 모니터링을 허용뿐만 아니라, 신경 세포와 신경 교세포의 형태 및 전기 생리학을 평가하는 유용한 도구를 나타냅니다뿐만 아니라. 또한, 자신의 IMPAC 공부를 위해 공급되는 미세 내용의 기능 조절을 할 수 있습니다신경 가소성에 t. 일단 설정되면, 본 신경 가소성 분석은 GI 기관의 신경 가소성의 연구에 적용 할 수 있다는 가능성을 맺는다.
Introduction
위장 (GI) 신경의 형태와 밀도의 변화는 오랜 시간 동안 소화기 및 병리학의 관심을 끌었했지만, 위장관 질환의 병태 생리에 대한 자신의 관련성은 1-3 알려지지 않았다. 실제로, 위염, 역류성 식도염, 대장염, 게실염, 충수염과 같은 몇 가지 매우 일반적인 위장 장애는 염증 조직 분야 1 증가 신경 분포 밀도와 연관되어 있습니다. 그러나, 진짜 관심은 지금까지 위장관의 메커니즘과 신경 가소성의 의미에 지불되지 않았다. 형태 학적으로 변형 된 GI의 신경은 그 기능의 측면에서, 장용 신경계의 정상 상태, 즉 정상 GI 신경과 다를합니까? 플라스틱 장내 신경의 변경된 신경 펩타이드 / 신경 전달 물질의 내용의 의미는 무엇입니까? 말초 신경 가소성은 항상 중앙 신경 시스템에 변경된 신호를 수반 하는가? 어디 플라스틱 extri의 중심 돌기는NSIC GI의 신경 경로? GI의 신경 가소성의 기능적 측면에 대한 우리의 지식의 소수를 볼 때와 같은 핵심 질문의 긴 시리즈를 쉽게 생성 할 수 있습니다.
기능 수준에서 위장관 신경 가소성의 연구는, 유효한 재현 여전히 쉽게 적용 할 수있는 실험 모델을 필요로한다. 증가의 시대에 인기와 같은 생체 설정에서 유전자 조작 조건부 마우스 모델 (GECoMM)의 수용은 실제 패션 1 GI의 신경 가소성의 이전에 알려지지 않은 측면을 명료하게 할 수있는 잠재력을 부담. 그러나 GECoMM의 설계 및 제조는 비용이 많이 드는 노동 집약적 유지하고, 특히, 시간이 많이 소요. 또한, 그들은 조건부 유전자 조작 마우스 (장내 상피 세포에서 신경 성장 인자 / NGF의 예를 들면 유전자 과발현) 변조 할 대상의 사전 선택이 필요합니다. 따라서, DES에 대한성공적인 GECoMM의 IGN이 연구원은 가치있는 목표의 몇 가지 지표 (예를 들어, 이전의 실험 데이터)가 필요합니다 (여기 NGF) 그 분자가 적어도 GI 신경에 대한 몇 가지 생물학적으로 중요한 영향을 미칠 것으로 예상 할 수있다 즉.
이러한 지표들은 쉽게 생체 시스템의 복잡한 미세 환경으로부터 격리 세포 아형 선택적 이형 방식 4-7 공 배양 할 수있는 시험 관내 모델에서 적절한로부터 유도 될 수있다. 이러한 이형 문화 환경에서 분자 표적의 변조는 빠르고, 평균 기술적으로 덜 복잡하고, 따라서 생체 내 연구의 검증을 위해 가치있는 대상의 사전 필터링에 도움이 될 수 있습니다.
최근에, 우리는 intrapancreatic NE의 증가 된 신경 밀도와 비대를 시뮬레이션하기 위해 설계되었습니다 체외 신경 가소성의 분석을 제시인간의 췌장암 (PCA)과 만성 췌장염 (CP) 조직에서 rves. 여기에, 신생아 쥐의 척수 신경절 (DRG) 또는 myenteric 신경총 (MP)에서 파생 된 신경 외과 적 절제 PCA 또는 CP 조직 표본에서 조직 추출물에 노출 정상적인 인간의 췌장 (NP) 조직 추출물 5 배양에 비해했다. 대신 조직 추출물 번 또한 신경 가소성의 선택된 세포 유형의 영향을 연구하기 위하여 세포주 상층 액을 사용할 수있다. 표준화 된 형태 계측 학적 측정과 함께 사용하면되게 신경 가소성의 분석은 다른 췌장 미세 환경에 대한 응답으로 신경 가소성의 유효하고 재현성 평가를 할 수 있습니다. 특히, 허용하는 신경 돌기의 가지, 패턴 및 신경 크기 분기, 2) 기능 신경 가소성, 말초 신경의 흥분에, 즉 변화의 변화 즉, 1) 형태 학적 신경 가소성의 시뮬레이션. 또한, 주변뿐만 아니라 (즉, (예 DRG 또는 2 차 척추) 신경은 여러 GI 조직 내용에 그들의 형태 학적 및 기능적 반응을 평가하기 위해, 본 분석에 포함시킬 수있다. 본 비디오 튜토리얼에서, 우리는이 분석의 성능에 대한 기술적 인 프로토콜을 설명하고 그 장점과 단점에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 GI 기관의 신경 가소성의 연구에이 분석의 기본 개념의 적용에 관심을 그립니다.
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Protocol
프로토콜의 모든 동물 실험 절차는 TECHNISCHE Universität 뮌헨, 독일의 동물 관리 지침을 따르십시오.
1. 미디어 / 준비를 추출
- 조직의 균질화
조직 균질의 품질은 배양 된 뉴런 neuroplastic 변경의 결과 탐지에 매우 중요합니다. 여기서, 균질화는 조직의 온도에 큰 증가없이 조직의 분리를 가능하게하는 것이 좋습니다.- 전송 5mm × 5 ㎜ × 5 ㎜의 직접 조직 homogenator에서 고체 상태에서 액체 질소와 장소에 -80 ° C에서 췌장 조직의 큐브. 이상적인 homogenator는 녹이다를 허용하지 않고, 충분히 빨리 조직을 떼어 놓다 것입니다.
- 즉시 분리 후, 0.1X 인산 완충 식염수 (PBS)의 300-500 μL에서 고체 분말 형상의 파쇄를 재현 탁. 여기,이 신경 세포를 용해 수 있기 때문에 (예 : RIPA 같은) 용해 버퍼를 사용하지 않습니다.
- 벤치 원심 분리기 (예 : 21,130 XG)의 최대 속도로 적어도 15 분 동안 균질화를 원심 분리기. 조직 추출물을 나타내는 맑은 상층 액을 수집합니다.
- 세포주 상층 액
- 정상적인 성장 매체에 80 %의 합류 - 관심의 세포가 적어도 70에 도달 할 수 있습니다.
- 일반적으로 이러한 미디어는 혈청 성분을 포함하고 신경 세포의 성장에 따라 통제 할 수없는 효과를 발휘할 수있다. 따라서, 원하는 세포 밀도에 도달 한 후, 세포 배양 등급 PBS로 최소한 3 배 당신의 세포를 세척하고 최대 48 시간 동안 무 혈청 배지 (SFM)에 배치합니다.
참고 : 여기에, (췌장 성상 세포와 같은) 일부 세포가 정상 상태와 구조를 유지하기 위해 자신의 성장 배지에 혈청을해야 할 수도 있음을 고려해야합니다. 그러한 경우에, 본래 세포 능의 필요한 최저 혈중 콘텐츠를 찾기 위해 그 셀의 직렬 혈청 배지에서의 희석을 수행N. - 브래드 포드 단백질 분석을 통해 조직 균질 액 또는 세포 상층 액의 단백질 농도를 측정한다. 이러한 값이 조직 및 세포 종류에 따라 다르지만, 췌장 조직 추출물에 대해, 하나는 5-12 ㎍ / μL 사이의 농도 범위를 예상하고, 3-8 ㎍ / μL 사이 세포주 상청액위한 것이다.
2. 나누어지는 추출물과 세포의 상층 액
분석에 사용되는 농도에 따라 신경원 매체 추출물 또는 상등액에 최종 농도가 100 ㎍ / ㎖의 5,8이어야한다.
참고 : 신경 세포는 24 웰 플레이트의 각 웰에 500 ㎕의 배지에서 성장 분석을 위해, 하나는 잘마다 각각의 추출물 또는 상층 액의 단백질 50 μg을 필요로한다. 약 10 ㎍ / μL의 전형적인 추출물의 농도로, 하나는 각 웰에 대한 추출 / 상층 액의 5 μl를해야합니다. 각을 맞춘다에서G 세중으로 수행,이 추출물 / 상층 액 15 μL에 해당하는 것입니다. 다른 조직이나 세포 유형의 경우, 최종 추출물 또는 상층 액 농도의 시리얼 희석을 수행하고 다른 추출물 / 상층 액의 농도 사이의 관찰 된 신경 영양 효과를 비교.
뉴런의 3. 분리
추출 / 상층 액을 수집이 완료되면, 신경 세포의 분리와 함께 계속한다.
- DRG 뉴런의 경우, 생후 (P) 2-12 잘린 및 DRG의 stereomicroscopic 해부 (그림 1A) 후 사이에 태어난 쥐의 DRG를 허리에 자궁 경부를 수집합니다. , 24 - 웰 플레이트에 충분한 DRG 뉴런이 접시 당 (52 DRG를 동등) 한 신생아 쥐의 DRG를 허리 모든 자궁 경부를 수집하기 위해.
- microscissors에 의해 주변 장치 (신경) 및 DRG의 중앙 돌출부 (뿌리)을 버려야.
장소에 돌기를두면 분쇄을 방해하고 T를 증가그는 섬유 아 세포에 의해 문화의 위험을 오염.
- microscissors에 의해 주변 장치 (신경) 및 DRG의 중앙 돌출부 (뿌리)을 버려야.
- MP 뉴런의 경우, 수동으로 소장과의 장간막을 버려야 조심스럽게 소장 (MP 격리에 대한 자세한 프로토콜, 샤퍼 등. 9 그림 1B 참조)의 seromuscular 층을 벗겨. MP를 들어, 24 잘 플레이트 당 두 쥐의 신경 얼기를 수집합니다.
참고 : 그들은 소장에서 성공적인 분리를 방해하기 때문에 seromuscular 층에서 눈물을 방지하기 위해 될 수있는 한 부드럽게 대하기 위해보십시오. - 겐타 마이신 (500ml의 배지에서 20 ㎎) 및 metronidazol (500 ㎖의 중간에있는 2.5 mg)을 함께 제공 얼음처럼 차가운 최소한의 필수적인 매체에서 DRG와 seromuscular 층 (MEM)를 수집합니다.
- DRG의 모음에 따라, 20 ~ 30 분 동안 콜라게나 유형 II와 함께 제공 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에서 그들을 품어. MP 격리를 들어, 연령에 따라 1 ~ 3 시간 사이에 콜라게나 유형에 품어동물 (그림 1C)의.
- MP의 경우, 실체 현미경 그물코 형상 MP 조각들을 수집하고 빙냉 MEM으로 옮긴다.
- 그런 다음 직경 감소와 주사기를 통해 DRG와 MP를 씹다.
참고 : 과도한 분쇄가 신경을 파괴, 그러나 더 적은 아교 세포 수 있습니다. - DRG 또는 MP를 포함하는 매체가 5 분 93.9 XG에서 정지 흐림, 원심 분리가되면, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 0.5의 L-글루타민에게 보충 Neurobasal 매체의 중간에 resuspend을 (폐기 2 % B-27).
- 혈구에 의해 셀의 총 개수 (즉, AND 신경 아교)를 센다.
주 : 필요한 세포의 수가 측정 파라미터에 의존한다. 신경 돌기 밀도의 정량, 신경 돌기는 한 가지, perikaryonal 사이즈의 측정보다 밀도 배양함으로써 세포의 더 많은 수를 필요개별 뉴런의 패턴을 분기. 신경 돌기의 밀도 측정의 경우, 예를 들어 잘 10,000 세포 (신경 세포 + 아교) / 또는 1,500 뉴런 / 잘 사용합니다. 개별 뉴런, 짧은 (1 분 길이) 세포의 trypsination 2,500 세포 / 웰 또는 400 뉴런 /의 파종에 대한 형태 학적 잘 좋습니다. 한 쥐에서 얻은 세포의 전형적인 수율은 약 300,000-500,000 세포입니다. - 전날 밤에 코팅 된 13mm 커버 슬립에 세포를 씨앗과 (100 U / ㎖ 페니실린과 보충, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 0.5 mM의 L-글루타민 2 % B-27) Neurobasal 매체 (그림에게로 우물을 위로 1D).
참고 : 사용 폴리 - D - 라이신 (40 ㎎ / 평방 미터) 또는 오르니 틴과 라미닌 코팅 된 코팅 (1 ㎎ / ㎖ 각) 커버 전표. 세포는 이렇게 많은 세포 불필요되는 실험 (즉 신경 돌기 밀도 측정)에 적합하다, 매우 빠른 폴리-D-라이신에 부착. 라미닌에 첨부 파일은 일반적으로 몇 가지에약한 것을하지만, 라미닌은 신경 돌기 가지의 강력한 프로모터이다. 따라서, 신경 분지와 신경 돌기의 길이에 대한 측정을 위해, 오르니 틴 / 라미닌 코팅을 선호한다. - 세포는 하룻밤 우물에 부착 할 수 있습니다. 다음 날, (100 ㎍ / ㎖의 최종 추출물 / 상층 액 농도) 추출물이 첨가 된 미디어를 준비합니다.
- 시드 매체를 대기음하고 PBS로 선택, 매우 부드러운 세척을 수행 한 다음 천천히 추출 / 상층 액을 보충 된 미디어 (그림 1E)를 피펫.
- 세포는 48 시간 동안 성장하자. 미디어를 대기음 (그림 1 층) 면역 염색을 위해 4 % 파라 포름 알데히드에 고정합니다.
- 신경 세포의 특정 (예 : 베타 III-튜 불린)과 glia의 별 (예 : 아교 fibriallary 산성 단백질 / GFAP) 마커 (그림 1G)를 사용하여 이중 면역 형광 염색을 수행합니다.
- 형태 학적 들어, 콤비네이션 위스콘신에서 CCD 카메라가 장착 도립 광학 현미경을 사용신경 돌기의 밀도를 측정 할 수 자동화 소프트웨어 (표 참조) 번째.
- 의 연결을 문화의 신경 돌기의 밀도는 50 ㎛ × 50 ㎛의 격자를 중첩시키고 교차 섬유 측정 단위 면적당 섬유 밀도를 계산하여 각 coverslip에 대한 밀도 높은 성장의 4 가지 영역에서 200 배 배율에서 4-5 대표 현미경에서 측정됩니다. 신경 돌기의 가지, 신경 세포 당 가지 수를 의미, 평균 분기 길이 perikaryonal 크기는 신경 돌기 및 perikarya (그림 1H)를 표시하여 각 coverslip에에서 무작위로 선택된 30 고독한 뉴런에서 측정 할 수있다.
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Representative Results
형태 학적 신경 가소성
갓 태어난 쥐 (P2-12) 및 파종 밀도의 표시 연령 범위에서, MP 및 DRG 뉴런은 이미 48 시간 (그림 2A) 이후 밀도의 연결 네트워크를 구축 할 수 있습니다. PCA, CP에서 재배 뉴런 사이의 신경 돌기의 밀도, NP 추출물의 비교 NP 추출물에 비해 PCA 또는 CP 추출물의 DRG 뉴런의 큰 신경 돌기의 밀도 (그림 2A) 5를 보여준다. MP 뉴런이 더 쉽게 DRG 뉴런보다 주변 아교 세포에서 떼어 놓다 경향이 있기 때문에 우리는 특히, 개별 뉴런에 대한 측정을 위해 MP 신경을 선호합니다. 여기에, PCA 또는 CP 추출물에서 재배 MP 신경도 더 이상 신경 돌기를 구축하고 포함 된 NP-추출물 매체에서 성장 MP 뉴런보다 복잡한 분기 패턴 (그림 2B)를 전시 5. NP, CP, 그리고 PCA 추출물에 의해 유도 된 신경 세포의 형태의 차이의 부재에 기술적 인 문제가 있음을 나타냅니다ssay. 대부분의 경우에, 이것은) 인해 긴 처리 시간 또는 2)에 의한 분리 공정 중에 발생한 신경 손상으로 제조 된 추출물의 품질이 한 원인 일 수있다.
기능성 연구
신경 가소성 분석은 보충 추출물 또는 상등액에 대한 관심의 특정 표적 분자의 존재 또는 부재에 의해 유도 된 변경을 검출하기에 충분히 높은 감도를 맺는다. 예를 들어, NGF에 특정 차단 항체를 추가하거나 신경 세포의 네트워크 형성 (그림 2C) 10의 감쇠 Artemin 결과 dynabead 유도 고갈 PCA 세포에서 신경 영양 인자 Artemin 또는 신경 성장 인자 (PCC) 상층 액의 봉쇄. 최근 연구에 따르면, 우리는 NGF, 아교 세포 - 라인 변환 해주는 등의 다른 신경 영양 인자를 동시에 비교하여 CP의 신경 가소성에 신경 영양 인자 세핀의 기여에 대한 매우 비슷한 효과를 보여줄 수ED 신경 영양 인자 (GDNF) 또는 변형 성장 인자 - 베타 (TGF-β) 11.
아교
같은 접근은 또한 췌장 미세 환경 목차 DRG 관련 위성 아교 세포 또는 장용성 신경교의 반응을 평가하기 위해 적용될 수있다. 실제로, DRG 또는 MP 관련 아교에 따라 PCA 조직 추출물의 가장 강력한 효과 중 하나는 아교의 성장 (그림 3) 5에서 눈에 띄는 증가이다. 또한,이 효과는 CP에 비해 PCA에서 더 뚜렷하다. 여기에, 하나는 아교의 확산은 절대 glia의 카운트에 따라 판단이 아니라 신경 세포 (glia의 신경 세포 색인)에 아교 세포의 상대적 비율에 수 없습니다 고려해야한다 5. 이는 뉴런 반대로 이러한 문화 아교 세포의 개수로 인해 교세포의 증식 효능을 제어하는 것이 더 어렵 기 때문에 고려하는 것이 특히 중요하다.
그림 1. 체외 신경 가소성 분석의 도식 프로토콜입니다. 본 분석은 갓 태어난 쥐의 척수 신경절 (DRG)와 myenteric 신경총 (MP) 뉴런 신경 세포와 신경 교세포의 형태에 따라 췌장 조직의 추출물 또는 세포 상층 액의 영향을 연구하기 위해 사용한다. DRG는 전방 후궁 절제술 및 절제하고 소장의 기계적 박리 후 MP 함유 seromuscular 층 후 수집 (A, B). 콜라게나 제 II 형 소화 한 후, 뉴런은 광고가 24 시간 (C, D)에 재배 (자세한 내용은 텍스트를 참조) 필요한 농도에 씨앗을 품고있다. 이어서, 새로 제조 된 췌장 (또는 그 어떠한 GI 기관에서) 추출 및 세포 상청액은 이전에 정의 된 농도 (E)에서 신경 세포의 성장 배지에 첨가한다.48 시간 후, 문화는 4 % 파라 포름 알데히드에 고정되며 신경 세포와 아교 세포 마커 (F, G)에 대해 이중 면역 염색. 신경 돌기의 밀도, 신경 분기 패턴과 perikaryonal 크기를 포함하여 신경 세포의 형태는, 표준화 된 소프트웨어 프로토콜 (H)에 의해 측정된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 인간의 췌장암 (PCA)과 만성 췌장염 (CP)에 의해 유도 된 췌장 신경 가소성. 인간의 췌장 조직의 추출물 수술 DRG 네브라스카의 신경 돌기의 밀도에서 눈에 띄는 차이를 유발 정상 췌장 (NP), CP 또는 PCA 조직에서 파생 된 urons (A) 및 MP 뉴런 (B)의 신경 분지 패턴. 여기에, PCA 및 CP 조직 추출물 DRG와 MP 뉴런에 따라 눈에 띄는 신경 영양 효과를 발휘한다. 조직 추출물, 개별 세포 유형 (여기 췌장암 세포 / PCC)의도 상청액 유사 또한 현저 DRG 뉴런 (C)의 신경 돌기의 밀도를 증가시킨다. 이 증가는, 그러나, 그런 artemin (Artn) 또는 신경 성장 인자 (NGF)와 같은 선택된 신경 영양성 인자가 고갈 또는 이들 상등액에 의해 폐쇄 될 때 가역적이다. 모든 뉴런은 β-튜 불린 III-대하여 면역 염색. 100 배 배율의 모든 이미지는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3. 췌장 미세 환경 내용에 아교 반응. 췌장 PCA에서 조직 추출물 또는 CP 조직은 신경 영양 효과를 가지고 있지만, 또한 DRG 또는 MP 문화 아교 세포의 성장과 아교 세포 수를 향상시킬뿐만 아니라. 아교 세포는 아교 마커 섬유 성 신경 교세포 산성 단백질 (GFAP)에 대하여 면역 염색. 200X 배율의 모든 이미지는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 프로토콜은 최근 PCA와 CP 5에 신경 가소성의 메커니즘을 연구하기 위해 우리의 그룹에 의해 개발 된 생체 췌장 신경 가소성 분석 뒤에 방법론을 설명하기위한 것입니다. 프로토콜은 연기자가 DRG와 MP 신경 세포의 분리 및 문화에 충분한 경험을 쌓았되면 쉽게 적용 할 수있는 세 가지 일의 절차를 포함한다. 또한, 췌장 미세 환경의 구성 요소에 장내 및 DRG 관련 아교의 수반하는 반응을 연구하기위한 귀중한 도구를 나타냅니다.
우리의 의견으로는,이 분석의 가장 흥미로운 기능 중 하나는 체외에서 간단하게 설정에서 PCA와 CP (즉, 신경 발아 및 비대) 동안 발생하는 변경을 감지하고 시뮬레이션 할 수있는 기능입니다. 사실, w의 연결 형태의 변화에 조직 추출물 또는 세포 상층 액 결과의 응용 프로그램HICH 체계적인 형태 계측 학적 분석에 의해 충분한 감도로 검출 될 수있다. 최근에, 우리는 또한이 분석은 또한 동시 비해 여러 암 엔티티 신경성 전위의 차이를 감지 할 구분이 있음을 입증 할 수 : PCA 세포주 신경성 특성이 대장 암의 세포주와 비교했을 때, PCA 세포주 크게 유발 대장 암 라인 8보다 DRG 뉴런 사이에 큰 신경 돌기의 밀도. 심지어 결장암 세포주 대 직장의 비교, 대장 암 세포주들은 neuroplastic 전위 (8)의 측면에서 직장암 세포 열등되었습니다.
이 분석의 주요 장점 중 하나는뿐만 아니라 형태 계측을위한 쉬운 접근, 또한 전기 생리학 분석이다. 정의 미디어 내에서 우리의 분석의 뉴런에서 슬라이스 준비, 녹음 또는 현장에서 뉴런에 반대정의 요인 bsence / 오버 존재는 기술적으로 요구되지 않으며, 신경 세포의 활동에 이러한 미세 환경에서 선택한 분자의 역할에 가치있는 정보를 제공 할 수 있습니다.
물론, 제시된 분석은 전적으로 췌장 신경 가소성과 관련된 질문에 대한 연구로 제한 간주되어서는 안된다. 신경 가소성은 염증 장내 신경 병증 1-3으로 병적 인 조건에서 전체 위장관의 눈에 띄는 특징이다. 이러한 모든 조건은 신경 분포 형태 및 변형 된 신경 활성 1-3의 변화와 관련이있는 것으로보고되었다. 그러므로, 대응하는 조직 유래라면 췌장 조직 추출액 또는 세포 라인을 대체하고 뉴런 및 신경교 첨부 그들의 특정한 영향을 연구하기 위해 생각할 수있다. 췌장과 대장 암 조직의 비교에 대한 우리의 최근의 분석은이 개념 8을 지원합니다. 그러나, 그것은 또한 가정하에에 그럴듯우리가 일상적으로 췌장 조직의 구성 요소에서 관찰 다른 조직의 미세 환경의 구성 요소와 같은 민감한 대표적인 변화를 유도하지 할 수있는 전자. 따라서, 우리는 "부정적인"제어 조직 (즉, 신경 비대 대한 조직 학적 증거) 대 "긍정적 인"제어 조직 (예를 들어, 조직 학적으로 증명 신경 비대 즉, 조직)에 의해 유도 된 신경 세포의 형태의 이전 광범위한 평가를 권장합니다.
이 분석에서 교세포의 반응에 우리의 이전의 분석은 다른 췌장 미세 환경에 아교 세포 수의 결정에 제한되었다. 아교 세포는 자신의 신경성 잠재력의 인식과 폐해 막 (12)을 따라 칼슘 전류에 대한 관심이 증가하기 때문에 신경 생물학의 새로운 중요성을 가지고있다. 따라서,이 분석에서 신경교 세포는 또한 상기 기능적 분석에 쉽게 접근 할 수있다새로운 접근 방식으로. 그러나, 추가 혁신적인 접근은 추가 연구에 대한 자신의 응용 프로그램을하기 전에 이전의 광범위한 검증이 필요합니다.
다른 실험 분석과 마찬가지로, 또한 제시된 신경 가소성의 분석은 수술을받은 다른 환자로부터 얻은 인간의 조직 샘플의 일부 제한된 비교를 맺는다. 이러한 조직이 신뢰할 수있는 분석 1 (기본 종양의 질량에서 예를 들면 췌장 머리) 같은 조직의 지역에서 파생하는 것이 필수적입니다. 또한,이 전제 조건이 충족되는 경우에도, 조직 또는 종양 생물학 상기 차이는 서로 다른 개인 하나의 생물학적 응답 패턴에 큰 변화를 고려에서 제외 될 수 없다. 기업 당 10 다른 환자 - 이러한 개별 조직의 차이를 회피하기 위해, 우리는 적어도 5로 즉, 가능한 한 많은 환자에서 얻은 조직과 분석의 성능을 권장합니다.
핵심 기술면, 우리는 신경 세포의 성장에 코팅 물질의 역할에 주목하고 싶습니다. 로 또한 위에서 언급 한, 우리는 신경 돌기의 밀도에 대한 측정을 위해 폴리-D-라이신을 선호하고, 개별 신경 세포의 분기 / 가지 패턴에 사람들을 위해 오르니 틴 / 라미닌 코팅. 신경 가지의 측정은 또한 폴리-D-리신 - 피복 표면에 대해 수행 할 수있는 반면, 우리의 손에서,이 방법은 실제 차이를 분석의 감도가 저하되는 경향이 있음을 발견. 따라서,이 분석을 적용 연구자 또한 그들의 질문에 대한 최적의 코팅 재료의 사용을 보장한다.
요약하면, 우리의 예에서와 같이 제시 신경 가소성의 분석은, 신경 형태와 서로 다른 조직의 미세 환경에있는 신경 기능에 신속하고 재현성있는 정보를 얻을 수있는 유용한 도구를 나타내고 있다고 생각합니다췌장 조직. 다른 췌장 조직의 내용에 의해 유도로 신경 형태의 차이에 민감한 검출은 인간의 PCA와 CP에서 췌장 신경 가소성의 체외 재현성을 강조한다. 미래의 노력이 적용 상층 액의 최적화 preassay 검사를 목표로 GI 질병 관련 신경 가소성의 연구에 가장 적합한 정의 미디어를 달성하기 위해 추출한다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁의 관심과 재정적 공시가 없습니다.
Acknowledgments
모든 저자가 제시 한 분석의 설립 및 검증으로하고 원고의 초안에 기여했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13 mm Coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life Sciences | 21103-049 | |
| B-27 Supplement | Gibco/Life Sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life Sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200 U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco/Life Sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
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