يتم تقديم منهجية لإعداد ثقوب النانو الحالة الصلبة في حل للتجارب إزفاء الجزيئية البيولوجية. من خلال تطبيق نبضات قصيرة من الحقول الكهربائية عالية، وقطرها ثقب النانو يمكن تكبير controllably بدقة subnanometer وخصائص الضوضاء الكهربائية قد تحسن بشكل ملحوظ. يتم تنفيذ هذا الإجراء في الموقع باستخدام المعدات المختبرية القياسية تحت ظروف تجريبية.
مقالة منهجية
صقل الحجم والتقليل من الضوضاء من الحالة الصلبة ثقوب النانو
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ظهرت ثقوب النانو الحالة الصلبة بوصفها أداة متعددة الاستعمالات لتوصيف الجزيئات الحيوية واحدة مثل الأحماض النووية والبروتينات 1. ومع ذلك، فإن إنشاء ثقب النانو في غشاء رقيقة عازلة لا يزال تحديا. أساليب التصنيع التي تنطوي على نظم شعاع الالكترون تركيزا المتخصصة يمكن أن تنتج ثقوب النانو واضحة المعالم، ولكن العائد من ثقوب النانو موثوقة ومنخفضة الضوضاء في الأغشية المتاحة تجاريا لا يزال منخفضا 2،3 والتحكم في حجم هو غير بديهي 4،5. هنا، وتطبيق مجالات كهربائية عالية لصقل ويتجلى حجم ثقب النانو مع ضمان الأداء الأمثل منخفضة الضوضاء. وتستخدم هذه نبضات قصيرة من حقل كهربائي عالي لإنتاج إشارة كهربائية البكر وتسمح لتوسيع ثقوب النانو من الدقة مع subnanometer عند التعرض لفترات طويلة. يتم تنفيذ هذا الأسلوب في الموقع في بيئة مائية باستخدام المعدات المختبرية القياسية، وتحسين العائد واستنساخ من لياليالدولة شهيد ثقب النانو تلفيق.
المقدمة
توفير ثقوب النانو الحالة الصلبة البيولوجية ووسائل الاستشعار عن بعد التحاليل البيولوجية في الجزيء مستوى واحد 1. وعادة ما تكون جزءا لا يتجزأ من ثقوب النانو الفردية في أغشية رقيقة عازلة، وتوفير قناة للتيار الأيونية فقط لتمرير بين خزانين السائل. الاستفادة من مبادئ عدادات كولتر على نطاق أوسع، والتجارب ثقب النانو تتصل التغييرات في الأيونية الحالية لتحديد طول وحجم وتهمة والتشكل من الجزيئات الحيوية مشحونة لأنها هي التي تحرك electrophoretically من خلال ثقب النانو في وجود مجال كهربائي خارجي.
بينما ثقوب النانو البيولوجية مثل α-حالة دموية عادة ما تقدم حساسية أكبر وخصائص منخفضة الضوضاء 3، ودعم طبقة ثنائية الدهن لا يزال هشا وحجم ثابت، مما يحد من تطبيقها. من ناحية أخرى هي ملفقة ثقوب النانو الحالة الصلبة، في رقيقة (10-50 نانومتر) نيتريد السيليكون أو أغشية أكسيد السيليكون، ويمكن أن تكون مصنوعة من الاحجام المختلفةوفاق، أن تكون متكاملة بسهولة مع التكنولوجيات رقاقة النطاق 6،7، وأكثر قوة، والسماح لمجموعة واسعة من الظروف التجريبية. على الرغم من هذه المزايا والتقنيات ثقب النانو الحالة الصلبة تعاني من عدة عيوب العملية التي تحد من فائدتها للدراسات الجزيئية البيولوجية. في حين السيطرة على حجم ثقب النانو هو ممكن، وأنها مكلفة عادة وشاقة لتحقيق، وتتطلب معدات متخصصة والموظفين المهرة. على سبيل المثال، حفر ثقوب النانو التي كتبها تركز أيون شعاع وقد ثبت مؤخرا أن يتقلص تحت ظروف تجريبية محددة في المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) 5. في المناهج الأخرى، ويمكن حفر ثقوب النانو عن طريق المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) توسيع أو تقليص تبعا للظروف شعاع والتعرض للمذيبات اللاحقة مائي 8. في هذه الحالات، ومجموعة للتحقيق من أحجام ثقب النانو محدودة، من الصعب السيطرة عليها، وحتى لا يمكن الاعتماد عليها كما حجم النانو يمكن أن تتغير بعد العلاج الكيميائي أوعندما مغمورة في البيئة السائلة خاصة 9.
التيار الأيونية من خلال ثقوب النانو الحالة الصلبة يمكن أيضا يعانون من الضوضاء العالية، مصادر التي تشكل موضوع التحقيق بشكل مكثف في ثقب النانو الأدب 2،3،10،11. في حين تم اقتراح أساليب مختلفة للحد من الضوضاء الكهربائية، العائد من موثوقة ومستقرة ثقوب النانو منخفضة الضوضاء منخفض عادة. ترسب بقايا كربونية أثناء الحفر والتصوير يمكن أن يكون لها آثار ضارة على جودة الإشارة الكهربائية، وغالبا ما يجعل التبول كاملة تحديا والتسبب في تشكيل nanobubbles التي يمكن أن يكون من الصعب إزالة 12. علاوة على ذلك، انسداد ثقب النانو جزيئات الحليلة يحط تقديم جودة الإشارة المسام غير صالحة للاستعمال لمزيد من التجربة 13،14. تماما، وهذه الآثار الحد بشكل كبير من العائد من أجهزة النانو وظيفية وزيادة التكلفة المرتبطة بالبحوث ثقب النانو الحالة الصلبة.
والتطبيقاتنشوئها من الجهد مع أقطاب حج / أجكل لإنتاج الحقول الكهربائية عالية في حدود 0،15 حتي 0،3 الخامس / نانومتر يقدم حلا بسيطا من المستغرب لهذه التحديات. وينتج من خلال تطبيق دوري من نبضات الجهد قصيرة، نظيفة، وانخفاض الضوضاء مثالية سطح ثقب النانو للدراسات جزيء واحد. التعرض لفترات طويلة لمجالات كهربائية عالية يبدأ إزالة المواد التي تشكل غشاء جدار المسام، مما أدى إلى زيادة في القطر ثقب النانو. هذا النمو يمكن التحكم بدقة عن طريق ضبط قوة النبض ومدتها. كما اثار الحالي تتحلل على مدى التجربة بسبب انسداد ثقب النانو كما كثف الجزيئات على سطح ثقب النانو، ويمكن تكرار هذه العملية لاسترداد أجهزة انسداد التي من شأنها أن خلاف ذلك تم التخلص منها. على هذا النحو، هو زيادة العائد من ثقوب النانو وظيفية مزيدا من القدرة على استخدام نفس الجهاز عدة مرات. وهذه الطريقة توفر العديد من المزايا كما يتم تنفيذ ذلك بسرعة في السائل تحت التجريبيةالظروف، يتطلب معدات المختبرات القياسية فقط، يمكن أن يكون آليا مع البرمجيات، وتنتج ثقوب النانو وظيفية عالية الجودة مع تحقيق عائد أكثر من 95٪.
البروتوكول
1. تصنيع النانو وتنظيف
ملاحظة: بمجرد وجود ثقب النانو في غشاء العزل، ويمكن تركيبها مباشرة في الخلية السائلة دون مزيد من المعالجة أو التنظيف، كما هو موضح في الخطوة 2. ومع ذلك، إذا كان ذلك ضروريا لإزالة آثار الملوثات بين التجارب، ورقائق النانو يمكن تنظيفها باستخدام إما سمكة البيرانا حل 3،15،16 (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2) أو عن طريق التعرض للأكسجين البلازما 2. على هذا النحو، الخطوات 1،2-1،9 في البروتوكول التالي اختيارية إذا الخشنة تنقية عن التعرض لحل سمكة البيرانا ليست ضرورية.
- ديغا تصفيتها منزوع الأيونات (DI) الماء عن طريق وضع تحت فراغ في sonicator لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
- إعداد الحل البيرانا في دورق 10 مل بإضافة بعناية 3 مل حمض الكبريتيك تليها 1 مل بيروكسيد الهيدروجين. مزيج دقيق من قبل التكثيف الراجع في ماصة. تحذير: حل سمكة البيرانا الخطرة للغاية. يرجى تا كه جميع الاحتياطات.
- باستخدام الملقط مقاومة للحامض، وإدراج بعناية رقاقة غشاء المحتوية على الحافة ثقب النانو لأول مرة في حل سمكة البيرانا ليغرق تماما في رقاقة وتجنب ذلك تطفو على السطح.
- شطف جيدا في الماء ملاقط تصفيتها.
- ضع الكأس على الساخن لوحة مسبقا إلى 90 درجة مئوية واتركه لتنظيف لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- إزالة بعناية الحل البيرانا من الدورق باستخدام ماصة زجاجية نظيفة وتجاهل في كميات وفيرة من المياه.
- باستخدام ماصة زجاجية نظيفة إضافة 5 مل من الماء منزوع الأيونات degassed من الخطوة 1.1 في الدورق لشطف. إزالة المياه وتكرار على الأقل 5X.
- إزالة بعناية رقاقة ثقب النانو من الدورق باستخدام الملقط حادة نظيفة طرف. التعامل مع الحذر الشديد كما غشاء النانو هي هشة للغاية.
- تجفيف رقاقة من خلال تطبيق بلطف الشفط لحافته باستخدام الشافطة. تخزين رقاقة في طبق بتري نظيفة حتى جاهزة للاستخدام.
- تنظيف ثقب النانو خلية تفلون (الشكل 1) عن طريق وضع في 20٪ من محلول حمض النيتريك والمغلي لمدة 10 دقائق. تنبيه: استخدم جميع معدات الوقاية الشخصية اللازمة والتعامل مع الأحماض مع الرعاية.
- إزالة بعناية الخلية من حامض النيتريك وضعها في الماء المغلي لمدة 10 دقيقة DI.
- تغلي الخلية في الماء DI لمدة 10 دقيقة إضافية لضمان إزالة كاملة من حمض النتريك. إزالة كوب من طبق ساخن واتركه ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الخلية من الكأس وضربة الجافة مع الهواء تصفيتها أو N 2. تخزين الخلية في طبق بتري نظيفة.
- ديغا تصفيتها بوكل حل (مخزنة مع HEPES في درجة الحموضة 8) عن طريق وضع تحت فراغ في sonicator لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
- نظيفة اثنين جوانات سيليكون المطاط الصناعي لكل رقاقة ثقب النانو من قبل sonicating في الإيثانول لمدة 10 دقيقة على الأقل.
- وضع رقاقة ثقب النانو على نظيفة المطاط الصناعي طوقا يجري يتنبهل لمحاذاة النافذة الغشاء مع افتتاح حشية. وضع ومواءمة طوقا الثانية فوق الرقائق.
- وضع رقاقة وحشيات على مدخل الخزان من نصف الخلية ثقب النانو تنظيفها. تجميع الخلية عن طريق الشد والنصف الآخر في المكان. يتم عرض وجهة نظر انفجرت من مكونات الخلية ثقب النانو في الشكل 1.
- الرطب رقاقة ثقب النانو من قبل pipetting الإيثانول في خزانات الخلية ووضع في فراغ الغرفة حتى وينظر عدد قليل من الفقاعات للخروج من مداخل.
- إزالة الإيثانول عن طريق التنظيف الخزانات مع 3 مل على الأقل degassed تصفيتها حل بوكل. الحرص على إزالة الفائض باستخدام الشافطة.
3. ثقب النانو توصيف
- وضع الخلية ثقب النانو في الإعداد التجريبية محمية كهربائيا ووضع الأقطاب حج / أجكل في كل خزان. هذا الإعداد هو مماثلة لتلك التي تظهر في الشكل 2 مع استثناء من امدادات الطاقة الخارجية ومكبر للصوت الحالي والتي هياستبدال منخفضة الضوضاء ردود فعل مقاوم مكبر للصوت.
- باستخدام مكبر للصوت منخفض الضوضاء في وضع الجهد المشبك، وتطبيق الإمكانيات التي تجتاح من -200 إلى +200 بالسيارات بالسيارات وتسجيل الخصائص الرابع.
- تناسب المنحنى الرابع للحصول على تصرف ثقب النانو، والتي يمكن استخدامها لحساب قطر في حل 17. إذا كان القطر المحسوب هو أصغر بكثير مما كان متوقعا من تيم التصوير، هو المسام من المحتمل أن لا المبللة تماما و / أو يحتوي على الحطام أو التلوث.
- تطبيق بالسيارات المحتملة عبر ثقب النانو 200 وتسجيل الأيونية الحالية لمدة 30 ثانية.
- إجراء كثافة الطاقة الطيفية (PSD) تحليل التيار الأيونية ودمج لقياس خصائص التشويش الكهربائي من ثقب النانو. إذا كان الضجيج هو فوق 15 RMS السلطة الفلسطينية في 5 كيلو هرتز عرض النطاق الترددي، ثم هو المسام من المحتمل أن لا المبللة تماما و / أو يحتوي على التلوث والتي لا يمكن استخدامها بشكل صحيح في التجربة.
4. تكييف ثقوب النانو عن طريق التعبير عن عدم الرضا السامي الكهربائيةلدس
ملاحظة: إذا كان منحنى الرابع ولدت التماثل المعروضة أو أقل من المتوقع تصرف، أو أظهرت التتبع الحالي مستويات الضوضاء العالية وعدم الاستقرار في الترددات المنخفضة، فمن الضروري إلى حالة من ثقب النانو مع المجالات الكهربائية عالية لإزالة أي تلوث على المسام السطح و / أو الرطب المسام. في حين أن هذا الأسلوب لا يؤثر على الضوضاء عالية التردد الناجمة عن السعة غشاء أو أي جانب السعة الطفيلية إلى مدخلات من مكبر للصوت الحالية المستخدمة في القياسات، ضوضاء منخفضة التردد (وتسمى أيضا الضوضاء 1 / و) 18 يمكن تقلص إلى حد كبير. ويرد التخطيطي من الإعداد المستخدم لتنفيذ هذا تكييف في الشكل 2.
- فصل أقطاب من مكبر للصوت التصحيح، المشبك.
- ربط واحدة من الأقطاب الكهربائية إلى الكمبيوتر التي تسيطر عليها امدادات الطاقة قادرة على توليد> 6 V (> 0.2 V / نانومتر شدة المجال الكهربائي لأغشية سميكة 30 نانومتر المستخدمة هنا) والآخر إلى البريدxternal مكبر للصوت الحالية التي يمكن رصدها في الوقت الحقيقي.
ملاحظة: التطبيق من المجالات الكهربائية عالية يمكن استخدامها لشرط ثقوب النانو في مختلف المواد وسمك الغشاء. بينما ناقش كل من 30 نانومتر و 10 نانومتر الأغشية هنا، الفولتية وصفها الرجوع إلى تلك المستخدمة لمدة 30 نانومتر أغشية سميكة، ما لم ينص على خلاف ذلك.
- تطبيق فرق الجهد من 400 فولت (قياس الجهد) عبر ثقب النانو لا يقل عن 5 ثانية.
- حساب القيمة الحالية يعني من المباراة النهائية 1 ثانية من البيانات لتحديد تصرف من ثقب النانو. حساب قطر ثقب النانو على أساس هذا تصرف، والتي ينبغي أن يتم تلقائيا باستخدام برنامج ونموذج تصرف ثقب النانو الاختيار على أساس الهندسة الأرجح. يجب أن تتوافق مع قطر يقاس من المنحنى الرابع.
- تطبيق 200 ميللي ثانية النبض من 6 V (ترطيب الجهد) عبر ثقب النانو لإنتاج الحقل الكهربائي من 0.2 V / نانومتر تليها فترة القياس 5 ثانيةفي 400 بالسيارات. مرة أخرى، وحساب قطر من ثقب النانو باستخدام النهائية 1 ثانية من البيانات ومقارنتها مع القيمة المتوقعة من القياسات تيم للتأكد من أن ثقب النانو هو الرطب بالكامل. إذا لزم الأمر، كرر عدة مرات.
- إذا لزم الأمر، كرر تطبيق نبضات حقل كهربائي عال مع زيادة الجهد حتى إشارة الحالي خلال فترة القياس مستقرة وتبين تصرف متوقع. فمن غير المستحسن أن يتجاوز 10 V (أي> 0.3 V / نانومتر)، وهذا يمكن أن تكبر إلى حد كبير أو تلف ثقب النانو بسرعة.
5. توسيع ثقوب النانو باستخدام المجالات الكهربائية عالية
ملاحظة: القطر من ثقب النانو أمر حاسم في تحديد وظائفه لتطبيق معين الاستشعار الجزيئية البيولوجية. تحقيقا لهذه الغاية، وخلق ثقب النانو باستخدام يمكن توسيعها لTEM إلى الحجم المطلوب عن طريق تطبيق حقول كهربائية عالية حتى يتحقق القطر المناسبة مع نفس الإعداد تستخدم لتنظيف والرطبثقب النانو (الشكل 2).
- باستخدام التكوين الإلكترونية نفسها كما في الجزء 4، وتطبيق 200-500 بالسيارات التحيز عبر المسام للحصول على قياس القطر. في حين أن أقل دقة من المناسب منحنى الرابع، وهو قياس نقطة واحدة يمكن استخدامها لتقدير تقريبا حجم ثقب النانو بسرعة.
- تطبيق نبضة 2 ثانية من 8 V عبر ثقب النانو تليها فترة قياس لا يقل عن 5 ثانية في 400 بالسيارات. سوف حساب قطر الجديدة عادة ما تظهر زيادة صغيرة جدا في حجم النانو (<0.1 نانومتر).
- كرر هذه العملية دوريا بالتناوب بين التوسيع وقياس الفولتية الحصول عليها في الموقع والقياسات في الوقت الحقيقي من زيادة قطر ثقب النانو.
- إذا أسرع معدل نمو غير مرغوب فيه، وزيادة حجم الجهد تطبيقها تدريجيا تصل إلى 10 V. النمو سوف يتسارع وعادة ما يوسع المسام مع معدل الزيادة في تصرف تتراوح بين 0.03 م / ث EC & #160؛ إلى 10 نانوثانية / ثانية، اعتمادا على حجم ثقب النانو، قوة الحقل الكهربائي وخصائص حل بالكهرباء.
- عندما يتم التوصل إلى القطر المطلوب، ووقف تطبيق مجالات كهربائية عالية. ويمكن القيام بذلك تلقائيا باستخدام برنامج كمبيوتر.
- إعادة توصيل مكبر للصوت التصحيح، المشبك إلى الأقطاب.
- رابعا اكتساب جديدة وبيانات التتبع الحالي في 200 بالسيارات لتأكيد القطر من ثقب النانو والتحقق من الإشارات الحالية منخفضة الضوضاء كما في الخطوات 3،2-3،5 أعلاه. إذا لزم الأمر، كرر تكييف وتوسيع بروتوكول (الخطوات 4،1-5،5).
6. الحمض النووي إزفاء
- قبل إضافة عينة الجزيئية البيولوجية، تنفيذ تجربة الرقابة لضمان عدم وجود أي تلوث في الخزان. الحصول على التتبع الحالية تحت إمكانات تطبيقها من 150-300 بالسيارات في غياب أي عينة للتحقق من عدم وجود الحصار الحالي يتم الكشف عنها بعد 2 دقيقة.
- إضافة الحمض النووي λ (48.5 KBP الذين تقطعت بهم السبل المزدوج) إلى <م> خزان رابطة الدول المستقلة لتركيز النهائي من 0.5-2 نانوغرام / ميكرولتر. ارتداد بلطف ماصة لمدة 10 ثانية على الأقل لضمان توزيع متجانس من العينة في جميع أنحاء الخزان.
- ل30 نانومتر ثقب النانو سميكة، وتطبيق التحيز المحتمل من 150-300 بالسيارات إلى الخزان عبر وقياس الحالية الأيونية التي تمر عبر ثقب النانو. للأحداث إزفاء قصيرة جدا، فمن المستحسن أن يجرب في ذات تردد عال (250 كيلو هرتز أو أكبر) مع تمرير منخفض التردد تصفية عالية نسبيا (100 كيلو هرتز).
- رصد التيار الأيونية باستخدام برنامج للكشف عن الحصار الحالي عابرة كما نقل من جزيئات من خلال ثقب النانو. ويمكن تحليل آثار الحالية الأيونية من إزفاء الجزيئية لتحديد عمق انسداد ومدة ووتيرة لاستنتاج المعلومات حول عينة من الفائدة. على العكس، إذا كانت المعلومات عن الجزيئات translocating هو معروف، هذه البيانات يمكن استخدامها لتحقيق خصائص النانو نفسها.
النتائج
تم حفر ثقوب النانو المستخدمة في هذه الدراسة في 30 نانومتر أو 10 نانومتر النوافذ غشاء نيتريد السيليكون سميكة. في حين أن البروتوكول وصف يمكن تطبيقها على ثقوب النانو الحالة الصلبة من المواد المختلفة ملفقة باستخدام أي وسيلة، يتم حفر أنهم عادة من قبل تيم باستخدام بروتوكولات المحددة سابقا 11،14. ثقوب النانو حفر من قبل تيم وعادة ما تكون بين 4-8 نانومتر في القطر (الشكل 2). في حين أن كلا 30 نانومتر و 10 نانومتر أغشية سميكة يمكن تركيبه ومكيفة باستخدام بروتوكول أعلاه، التحيز الجهد وصفها تشير تلك المطلوبة لأغشية سميكة 30 نانومتر، ما لم ينص على خلاف ذلك. لأغشية مختلفة الحجم، ينبغي تعديل الجهد تطبيقها لتوليد حقل كهربائي في حدود 0،15 حتي 0،3 الخامس / نانومتر داخل ثقب النانو.
ويبين الشكل 3A اثنين من آثار تصرف نموذجي من ثقب النانو 10 نانومتر في غشاء سميك 30 نانومتر قبل وبعد العلاج مع المجالات الكهربائية عالية. على شن د حديثاrilled ثقب النانو، واحتمال الحصول على إشارة الحالية الأيونية غير مستقرة وصاخبة، واظهار درجة عالية من التردد المنخفض التقلبات، هي عادة ما تكون مرتفعة. والنانو هو مبين في الشكل 3A يبرز هذا السلوك. تصرف منه هو أقل بكثير مما كان متوقعا لثقب النانو من حجمها، على الأرجح بسبب التبول غير مكتملة. بناء على طلب من المجالات الكهربائية عالية من 0.27 V / نانومتر في حجم إنتاجها بنسبة 8 V البقول (90 نبضات من 2 مدة ثانية)، يصبح ثقب النانو رطبة تماما ويتم تكبير في وقت لاحق إلى 21 نانومتر في القطر. عند هذه النقطة، والمسام يسلك تصرف مستقرة مع خصائص منخفضة الضوضاء. ويظهر التحليل الكمي للضوضاء في ثقوب النانو مماثلة لكثافة الطاقة الطيفية المؤامرات في الشكل 3B. الضوضاء السعة التردد المنخفض من المسام unwet و / أو انسداد عالية جدا (> 20 السلطة الفلسطينية RMS)، مما يجعلها غير صالحة للاستعمال في التجربة. على تكييف مع الحقول الكهربائية عالية، قوة الضوضاء في الترددات المنخفضة (<10 كيلو هرتز) هو diminis[هد] بنسبة تصل إلى 3 أوامر من حجم وجاهزة للتجارب منخفضة الضوضاء.
ويبين الشكل 4a قياس الحالي نموذجي كما هو نابض إمكانية تطبيقها بين الحقول الكهربائية عالية لتوسيع وفترات انخفاض قياس الحقل الكهربائي. بعد كل نبضة لاحقة، والحالية الناتجة الأيونية من خلال ثقب النانو في الجهد قياس (أي تصرف ثقب النانو) يزيد بمقدار محدود. هذا يدل على أن ثقب النانو هو زيادة في حجم، وقطر د يمكن الاستدلال على ذلك من تصرف في G في حل من الموصلية σ، تقارب ثقب النانو بأنها أسطواني هندسة فعالة ل طول ممثل المؤسسة. بينما توجد نماذج أخرى مختلفة لربط ثقب النانو تصرف لهندسته 17،19-21، وقد ثبت العلاقة التالية، الذي يشتمل على المدى هندسية ومصطلح المقاومة الوصول إليها، صالحة لثقوب النانو تيم حفر في الملح عاليةتركيزات، على مجموعة واسعة من أقطار التي تهم dsDNA وإزفاء 17،22.
مرة واحدة يتم الوصول إلى القطر المطلوب، يتم إيقاف عملية تلقائيا من قبل البرنامج. ويمكن بعد ذلك أكدت قطر ثقب النانو الناتجة باستخدام قياسات دقيقة الرابع، كما هو مبين في الشكل 4B.
من المهم أن نلاحظ أن ثقوب النانو المعالجة باستخدام المجالات الكهربائية عالية وظيفية بالكامل. يتم التحقق من صحة ذلك من خلال الكشف عن الحمض النووي λ إزفاء، كما هو مبين في آثار تصرف المعروضة في الشكل 5A. في هذا الشكل، والدافع من خلال اثنين من ثقوب النانو dsDNA والتي تم توسيعها إلى 11 نانومتر و 32 نانومتر باستخدام الطريقة الموصوفة. في كل حالة، والأساس تصرف غير مستقر للغاية ويلاحظ الحصار واضحة جزيئات dsDNA ونقل من خلال ثقب النانو، وعرض عالية إشارة إلىالضوضاء واحدة جزيء الأحداث إزفاء بالمقارنة مع المسام غير المعالجة التي تظهر ضوضاء عالية. كما هو مبين في الشكل 5A من إدراجات، ويلاحظ متعددة المستويات انسداد منفصلة كما نقل من الجزيئات الفردية مطوية، كما هو متوقع لثقوب النانو من هذه الأحجام. يتم عرض رسوم بيانية للتصرف ثقب النانو خلال الأحداث إزفاء من خلال كل المسام في الشكل 5B. خصائص منخفضة الضوضاء من ثقوب النانو تكشف متميزة، قمم للحل بسهولة المقابلة لخط الأساس (أي DNA)، واحد (واحد حبلا الحمض النووي - كشف) والدول مزدوجة انسداد (اثنين من جدائل الحمض النووي - مطوية). من المذكرة هو حقيقة أن التغيير في تصرف المقابلة لجزيء واحد dsDNA وتحتل المسام هو مختلفة لثقوب النانو الكبيرة والصغيرة. هذا يقدم دليلا غير مباشر على أن تطبيق المجالات الكهربائية عالية هو في الواقع توسيع ثقوب النانو القائمة، ونفس السعة انسداد سيكون لاحظ إذا كان يجري إنشاؤه المسام أو الشقوق الأخرى في رانه غشاء أثناء عملية 17.
وبالمثل، يوضح الشكل (6) فعالية المجالات الكهربائية عالية لتوسيع ثقوب النانو ملفقة في الأغشية من سماكة مختلفة. هنا، وثقب النانو التي تم إنشاؤها في SiNx غشاء 10 نانومتر في البداية unwet جزئيا، وعرض تصرف غير مستقرة والصغيرة نسبيا. بناء على طلب من بالتناوب ± 3 V (± 0.3 V / نانومتر) نبضات من 4 مدة ثانية (30 مجموع)، يصبح ثقب النانو الرطب ويسلك خصائص الرابع مثالية لالمسام 3 نانومتر. ثم كرر منهجية ل400 البقول واللاحقة تم توسيع ثقب النانو إلى 8 نانومتر. هذا التوسيع، أجريت في المجالات الكهربائية مماثلة ولكن التحيز الجهد أقل التطبيقية من لثقوب النانو ملفقة في الأغشية 30 نانومتر، وتبين أن هذه العملية هو الحقل الكهربائي في المقام الأول مدفوعة. كما الحصار الحالية التي تنتجها إزفاء عبر غشاء أرق أكبر من التي أنتجت في سمكا المسام، وثقوب النانو في أغشية رقيقةيعامل بهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لدراسة الجزيئات أقصر مثل البروتينات مع زيادة الحساسية.
الشكل 1. التجمع خلية ثقب النانو. يتم وضع السيليكون نيتريد غشاء تحتوي على ثقب النانو بين جوانات المطاط الصناعي السيليكون، والتي هي بدورها مضغوط من قبل اثنين من تفلون نصف الخلايا التي تحتوي على خزانات بالكهرباء. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. تكييف ثقب النانو وتوسيع الإعداد. A ثقب النانو في حفر 30 نانومتر نيتريد السيليكون سميكة غشاء (يسار) يربط بين اثنين من الخزانات بالكهرباء. Aيستخدم الكمبيوتر للتحكم إما مكبر للصوت التصحيح، المشبك أو إمدادات الطاقة الخارجية (بطاقة دق) والذي ينطبق على التحيز المحتمل عبر ثقب النانو عبر الأقطاب حج / أجكل منغمسين في الخزانات بالكهرباء. مكبر للصوت الحالي التبديلات التيار الأيونية قياس يتم رصدها في الوقت الحقيقي باستخدام برامج الكمبيوتر. تم تعديل هذا الرقم من [11]. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. آثار الحالية قبل وبعد تطبيق مجالات كهربائية عالية. (أ) عند تصاعد مستمر، وحتى بعد التنظيف بمحلول البيرانا، وتصرف من ثقب النانو غير مستقرة وأقل من المتوقع لأسطواني المسام 10 نانومتر (الأزرق). بعد تطبيق البقول 2 ثانية من 8 V، ووالمبللة ثقب النانو بالكامل والموسع، واظهار تصرف مستقرة، ويمكن استخدامها لاجراء تجارب الاستشعار الجزيئية البيولوجية (الخضراء). (ب) قطع الكثافة الطيفية الطاقة من ثقب النانو المبللة بشكل غير كامل وانسداد (الأزرق والبرتقالي، على التوالي). بناء على طلب من 200 ميللي ثانية البقول من 8 V، وترطب لثقوب النانو وإزالة الحطام (الأخضر والأحمر، على التوالي). تم تعديل هذا الرقم من [11]. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 4. ثقب النانو توسيع باستخدام المجالات الكهربائية عالية. (أ) بالتناوب بين التوسيع وقياس التحيزات المحتملة (الأحمر) يكشف عن أن التيار الأيونية من خلال ثقب النانو (الازرق) يزيد في خطوات محدودة. السلوك الناتجقياس تعصب يمكن استخدامها لاستنتاج قطر ثقب النانو. مرة واحدة وقد حققت قطر المطلوب، يتم إيقاف العملية. (ب) تأكيد قياسات دقيقة الرابع من تصرف أن أحجام ثقب النانو قد زادت. توفر هذه المؤامرات تقدير أفضل للحجم المسام من القيم الحالية نقطة واحدة لأنها يمكن أن يكون لائقا ويمكن التأكد من سلوكهم متماثل وأومية. تم تعديل هذا الرقم من [11]. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 5. إزفاء الحمض النووي من خلال ثقوب النانو مكيفة. (أ) إضافة dsDNA و(48.5 KBP) إلى جانب واحد من ثقب النانو في وجود تحيز من 150 بالسيارات تنتج الحصار عابرة في آثار تصرف من 11 نانومتر (الأزرق) و 32 نانومتر البرتغالوفاق (الحمراء). (ب) المدرج الإحصائي للتصرف كل من ثقوب النانو تظهر قمم منفصلة المقابلة لخط الأساس، واحد والأحداث إزفاء مزدوجة. تم تعديل هذا الرقم من [11]. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 6. توسيع ثقوب النانو في الأغشية 10 نانومتر. A ثقب النانو في غشاء 10 نانومتر أصلا المعروضات القليل جدا من تصرف وخصائص الرابع غير المتماثلة (برتقالي). بناء على طلب من 30 من البقول بالتناوب بين ± 3 V (4 مدة ثانية)، ويبلل ثقب النانو ويسلك خصائص الرابع مثالية مع تصرف بما يتفق مع ذلك يتوقع لالمسام 3 نانومتر (الأزرق). A 400 البقول مزيد من ± 3 V يوسع ثقب النانو ليبلغ قطرها 8 نانومتر(الأخضر). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
المناقشة
السيطرة على حجم ثقب النانو هي ذات أهمية أساسية في تطبيقات الاستشعار الجزيئية البيولوجية. يجب أن يكون أقطار ثقب النانو بناء على أمر من حجم الجزيئات التي يجرى التحقيق فيها، بل يجب أن تكون كبيرة بما يكفي لاستيعاب العينة ولكن صغيرة بما يكفي لتحقيق الضوضاء إشارة إلى المستوى الأمثل. في حين أن السيطرة على حجم باستخدام طريقة عرض تطبيق المجالات الكهربائية عالية في اتجاه واحد في تلك الأقطار ثقب النانو هي زيادة فقط في جميع أنحاء هذه العملية، يمكن ثقوب النانو بأقطار بين 3-100 نانومتر يكون الطراز، مع الدقة subnanometer. كما 3-4 المسام نانومتر يمكن أن تكون ملفقة بسهولة باستخدام TEM 23، وهذا يسمح لتصنيع موثوقة من ثقوب النانو الحالة الصلبة لمجموعة واسعة من التطبيقات من التحقيق هيكل ssDNA للتفاعل المجمعات البروتين يجند ضخمة. في حين أن النمو ثقب النانو فوق 100 نانومتر يمكن أن تكون سريعة جدا وأقل دقة، وظروف توسيع أكثر اعتدالا يمكن توظيفها لتحقيق سيطرة أفضل على العملية. كما قاوك، أهم خطوة لتحقيق التحكم في حجم فعالة هو اختيار قوة النبض ومدتها من أجل تحقيق التوازن الكفاءة تضخيم ومستوى الدقة المطلوبة في تحقيق قطر المسام المطلوب. ويزيد من إبراز ذلك من خلال توسيع ثقوب النانو أرق (سمك 10 نانومتر)، حيث لوحظ تضخم تحيز أقل ولكن مقارنة قوة الحقل الكهربائي. اعتمادا على الحجم النهائي، فمن الممكن عموما لتكبير ثقب النانو لأقطار شبه 100 نانومتر في بضع دقائق.
وبالمثل، التقلبات الحالية التردد المنخفض كبيرة تحول دون دراسات جزيء واحد لأنه يكاد يكون من المستحيل تمييز إشارات إزفاء من الضوضاء في الخلفية. التبول غير مكتملة 24، وجود بقايا كربونية المتبقية بعد التصنيع الأولي 25 و الامتزاز من الحطام على الجدار ثقب النانو 13 يمكن أن تتحلل جودة الإشارة، الأمر الذي يتطلب تنظيف إضافية مع العلاجات الكيميائية القاسية التي غالبا ما تكون طnefficacious. ومن المثير للاهتمام، فإنه من الشائع للبروتوكولات ثقب النانو الحالة الصلبة إلى التأكيد على أهمية تنظيف ثقب النانو في حل سمكة البيرانا أو البلازما مع الأكسجين قبل التركيب لمساعدة ترطيب أو إزالة أي تلوث من مخلفات عمليات الحفر والتصوير والتعامل معها. حتى مع هذا العلاج، ولكن في كثير من الأحيان لا ثقوب النانو الرطب أو مواصلة إبداء ضوضاء عالية، والحل المقترح لمحاولات فاشلة هو إجراء التنظيف الإضافية التي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا جدا 14. مع تطبيق مجالات كهربائية عالية، قد لا تكون هذه البروتوكولات مطولة اللازمة اعتمادا على التطبيق. تبين أن معظم الأجهزة يمكن مجددة في الموقع باستخدام الطريقة الموصوفة في هذه الوثيقة، وبالتالي تقليل الوقت اللازم لإعداد والحاجة للتعامل مع المواد الكيميائية القاسية. أهم الخطوات في تخفيف الضجيج الكهربائي هو زيادة بسيطة في الجهد و / أو مدة النبضة الرطب تماما المسام وإزالة الأنقاض ملزمة فضفاضة.يمكن موثوق ثقوب النانو يعامل بهذه الطريقة يمكن استخدامها في التجارب إزفاء جزيء حيوي، مثل مرور الحمض النووي والبروتينات. إذا كانت هذه الجزيئات التمسك جدار المسام مما يؤدي إلى إشارة كهربائية انسداد وصاخبة، والبقول الحقل الكهربائي عالية يمكن إعادة استخدامها لإزالة انسداد واستعادة خصائص منخفضة الضوضاء لمزيد من التجريب، دون إزالة تجهيز للرقاقة ثقب النانو من الخلية فلويديك.
تطبيق مجالات كهربائية عالية باستخدام الإعداد وصفها محدودة بسبب اشتراط وجود امدادات الطاقة الخارجية التي يمكن أن تنطبق تصل إلى 10 V ومكبر للصوت الحالي، والتي تفتقر إلى الحساسية وخصائص منخفضة الضوضاء في النطاق الترددي العالي (> 1 كيلو هرتز) ل الاستشعار عن جزيء واحد. بينما التجارب الجزيئية البيولوجية نموذجية تعتمد على مكبر للصوت الضوضاء المنخفضة الحالية التي تقتصر على ± 1 V، فإنه واضح ومباشر لتصميم نظام واحد يمكن أن تنجز على حد سواء الكهربائية عالية تكييف الميدان والقياس الحالي الحساسة مع adjuمكاسب مستقرة. على الرغم من هذا القيد، والانتقال من الإعداد واحدة إلى أخرى سريعة ومباشرة. بالمقارنة مع التقنيات الحالية للسيطرة على حجم ثقب النانو مثل استخدام SEM 5، الأكسدة الحرارية والأغشية إعادة تشكيل 8، المجالات الكهربائية عالية توفر منهجية أسرع وأكثر دقة وأقل تكلفة التي يمكن القيام بها على مقاعد البدلاء المختبر باستخدام المعدات القياسية وتوفير مجموعة واسعة من الأحجام ثقب النانو. القدرة بسرعة وبتكاثر للحد من الضوضاء التردد المنخفض أيضا يجعل تصنيع الأولي أكثر موثوقية ويطيل عمر ثقوب النانو الحالة الصلبة، كما المسام المستخدمة سابقا يمكن شبابها لمزيد من التجارب. تماما، أكثر من 95٪ من ثقوب النانو من سمك متفاوتة مكيفة مع المجالات الكهربائية عالية أظهرت القليل جدا مميزة ضوضاء منخفضة التردد، مما يجعلها مناسبة لجزيء حيوي الاستشعار عن بعد. تلفيق وبالتالي أسهل وأكثر موثوقية، مما يجعل التجارب ثقب النانو الحالة الصلبة أكثر accessiبلي للباحثين وربما السماح للمسار نحو تسويق التكنولوجيات ثقب النانو من خلال عمليات تصنيع أكثر قوة.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نحن نعترف الدعم من جانب العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا، والمؤسسة الكندية للإبداع، وصندوق البحوث أونتاريو. نشكر Y. ليو للحصول على مساعدات في تصنيع النانو وتوصيف، L. Andrzejewski للمناقشات قيمة والدعم التقني، وA. Marziali للمساعدة مع برنامج النانو وتصميم الأجهزة.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| يتطلب الحفر JEM-2100F TEM | JEOL | جهد متسارع 200 كيلو | |
| فولت مضخم صوت أكسون أكسوباتش 200B مكبر للصوت | الجزيئية | الجهد المنخفض الضوضاء ومكبر للصوت الحالي | |
| بطاقة الحصول على البيانات من السلسلة X | الأدوات الوطنية | PCI-6351 | الواجهة مع الإعداد ، وتطبيق المجالات الكهربائية العالية |
| LabVIEW 2012 البرمجيات | الأدوات الوطنية | تطبيق الفولتية ، وتسجيل التيار ، وتحليل البيانات | |
| ، مكبر الصوت الحالي | ، تضخيم التيار Keithley | أثناء نبضات المجال الكهربائي العالي ، | |
| غشاء نيتريد السيليكون بسمك 30 نانومتر ، نوافذ | غشاء Norcada Inc. | NT005X | الركيزة التي يتم فيها إنشاء المسام النانوية |
| السيليكون بسمك 10 نانومتر نوافذ غشاء | TEM Norcada Inc. | NT005Z | الركيزة التي يتم فيها إنشاء المسام النانوية |
| حلقات مطاط أسطوانة السيليكون | ماريان شيكاغو | HT6135 | مثقوبة لختم أقطاب رقاقة المسام النانوية |
| Ag / AgCl | في الجسم الحي متري | E255 | |
| حمض النيتريك | فيشر Scientific | 52004P | يستخدم لتنظيف الخلايا - تعامل بحذر |
| بيروكسيد الهيدروجين | فيشر Scientific | H323 | تستخدم لمحلول سمكة الضاري المفترسة - تعامل بحذر |
| حمض الكبريتيك | فيشر Scientific | A300 | المستخدمة في محلول سمكة الضاري المفترسة - تعامل بحذر |
| كلوريد البوتاسيوم | فيشر Scientific | P335 | |
| HEPES | فيشر Scientific | BP310 | التخزين المؤقت محلول KCl |
| قفص | خلية المسام النانوية التدريع ، الأقطاب | ||
| الكهربائيةقفص فاراداي الثانوي | التدريع ، أسلاك القطب الكهربائي | ||
المراجع
- Venkatesan, B. M., Bashir, R. Nanopore sensors for nucleic acid analysis. Nat. Nanotechnol. 6 (10), 615-624 (2011).
- Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Dekker, N. H., Dekker, C. Noise in Solid-State Nanopores. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (2), 417-421 (2008).
- Tabard-Cossa, V., Trivedi, D., Wiggin, M., Jetha, N. N., Marziali, A. Noise analysis and reduction in solid-state nanopores. Nanotechnology. 18, 4484-4418 (2007).
- Wu, M. -Y., et al. Control of Shape and Material Composition of Solid-State Nanopores. Nano Lett. 9 (1), 479-484 (2009).
- Prabhu, A. S., Freedman, K. J., Robertson, J. W. F., Nikolov, Z., Kasianowicz, J. J., Kim, M. J. SEM-induced shrinking of solid-state nanopores for single molecule detection. Nanotechnology. 22, 425302(2011).
- Li, J., Stein, D., McMullan, C., Branton, D., Aziz, M. J., Golovchenko, J. A. Ion-beam sculpting at nanometre length scales. Nature. 412 (6843), 166-169 (2001).
- Rosenstein, J. K., Wanunu, M., Merchant, C. A., Drndic, M., Shepard, K. L. Integrated nanopore sensing platform with sub-microsecond temporal resolution. Nat. Methods. 9 (5), 487-492 (2012).
- Vanden Hout, M., Hall, A. R., Wu, M. Y., Zandbergen, H. W., Dekker, C., Dekker, N. H. Controlling nanopore size, shape and stability. Nanotechnology. 21, 115304(2010).
- Li, Q., et al. Size evolution and surface characterization of solid-state nanopores in different aqueous solutions. Nanoscale. 4 (5), 1572-1576 (2012).
- Smeets, R., Dekker, N., Dekker, C. Low-frequency noise in solid-state nanopores. Nanotechnology. 20, 095501(2009).
- Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. Precise control of the size and noise of solid-state nanopores using high electric fields. Nanotechnology. 23 (40), 405301(2012).
- Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Wu, M. Y., Dekker, N. H., Dekker, C. Nanobubbles in Solid-State Nanopores. Phys. Rev. Lett. 97 (8), 088101(2006).
- Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. Single-Molecule Observation of Protein Adsorption onto an Inorganic Surface. J. Am. Chem. Soc. 132 (31), 10816-10822 (2010).
- Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores. J. Vis. Exp. (58), e3560(2011).
- Wanunu, M., Meller, A. Single-molecule analysis of nucleic acids and DNA-protein interactions. Single-molecule techniques: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).
- Tabard-Cossa, V. Instrumentation for Low-Noise High-Bandwidth Nanopore Recording. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , 59-93 (2013).
- Kowalczyk, S. W., Grosberg, A. Y., Rabin, Y., Dekker, C. Modeling the conductance and DNA blockade of solid-state nanopores. Nanotechnology. 22 (31), 315101(2011).
- Siwy, Z., Fuliński, A. Origin of 1/fα Noise in Membrane Channel Currents. Phys. Rev. Lett. 89 (15), 158101(2002).
- Liebes, Y., et al. Reconstructing solid state nanopore shape from electrical measurements. Appl. Phys. Lett. 97 (22), 223105(2010).
- Kim, M. J., Wanunu, M., Bell, D. C., Meller, A. Rapid Fabrication of Uniformly Sized Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis. Adv. Mater. 18 (23), 3149-3153 (2006).
- Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Krapf, D., Wu, M. -Y., Dekker, N. H., Salt Dekker, C. Dependence of Ion Transport and DNA Translocation through Solid-State Nanopores. Nano Lett. 6 (1), 89-95 (2006).
- Wanunu, M., Dadosh, T., Ray, V., Jin, J., McReynolds, L., Drndić, M. Rapid electronic detection of probe-specific microRNAs using thin nanopore sensors. Nat. Nanotechnol. 5 (11), 807-814 (2010).
- Dekker, C. Solid-state nanopores. Nat. Nanotechnol. 2 (4), 209-215 (2007).
- Powell, M. R., Cleary, L., Davenport, M., Shea, K. J., Siwy, Z. S. Electric-field-induced wetting and dewetting in single hydrophobic nanopores. Nat. Nanotechnol. 6 (12), 798-802 (2011).
- Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35 (6), 399-409 (2004).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
