Time-lapse microscopie kan de visualisatie van ontwikkelingsprocessen. Groei of drift van monsters tijdens beeldacquisitie vermindert het vermogen om nauwkeurig te volgen en te meten cel bewegingen tijdens de ontwikkeling. We beschrijven het gebruik van open source software voor beeldverwerking om te corrigeren voor driedimensionale sample drift in de tijd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Monster Tijdafwijkingscorrectie Na 4D Confocal time-lapse imaging
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het genereren van vierdimensionale (4D) confocale datasets; bestaande uit 3D-beeld reeksen in de tijd; biedt een uitstekende methode om cellulaire gedrag betrokken zijn bij ontwikkelingsprocessen te vangen. Het vermogen om te volgen en volgt celbewegingen wordt beperkt door monster bewegingen die door drift van het monster of, in sommige gevallen, groei in beeldacquisitie optreden. Tracking cellen in datasets die door drift en / of groei zal deze bewegingen op te nemen in de analyse van de cel positie. Hierdoor kan de schijnbare beweging van statische structuren in het monster. Derhalve vóór cell tracking, moet een monster drift worden gecorrigeerd. Met behulp van de open source Fiji verdeling 1 van ImageJ 2,3 en de opgenomen LOCI hulpmiddelen 4 hebben we de juiste 3D drift plug-in ontwikkeld om foutieve monster verkeer weg in confocale datasets. Dit protocol effectief compenseert proefvertaling of wijzigingen in focale poling door gebruik te maken van fase correlatie met elke keer-punt van een vier-dimensionale confocale datasets registreren met behoud van de mogelijkheid om te visualiseren en meten celbewegingen over langere time-lapse experimenten.
Inleiding
Confocale beeldvorming wordt veel gebruikt in de cel-en ontwikkelingsbiologie naar cel bewegingen en veranderingen in morfologie volgen. Vastleggen van een reeks optische secties verschillende beeldvlakken maakt het genereren van een driedimensionaal (3D) model van een monster, dat vervolgens in vier dimensies (4D) kan worden verlengd door een time-lapse reeks 3D datasets. De generatie van 4D datasets maakt gedetailleerde meting van cel bewegingen en gedragingen. In lange-termijn time-lapse experimenten is het gebruikelijk om monster beweging waarnemen. Dit kan worden veroorzaakt door kleine onnauwkeurigheden in de hardware controle podium en focale posities. Terwijl....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. 4D time-lapse imaging Experimenten
De instellingen die worden gebruikt voor het overname zal verschillen afhankelijk van de gebruikte apparatuur. Het vermogen van confocale microscopie optisch gedeelte een monster hangt af van een aantal factoren: de golflengte van excitatie, pinhole grootte numerieke apertuur van het objektief, de brekingsindex van het monster en het medium waarin het monster is ingebed. De grootte van de confocale pinhole geselecteerde dikte van het optische gedeelte verzameld bepalen. Een kleinere pinhole een dunnere optische gedeelte vergroten van de z-as resolutie, maar verminderen de hoeveelheid licht opgevangen pr....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In de ontwikkeling van de zebravis, snel spiercellen smelten tot meerkernige vezels vanaf 19 uur na de bevruchting (20 - somiet fase) 13. Om de beweging van kernen en fusie spiercellen we uitgevoerd confocale 4D time-lapse beeldvorming met behulp van een transgene stam die groen fluorescent proteïne (GFP) tot expressie brengt onder controle van het skelet α-actine promoter om alle spier label visualiseren cellen 14 en geïnjecteerd RNA dat codeert voor het rood fluorescerend eiwit mCherry gelabeld m.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ons vermogen om post-processing software gebruiken om monster drift van datasets afkomstig van langere time-lapse microscopie experimenten corrigeren wordt beperkt door een aantal factoren. De mogelijkheid om drift onderscheiden versus migratiestroom van een monster is afhankelijk van de cellulaire merkers gebruikt. Cellulaire merkers die ofwel op grote schaal worden uitgedrukt in een monster of zijn niet betrokken in het vreemdelingenrecht gebeurtenissen tijdens beeldacquisitie bieden de beste bron voor drift correctie.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij willen Gaby Martins en de organisatoren van de EMBO2010 3D Developmental Imaging werkplaats waar dit werk begonnen en alle medewerkers aan de Fiji en ImageJ projecten bedanken.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
Referenties
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
